Name: micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes
Uploaded: 2018-10-22T12:30:00
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Agradecemos sua valiosa discussão Jessica Hall.

1. preparação da cultura de pilha de maturação insetos primários para micromanipulação
<ol><li>Preparação de slide<ol>
<li>Obter uma lâmina de vidro de 75 mm x 25 mm com um orifício circular de 20 mm de diâmetro cortado no centro do slide. Nota: Estas foram cortadas de uma única folha de janela de vidro do tamanho de uma lâmina de vidro com um buraco no centro.</li>
		<li>Executar uma lamela de 25 x 25 mm #1.5 através de uma chama de bico de Bunsen 2 s.</li>
		<li>Aplique lubrificante vácuo ao redor ...

<ol>
	<li>Chambers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+II.+The+cell+aster:+a+reversible+gelation+phenomenon.">Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon.</a> Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).</li><li>Carlson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+of+the+dividing+neuroblast+of+the+grasshopper,+Chortophaga+viridifasciata.">Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata.</a> Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).</li><li>Nicklas, R. B., Staehly, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+I.+The+mechanics+of+chromosome+attachment+to+the+spindle.">Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle.</a> Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+II.+Induced+reorientation+and+the+experimental+control+of+segregation+in+meiosis.">Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis.</a> Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+3.+Spindle+fiber+tension+and+the+reorientation+of+mal-oriented+chromosomes.">Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).</li><li>Nicklas, R. B., Ward, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+error+correction+in+mitosis:+microtubule+capture,+release,+and+tension.">Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension.</a> Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).</li><li>Li, X., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+forces+control+a+cell-cycle+checkpoint.">Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint.</a> Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+the+force+produced+by+the+mitotic+spindle+in+anaphase.">Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase.</a> Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forces+that+move+chromosomes+in+mitosis.">The forces that move chromosomes in mitosis.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+IV.+Polarized+motions+within+the+spindle+and+models+for+mitosis.">Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis.</a> Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+chromosomes+and+centrosomes+on+spindle+assembly+as+observed+in+living+cells.">The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).</li><li>Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+cut+mitotic+spindles:+clean+cuts+and+stable+microtubules.">Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules.</a> Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes+initiate+spindle+assembly+upon+experimental+dissolution+of+the+nuclear+envelope+in+grasshopper+spermatocytes.">Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+distribution:+experiments+on+cell+hybrids+and+in+vitro.">Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reduction+of+chromosome+number+in+meiosis+is+determined+by+properties+built+into+the+chromosomes.">The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).</li><li>Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulated+bivalents+can+trigger+mini-spindle+formation+in+Drosophilamelanogaster+spermatocyte+cytoplasm.">Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm.</a> Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).</li><li>Forer, A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+autosome+movements+and+of+sex-chromosome+movements+on+sex-chromosome+segregation+in+crane+fly+spermatocytes.">Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes.</a> Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).</li><li>Camenzind, R., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+non-random+chromosome+segregation+in+spermatocytes+of+Gryllotalpa+hexadactyla.+A+micromanipulation+analysis.">The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis.</a> Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).</li><li>Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-segregation+of+sex+chromosomes+in+the+male+black+widow+spider+Latrodectus+mactans+(Araneae,+Theridiidae).">Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae).</a> Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).</li><li>Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+the+amphitelically+attached+univalent+X+chromosome+in+the+spittlebug+Philaenus+spumarius.">Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius.</a> Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).</li><li>Golding, A. E., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype,+sex+determination,+and+meiotic+chromosome+behavior+in+two+pholcid+(Araneomorphae,+Pholcidae)+spiders:+implications+for+karyotype+evolution.">Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution.</a> PLoS One. 6, e24748 (2011).</li><li>Doan, R. N., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+reveals+an+XO-XX+sex+determining+system+in+the+orb-weaving+spider+Neoscona+arabesca+(Walckenaer).">Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer).</a> Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+chromosomes+reveals+that+cohesion+release+during+cell+division+is+gradual+and+does+not+require+tension.">Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension.</a> Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , (2018).</li><li>Ellis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+micromanipulators.">Piezoelectric micromanipulators.</a> Science. 138 (3537), 84-91 (1962).</li><li>Ellis, G. W., Begg, D. A., Zimmerman , . A. M., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation+studies.">Chromosome micromanipulation studies.</a> Mitosis/Cytokinesis. , 155-179 (1981).</li><li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microforge+attachment+for+the+biological+microscope.">A microforge attachment for the biological microscope.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).</li><li>Alsop, G. B., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+continuously+dictate+distribution+of+actin+filaments+and+positioning+of+cell+cleavage+in+grasshopper+spermatocytes.">Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase'+and+cytokinesis+in+the+absence+of+chromosomes.">Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes.</a> Nature. 382, 466-468 (1996).</li></ol>

Com a prática, a se mover cromossomos na célula pode se tornar segunda natureza. Agulhas que são suficientemente rígida e suficientemente fina com ponta são difíceis de "pegar o jeito de" fabricando, mas essa capacidade também vem com a prática. Agulhas, que são tão finas que eles deformam quando mudei o óleo halocarbono não será útil para empurrar os cromossomos na célula. Agulhas, que são tão blunt que suas dicas são visíveis e tão grande como 1/3 da largura de um cromossoma (ou maior) é muito prov...

Micromanipulação revelou partes do mecanismo de um cromossoma congression, o ponto de verificação do eixo e movimentos de cromossomo anáfase. A mais antiga publicação descrevendo os resultados de experimentos de micromanipulação foi por Robert Chambers1. Câmaras usado um micromanipulador mecânica com uma agulha de vidro anexado para sondar o citoplasma de um número de diferentes tipos de células. Infelizmente, os métodos de contraste que permitiu a visualização dos cromossomos e muitos outros componentes celulares em células vivas não estavam disponíveis na época, para que experimentos de Chambers não podem mostrar os efeitos de reposicionamento tais componentes celulares. Micromanipulations precoce que alterou a posição do cromossomo usado o aparelho de câmaras para varrer a midzone do eixo nas células anáfase, mostrando que tais manipulações podem alterar a posição dos braços do cromossoma em neuroblastos de gafanhoto anáfase2 . Nicklas e seus colaboradores foram os primeiros a realizar bem micromanipulations de cromossomos, esticando os cromossomos3, desanexando-os do eixo e induzir a uma reorientação3,4, estabilizando uma malorientation, aplicando a tensão ao cromossomos5,6,7e medindo as forças produzidas por eixos em anáfase8,9. Outros trabalhos por Nicklas laboratório mostraram que os grânulos citoplasmáticos também podem ser manipulado10 e que podem ser reposicionadas centrossomas micromanipulação11. Micromanipulação não é apenas útil para mover cromossomos e outros componentes celulares. Uma agulha de micromanipulação limpa pode cortar um fuso mitótico em células de demembranated12 , ou pode ser usada para dissolver o envelope nuclear13. Além disso, células adjacentes podem ser fundidas por micromanipulação14,15.
Com uma grande variedade de experiências interessantes que pode ser feito usando micromanipulação, é à primeira vista surpreendente que experimentos de micromanipulação tem sido feitos por muito poucos biólogos de cromossomo. Uma razão para esta deficiência é que mitotically-divisão de culturas de células que são derivadas de tecidos de vertebrados e são comumente usadas para estudar os movimentos do cromossomo são extremamente difíceis de micromanipulate. Estas células de cultura de tecido geralmente têm um citoesqueleto cortical que "fica no caminho", da micromanipulação de agulha e cromossomos também não podem ser alcançados pela agulha ou a agulha mói através da célula, levando a uma ruptura da célula e a morte. Nós e outros experimentadores que usam micromanipulação, encontraram células artrópodes para ser passível de micromanipulação. Artrópodes espermatócitos espalham-se facilmente sob uma camada de óleo halocarbono e parecem ter um muito menos robusto citoesqueleto cortical subjacente da membrana celular durante a divisão celular. Assim, os testículos de artrópodes fornecem uma boa fonte de meiotically-divisão de células (espermatócitos) e mitotically-divisão de células (espermatogónias) com cromossomos facilmente acessíveis para micromanipulação. Um seccionamento serial de uma maturação de gafanhoto fixada durante uma manipulação revelou que a agulha não penetra a membrana celular; a membrana celular deforma ao redor da agulha (Nicklas R.B., comunicação pessoal). Espermatócitos de vários táxons de insetos e aranhas têm sido micromanipulated com sucesso, incluindo gafanhotos, mantids orando, moscas de fruta, guindaste moscas, grilos, spittlebugs, traças, aranhas viúva-negra, aranhas adega e aranhas orb-tecendo 3,7,17,18,19,20,21,22. Cultas, mitotically-divisão de células de insetos podem ser micromanipulated. Por exemplo, os cromossomos em neuroblastos de gafanhoto numa cultura primária têm cromossomos que podem ser prontamente micromanipulated2,23. Suspeitamos que o disponível cultivadas linhas derivadas de Drosophila e outros insetos também será micromanipulatable, embora nós não testamos a técnica com essas células. Vamos mostrar como dividir células de gafanhotos e grilos pode estar preparado para uma micromanipulação. Grilos são fáceis de obter da maioria das lojas de animais em qualquer época do ano. Gafanhotos só são facilmente obteníveis no verão, a menos que o pesquisador tem acesso a uma colônia de laboratório, mas a espécie utilizada (Melanoplus sanguinipes) tem aplainado facilmente células e cromossomos longos, fácil de manipular.
Outra razão por que os experimentos de micromanipulação tem sido feitos por um pequeno punhado de biólogos é que Micromanipuladores que movem os cromossomos bem estão raramente disponíveis no mercado. Descobrimos que um micromanipulador piezoelétrico controlado por joystick controla o movimento da agulha sem vibração, deriva, ou desfasamento entre o movimento do joystick e o movimento da agulha, mas outros tipos de manipuladores também com êxito podem empurrar cromossomos ao redor na célula. Os Micromanipuladores desenhados por Ellis e Begg25,26 são ideais para a micromanipulação de cromossomos, embora eles usam a tecnologia mais antiga. Micromanipuladores piezoelétricos são atualmente disponíveis e comumente utilizada em eletrofisiologia; no entanto, estes Micromanipuladores não são normalmente controlado por joystick. Controle de joystick é chave para os movimentos suaves necessários para uma bem sucedida micromanipulação, e então um joystick personalizado deve ser construído a funcione os Micromanipuladores piezoelétricos atualmente disponíveis para micromanipulação um cromossomo. Os manche-controlou piezoelétricos Micromanipuladores que funcionam melhor tem controle direto da posição, na qual o movimento do joystick traduz diretamente a um movimento de agulha.
Um micromanipulador piezoelétrico recém-projetado pode ser construído de peças comercialmente disponíveis que podem ser facilmente substituídas e de alguns pequenos componentes impressos em 3D, e funciona bem para cromossomo micromanipulação24. O micromanipulador sensibilidade ajustável, posicionamento manual grosseiros e não tem vibração, deriva ou atraso no movimento da agulha e controle direto da posição da agulha. Os cientistas podem construir o micromanipulador usando instruções disponíveis on-line24. Abaixo estão os métodos para a preparação de uma cultura de células primárias de maturação e para micromanipulating os cromossomos dentro das células em cultura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">VWR micro cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48366 249</td>
			<td style="width:167px;">25x25 mm, no 1.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>AA44224-KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">KEL-F Oil #10</td>
			<td style="width:71px;">Ohio Valley Specialty Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microdissecting Scissors, Stainless Steel</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3271-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dumont #5 fine foreceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order--call to request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective</td>
			<td style="width:71px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">microforge</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Narashige</td>
			<td style="width:119px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">micromanipulator</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick</td>
			<td style="width:119px;">PCS-6300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes

A micromanipulação de cromossomos tem sido um método essencial para iluminar o mecanismo para congression do cromossomo, o ponto de verificação do eixo e movimentos de cromossomo anáfase e tem sido a chave para entender o que controla os movimentos do cromossomo durante a divisão celular. Um biólogo especializado pode usar um micromanipulador para desanexar cromossomos do eixo, para reposicionar cromossomos dentro da célula e para aplicar forças aos cromossomas usando uma agulha de vidro pequeno com uma ponta muito fina. Enquanto que as perturbações podem ser feitas para cromossomos usando outros métodos, como armadilhas ópticas e outros usos de um laser, até à data, nenhum outro método permite o reposicionamento dos componentes celulares na escala de dezenas a centenas de micra, com pouco ou nenhum dano à célula .
A seleção e preparação de células adequadas para a micromanipulação de cromossomos, especificamente, descrevendo a preparação do gafanhoto e grilo culturas primárias de maturação para o uso em imagem latente da viver-pilha e micromanipulação, são descritos aqui. Além disso, mostramos a construção de uma agulha a ser usado para mover-se com uma agulha de vidro acompanhada de cromossomos dentro da célula e o uso de um micromanipulador piezoelétrico controlado por joystick para reposicionar os cromossomos dentro das células de divisão. Um resultado de exemplo mostra o uso de um micromanipulador para desanexar um cromossomo de um eixo em uma maturação primário e reposicionar esse cromossomo dentro da célula.

A Figura 6 mostra uma micromanipulação de amostra de 2 espermatócitos primários de gafanhoto adjacentes em vários exemplos dos possíveis usos de micromanipulação. Esta experiência foi feita usando um microscópio de contraste de fase invertida,. A 0:00 (tempos mostrados estão em min:s) imagem mostra ambas as células antes da manipulação. Um cromossomo na célula inferior é mostrado sob tensão aplicada pela agulha micromanipulação (0:05; preto...

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Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

Neste protocolo, descrevemos a seleção e a preparação de células adequadas para micromanipulação e o uso de um micromanipulador piezoelétrico para reposicionar os cromossomos dentro dessas células.

Micromanipulação de cromossomos em espermatócitos insetos

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na biologia celular, como, como, quão importante é a tensão na satisfação do ponto de verificação do eixo, e qual é o papel no apego do eixo no comportamento do cromossomo na miose? A principal vantagem dessa técnica é que é uma técnica não letal que permite ao experimentador aplicar tensão ou reposicionar cromossomos em uma célula viva. Para começar, prepare um slide de 75 por 25 milímetros com um orifício circular de 20 milímetros de diâmetro cortado do centro.Em seguida, execute uma tampa de 25 por 25 milímetros número 1,5 cortada através de uma chama de bico bunsen por dois segundos. Aplique graxa de vácuo ao redor da borda do orifício na lâmina de vidro. Em seguida, coloque a tampa escorregando sobre o orifício e pressione-a para formar uma vedação apertada.Vire o slide e encha o poço de dissecção recém-criado com óleo de halocarbono. Depois de obter alguns grilos machos adultos, use a tesoura dissecando para cortar a superfície dorsal paralela ao longo eixo do abdômen, diretamente atrás dos botões de asa. Em seguida, aperte suavemente o abdômen para empurrar os testículos através do corte no exoesqueleto.Usando fórceps, coloque bem os testículos isolados na dissecação. Sob o microscópio dissecando, use fórceps finos para dividir os testículos em pedaços menores e remover qualquer gordura. Em seguida, espalhe o conteúdo dos testículos sob o óleo na superfície da fenda da tampa.Continue a espalhar o conteúdo dos testículos até que a porção de propagação mal seja visível a olho nu. Podem ser utilizados poços adicionais de dissecção carregados de óleo, se necessário. Primeiro, coloque a ponta de um tubo de vidro na chama do queimador bunsen.Segure a extremidade da tubulação para criar um ângulo de 150 graus e uma área estendida de tubos de vidro estreitos. Quebre o tubo na região fina de modo que a região fina que se estende do ângulo previamente criado tem aproximadamente 10 milímetros de comprimento. Usando o microforge, derreta a ponta da agulha de vidro, formando um ângulo de 45 graus entre a agulha e o fio de platina do microforge.Em seguida, puxe o vidro para longe do fio enquanto simultaneamente desliga o calor. Coloque o slide previamente preparado no estágio de um microscópio de contraste de fase invertido. Em seguida, encontre as células divisórias e centralize-as no campo de visão usando a menor ampliação possível.Coloque a microagulha no suporte de agulha do micromanipulador. Em seguida, posicione manualmente o microaícedo no caminho de luz do microscópio. Concentre o microscópio de vários planos focais acima do plano contendo as células.Em seguida, use o controlador de joystick para reposicionar o microagulha várias vezes para encontrar a sombra da agulha nos eixos x e y. Reajuste a posição da agulha até que a posição da ponta esteja visível, em seguida, ajuste a posição da agulha ao longo do eixo z até que a ponta esteja em foco. Em seguida, reconcentrar-se nas células, e concentrar o microscópio logo acima do plano celular.Em seguida, reajuste a posição da agulha para que a ponta esteja em foco neste plano focal. Repita este processo usando o objetivo de ampliação mais elevado e uma configuração de sensibilidade mais elevada. Refoce-se nas células e ajuste sua posição, para que permaneçam no centro do campo de visão.Use o joystick para controlar o microaícedo enquanto empurra cromossomos dentro da célula. Certifique-se de que a ponta da agulha permanece no plano acima das células. Para mover o cromossomo, concentre-se em um cromossomo perto do topo da célula.Em seguida, ajuste o eixo z no joystick para colocar a ponta da agulha em foco, e mova a agulha com o joystick em x e y. Coloque a ponta da agulha diretamente sobre o cromossomo de interesse, e empurre-a na direção desejada. Aplique tensão suficiente para separar o cromossomo do fuso.Finalmente, coloque o cromossomo em qualquer lugar dentro da célula. Usando este protocolo, é possível reposicionar, aplicar tensão e desprender completamente um cromossomo de um fuso usando micromanipulação. Neste exemplo, dois cromossomos manipulados foram impedidos de recolocar-se ao fuso por ser continuamente cutucado com uma agulha de micromanipulação.Uma vez dominadas, as amostras podem ser preparadas para manipulação, e o micromanipulador pode ser posicionado em 15 a 20 minutos. Experimentos de micromanipulação podem levar de alguns segundos a várias horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manipular cromossomos na lateral da célula mais distante do deslizamento da tampa.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia celular explorarem o ponto de verificação do fuso em gafanhotos e louva-a-deus.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Espaciais e temporais Análise do Active ERK na<em&gt; C. elegans</em&gt; germinativa

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Modelo de impacto cortical controlado da lesão cerebral do rato com transplantação terapêutica de células neurais pluripotentes induzidas humanas da pilha de haste

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...