Name: micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes
Uploaded: 2018-10-22T12:30:00
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Ringraziamo Jessica Hall per la sua preziosa discussione.

1. preparazione di colture cellulari primarie spermatocita insetto per micromanipolazione
<ol><li>Preparazione del vetrino<ol>
<li>Ottenere una lastra di vetro di 75 x 25 mm con un foro circolare di diametro 20 mm tagliato al centro della diapositiva. Nota: Questi sono stati tagliati da un unico foglio di vetro della finestra per essere la dimensione di un vetrino con un foro al centro.</li>
		<li>Eseguire un vetrino coprioggetti 25 mm x 25 mm #1.5 attraverso una fiamma di bruciatore di Bunsen per 2 s.</li>
		<li>Ap...

<ol>
	<li>Chambers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+II.+The+cell+aster:+a+reversible+gelation+phenomenon.">Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon.</a> Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).</li><li>Carlson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+of+the+dividing+neuroblast+of+the+grasshopper,+Chortophaga+viridifasciata.">Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata.</a> Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).</li><li>Nicklas, R. B., Staehly, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+I.+The+mechanics+of+chromosome+attachment+to+the+spindle.">Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle.</a> Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+II.+Induced+reorientation+and+the+experimental+control+of+segregation+in+meiosis.">Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis.</a> Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+3.+Spindle+fiber+tension+and+the+reorientation+of+mal-oriented+chromosomes.">Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).</li><li>Nicklas, R. B., Ward, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+error+correction+in+mitosis:+microtubule+capture,+release,+and+tension.">Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension.</a> Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).</li><li>Li, X., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+forces+control+a+cell-cycle+checkpoint.">Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint.</a> Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+the+force+produced+by+the+mitotic+spindle+in+anaphase.">Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase.</a> Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forces+that+move+chromosomes+in+mitosis.">The forces that move chromosomes in mitosis.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+IV.+Polarized+motions+within+the+spindle+and+models+for+mitosis.">Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis.</a> Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+chromosomes+and+centrosomes+on+spindle+assembly+as+observed+in+living+cells.">The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).</li><li>Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+cut+mitotic+spindles:+clean+cuts+and+stable+microtubules.">Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules.</a> Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes+initiate+spindle+assembly+upon+experimental+dissolution+of+the+nuclear+envelope+in+grasshopper+spermatocytes.">Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+distribution:+experiments+on+cell+hybrids+and+in+vitro.">Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reduction+of+chromosome+number+in+meiosis+is+determined+by+properties+built+into+the+chromosomes.">The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).</li><li>Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulated+bivalents+can+trigger+mini-spindle+formation+in+Drosophilamelanogaster+spermatocyte+cytoplasm.">Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm.</a> Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).</li><li>Forer, A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+autosome+movements+and+of+sex-chromosome+movements+on+sex-chromosome+segregation+in+crane+fly+spermatocytes.">Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes.</a> Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).</li><li>Camenzind, R., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+non-random+chromosome+segregation+in+spermatocytes+of+Gryllotalpa+hexadactyla.+A+micromanipulation+analysis.">The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis.</a> Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).</li><li>Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-segregation+of+sex+chromosomes+in+the+male+black+widow+spider+Latrodectus+mactans+(Araneae,+Theridiidae).">Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae).</a> Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).</li><li>Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+the+amphitelically+attached+univalent+X+chromosome+in+the+spittlebug+Philaenus+spumarius.">Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius.</a> Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).</li><li>Golding, A. E., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype,+sex+determination,+and+meiotic+chromosome+behavior+in+two+pholcid+(Araneomorphae,+Pholcidae)+spiders:+implications+for+karyotype+evolution.">Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution.</a> PLoS One. 6, e24748 (2011).</li><li>Doan, R. N., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+reveals+an+XO-XX+sex+determining+system+in+the+orb-weaving+spider+Neoscona+arabesca+(Walckenaer).">Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer).</a> Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+chromosomes+reveals+that+cohesion+release+during+cell+division+is+gradual+and+does+not+require+tension.">Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension.</a> Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , (2018).</li><li>Ellis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+micromanipulators.">Piezoelectric micromanipulators.</a> Science. 138 (3537), 84-91 (1962).</li><li>Ellis, G. W., Begg, D. A., Zimmerman , . A. M., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation+studies.">Chromosome micromanipulation studies.</a> Mitosis/Cytokinesis. , 155-179 (1981).</li><li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microforge+attachment+for+the+biological+microscope.">A microforge attachment for the biological microscope.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).</li><li>Alsop, G. B., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+continuously+dictate+distribution+of+actin+filaments+and+positioning+of+cell+cleavage+in+grasshopper+spermatocytes.">Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase'+and+cytokinesis+in+the+absence+of+chromosomes.">Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes.</a> Nature. 382, 466-468 (1996).</li></ol>

Con la pratica, muoversi cromosomi nella cellula può diventare una seconda natura. Gli aghi che sono sufficientemente rigida e sufficientemente sottile punta sono difficili da "ottenere l'abilità di" fabbricando, ma questa abilità inoltre viene con la pratica. Gli aghi che sono così belle che deformano quando spostato nell'olio halocarbone non sarà utili per spingere i cromosomi nella cella. Gli aghi che sono così ottuso che loro suggerimenti sono visibili e come grande come 1/3 della larghezza di un cromosoma (o s...

Micromanipolazione ha rivelato parti del meccanismo per un congression di cromosoma, il mandrino checkpoint e movimenti cromosoma anafase. La prima pubblicazione che descrive i risultati degli esperimenti di micromanipolazione era di Robert Chambers1. Chambers utilizzato un micromanipolatore meccanico con un ago di vetro allegata per sondare il citoplasma di un certo numero di diversi tipi di cellule. Purtroppo, i metodi di contrasto che ha permesso la visualizzazione dei cromosomi e molti altri componenti cellulari in cellule viventi non erano disponibili al momento, quindi esperimenti Chambers' non potevano mostrare gli effetti di tali componenti cellulari di riposizionamento. Micromanipulations precoce che ha alterato la posizione di cromosoma utilizzato apparato Chambers a spazzare la fosforila mandrino in cellule anafase, mostrando che tali manipolazioni potrebbero alterare la posizione dei bracci cromosomici in neuroblasti di cavalletta anafase2 . Nicklas e i suoi collaboratori furono i primi a eseguire bene micromanipulations dei cromosomi, stretching i cromosomi3, staccandole dal mandrino e inducendo un riorientamento3,4, stabilizzando una malorientation applicando tensione al cromosomi5,6,7, e misurando le forze prodotte da mandrini in anafase8,9. Altri lavori di laboratorio Nicklas ha mostrato che i granelli citoplasmici potrebbero anche essere manipolato10 e che centrosomi potrebbero essere riposizionati di micromanipolazione11. Micromanipolazione non è solo utile per lo spostamento di cromosomi e altri componenti cellulari. Un ago di micromanipolazione in modo pulito può tagliare attraverso un fuso mitotico in demembranated cellule12 o può essere utilizzato per sciogliere la busta nucleare13. Inoltre, le celle adiacenti possono essere fusi da micromanipolazione14,15.
Con una vasta gamma di interessanti esperimenti che può essere fatto utilizzando micromanipolazione, è a prima vista sorprendente che micromanipolazione esperimenti sono stati condotti dai biologi del cromosoma molto pochi. Una ragione per questa carenza è che divide mitotically cellule coltivate derivate dai tessuti dei vertebrati e sono comunemente usate per studiare i movimenti del cromosoma sono estremamente difficili da micromanipulate. Queste cellule hanno generalmente un citoscheletro corticale che "si mette di mezzo" della micromanipolazione dell'ago e cromosomi o non raggiungibili con l'ago o l'ago macina attraverso la cella, portando a una rottura delle cellule e la morte. Abbiamo e altri sperimentatori che usano micromanipolazione, abbiamo trovato degli artropodi cellule per essere suscettibili di micromanipolazione. Spermatociti artropodi sono facilmente diffondersi sotto uno strato di olio halocarbone e sembrano avere un molto meno robusto citoscheletro corticale sottostante la membrana delle cellule durante la divisione cellulare. Così, testicoli dell'artropodo forniscono una buona fonte di cellule di divisione meiotically (spermatociti) e mitotically per dividere le celle (spermatogoni) con cromosomi facilmente accessibili per micromanipolazione. Una divisione di serie di un spermatocita cavalletta fissata durante una manipolazione ha rivelato che l'ago non penetri mai la membrana delle cellule; la membrana cellulare si deforma intorno all'ago (Nicklas R.B., comunicazione personale). Spermatociti da un certo numero di taxa insetto e ragno sono state micromanipulated con successo, tra cui cavallette, mantidi, mosche della frutta, gru mosche, grilli, spittlebugs, falene, ragni vedova nera, ragni di cantina e orb-tessitura ragni 3,7,17,18,19,20,21,22. Le cellule coltivate, dividendo mitotically dagli insetti possono essere micromanipulated. Ad esempio, i cromosomi in neuroblasti cavalletta in una coltura primaria hanno cromosomi che possono essere prontamente micromanipulated2,23. Abbiamo il sospetto che il disponibile coltivate linee derivate da Drosophila e altri insetti sarà anche micromanipulatable, anche se non abbiamo testato la tecnica con queste cellule. Vi mostreremo come la divisione delle cellule da cavallette e grilli possono essere preparati per una micromanipolazione. Grilli sono facili da ottenere da maggior parte dei negozi di animali in qualsiasi momento dell'anno. Cavallette sono facilmente ottenibili in estate solo a meno che il ricercatore ha accesso ad una colonia di laboratorio, ma le specie utilizzate (spretus moorei) facilmente ha appiattito le cellule e i cromosomi lunghi, facile da manipolare.
Un altro motivo perché micromanipolazione esperimenti sono stati condotti da una piccola manciata di biologi è che micromanipolatori che i cromosomi si muovono bene sono raramente disponibili sul mercato. Abbiamo trovato che un micromanipolatore piezoelettrico controllato joystick controlla il movimento dell'ago senza vibrazioni, drift, o il ritardo tra il movimento del joystick e il movimento dell'ago, ma altri tipi di manipolatori anche con successo possono spingere i cromosomi intorno nella cella. Micromanipolatori progettati da Ellis e Begg25,26 sono ideali per la micromanipolazione dei cromosomi, anche se usano tecnologia precedente. Micromanipolatori piezoelettrici sono attualmente disponibili e comunemente utilizzati in elettrofisiologia; Tuttavia, questi micromanipolatori non sono in genere controllata mediante joystick. Joystick di controllo è la chiave per i lisci movimenti necessari per un successo micromanipolazione, e così un joystick personalizzato deve essere costruito per rendere i micromanipolatori piezoelettrici attualmente disponibili di lavoro per micromanipolazione un cromosoma. I micromanipolatori piezoelettrici controllato joystick che funzionano meglio sono controllo di posizione diretta, in cui il movimento del joystick si traduce direttamente in un movimento dell'ago.
Un micromanipolatore piezoelettrico di nuova concezione può essere costruito da parti disponibili in commercio che possono essere facilmente sostituiti e da alcuni piccoli componenti 3D stampati, e funziona bene per cromosoma micromanipolazione24. Il micromanipolatore non ha sensibilità regolabile, posizionamento manuale grossolana e nessuna vibrazione, deriva o ritardo nel movimento dell'ago e controllo diretto della posizione dell'ago. Gli scienziati possono costruire il micromanipolatore utilizzando istruzioni disponibili online24. Di seguito sono i metodi per la preparazione di una coltura cellulare spermatocita primario e per micromanipulating i cromosomi all'interno delle cellule in quella cultura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">VWR micro cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48366 249</td>
			<td style="width:167px;">25x25 mm, no 1.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>AA44224-KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">KEL-F Oil #10</td>
			<td style="width:71px;">Ohio Valley Specialty Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microdissecting Scissors, Stainless Steel</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3271-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dumont #5 fine foreceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order--call to request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective</td>
			<td style="width:71px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">microforge</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Narashige</td>
			<td style="width:119px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">micromanipulator</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick</td>
			<td style="width:119px;">PCS-6300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes

La micromanipolazione dei cromosomi è stato un metodo essenziale per illuminare il meccanismo per cromosoma congression, il punto di arresto mandrino e anafase cromosoma movimenti ed è stata la chiave per comprendere ciò che controlla i movimenti del cromosoma durante la divisione cellulare. Un biologo esperto può utilizzare un micromanipolatore per scollegare i cromosomi dal mandrino, per riposizionare i cromosomi all'interno della cellula e di applicare forze ai cromosomi utilizzando un ago di vetro piccolo con una punta molto fine. Mentre perturbazioni possono avvenire ai cromosomi utilizzando altri metodi quali l'intrappolamento ottico e altri usi di un laser, fin qui, nessun altro metodo consente il riposizionamento delle componenti cellulari sulla scala di decine o centinaia di micron con poco o nessun danno alla cella .
La selezione e la preparazione delle celle appropriate per la micromanipolazione dei cromosomi, in particolare descrivendo la preparazione di colture primarie di spermatocita cavalletta e Grillo per l'uso in cellule vive imaging e micromanipolazione, sono descritto qui. Inoltre, ci mostra la costruzione di un ago per essere utilizzato per spostare i cromosomi all'interno della cella e l'uso di un micromanipolatore piezoelettrico controllato joystick con un ago di vetro collegato ad esso per riposizionare i cromosomi all'interno della divisione delle cellule. Un risultato di esempio viene illustrato l'utilizzo di un micromanipolatore per staccare un cromosoma da un mandrino in un spermatocita primario e per riposizionare quel cromosoma all'interno della cellula.

Figura 6 Mostra una micromanipolazione campione di 2 spermatociti primari adiacenti cavalletta in diversi esempi dei possibili utilizzi di micromanipolazione. Questo esperimento è stato fatto utilizzando un microscopio invertito, contrasto di fase. 0:00 (i tempi indicati sono in min:s) immagine mostra entrambe le celle prima della manipolazione. Un cromosoma nella cella inferiore viene mostrato sotto tensione applicata dall'ago micromanipolazione (0:05; nero...

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Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

In questo protocollo, descriviamo la selezione e la preparazione delle celle appropriate per micromanipolazione e l'uso di un micromanipolatore piezoelettrico per riposizionare i cromosomi all'interno di quelle cellule.

Micromanipolazione dei cromosomi in insetto spermatociti

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in biologia cellulare, come, quanto è importante la tensione nel soddisfare il checkpoint del mandrino e qual è il ruolo sull'attaccamento del mandrino nel comportamento cromosomico nella miosi? Il principale vantaggio di questa tecnica è che è una tecnica non letale che permette allo sperimentatore di applicare tensione o riposizionare cromosomi in una cellula vivente. Per iniziare, preparare uno scivolo di 75 per 25 millimetri con un foro circolare di 20 millimetri di diametro tagliato fuori dal centro.Quindi, eseguire una copertura di 25 per 25 millimetri numero 1,5 fessura attraverso una fiamma bruciatore bunsen per due secondi. Applicare il grasso sottovuoto attorno al bordo del foro nello scivolo di vetro. Quindi, posizionare il coperchio scivolare sopra il foro e premerlo per formare una tenuta stretta.Capovolgere la diapositiva e riempire bene la dissezione appena creata con olio di alocarbonio. Dopo aver ottenuto alcuni grilli maschi adulti, usa le forbici sezionanti per tagliare attraverso la superficie dorsale parallela al lungo asse dell'addome, direttamente dietro le gemme delle ali. Quindi, spremere delicatamente l'addome per spingere i teste attraverso il taglio nell'esoscheletro.Utilizzando le forcep, posizionare bene i teste isolati nella dissezione. Al microscopio di sezionamento, utilizzare forcep di puntamento fini per dividere i tester in pezzi più piccoli e rimuovere qualsiasi grasso. Quindi, stendere il contenuto dei teste sotto l'olio sulla superficie della fessura del coperchio.Continuare a diffondere il contenuto dei teste fino a quando la porzione di diffusione è appena visibile ad occhio nudo. Se necessario, possono essere utilizzati pozzi di dissezione caricati con olio aggiuntivo. In primo luogo, posizionare l'estremità di un tubo di vetro nella fiamma del bruciatore bunsen.Tenere l'estremità del tubo per creare un angolo di 150 gradi e un'area estesa di tubi di vetro stretti. Rompere il tubo nella regione sottile in modo che la regione sottile che si estende dall'angolo creato in precedenza sia lunga circa 10 millimetri. Utilizzando la microforgia, sciogliere la punta dell'ago di vetro, formando un angolo di 45 gradi tra l'ago e il filo di platino della microforgia.Quindi, allontanare il vetro dal filo spegnendo contemporaneamente il calore. Posizionare la diapositiva preparata in precedenza sul palco di un microscopio a contrasto di fase invertito. Quindi, trova le celle divisorie e centrale nel campo visivo usando l'ingrandimento più basso possibile.Posizionare il microneedle nel supporto dell'ago del micromanipolatore. Quindi, posizionare manualmente il microneedle nel percorso luminoso del microscopio. Mettere a fuoco il microscopio diversi piani focali sopra il piano contenente le celle.Successivamente, utilizzare il controller joystick per riposizionare il microriplesso più volte per trovare l'ombra dell'ago negli assi x e y. Riregolare la posizione dell'ago fino a quando la posizione della punta è visibile, quindi regolare la posizione dell'ago lungo l'asse z fino a quando la punta non è a fuoco. Quindi, rifocalizzarsi sulle cellule e mettere a fuoco il microscopio appena sopra il piano cellulare.Quindi, riregolare la posizione dell'ago in modo che la punta sia a fuoco in questo piano focale. Ripetete questo processo utilizzando l'obiettivo di ingrandimento più elevato e un'impostazione di sensibilità più elevata. Rifocalizzarsi sulle celle e regolarne la posizione, in modo che rimangano al centro del campo visivo.Usa il joystick per controllare il microneedle mentre spinge i cromosomi all'interno della cellula. Assicurarsi che la punta dell'ago rimanga nel piano sopra le cellule. Per spostare il cromosoma, concentrati su un cromosoma vicino alla parte superiore della cellula.Quindi, regolare l'asse z sul joystick per mettere a fuoco la punta dell'ago e spostare l'ago con il joystick in x e y. Posizionare la punta dell'ago direttamente sul cromosoma di interesse e spingerlo nella direzione desiderata. Applicare abbastanza tensione per separare il cromosoma dal mandrino.Infine, posizionare il cromosoma ovunque all'interno della cellula. Utilizzando questo protocollo, è possibile riposizionare, applicare tensione e staccare completamente un cromosoma da un mandrino usando la micromanipolazione. In questo esempio, a due cromosomi manipolati è stato tenuto il contatto con il mandrino per essere continuamente spinto con un ago di micromanipolazione.Una volta padroneggiati, i campioni possono essere preparati per la manipolazione e il micromanipolatore può essere posizionato in 15-20 minuti. Gli esperimenti di micromanipolazione possono richiedere da pochi secondi a diverse ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di manipolare i cromosomi sul lato della cellula più lontano dallo slittamento di copertura.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare il checkpoint del mandrino nelle cavallette e nella mantide religiosa.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

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Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

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Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

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Spaziale e temporale Analisi di attiva ERK nel<em&gt; C. elegans</em&gt; Linea germinale

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

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Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

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