Name: micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes
Uploaded: 2018-10-22T12:30:00
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Damos las gracias por su valiosa discusión Jessica Hall.

1. preparación del cultivo celular de espermatocito primario de insectos para micromanipulación
<ol><li>Preparación de portaobjetos<ol>
<li>Obtener un portaobjetos de vidrio 75 x 25 mm con un agujero circular de 20 mm de diámetro, en el centro de la diapositiva. Nota: Estos fueron cortados de una sola hoja de vidrio de la ventana a ser del tamaño de un portaobjetos de vidrio con un orificio en el centro.</li>
		<li>Ejecutar un cubreobjetos 25 x 25 mm #1.5 a través de una llama de mechero de Bunsen para 2 s.</l...

<ol>
	<li>Chambers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+II.+The+cell+aster:+a+reversible+gelation+phenomenon.">Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon.</a> Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).</li><li>Carlson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+of+the+dividing+neuroblast+of+the+grasshopper,+Chortophaga+viridifasciata.">Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata.</a> Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).</li><li>Nicklas, R. B., Staehly, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+I.+The+mechanics+of+chromosome+attachment+to+the+spindle.">Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle.</a> Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+II.+Induced+reorientation+and+the+experimental+control+of+segregation+in+meiosis.">Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis.</a> Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+3.+Spindle+fiber+tension+and+the+reorientation+of+mal-oriented+chromosomes.">Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).</li><li>Nicklas, R. B., Ward, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+error+correction+in+mitosis:+microtubule+capture,+release,+and+tension.">Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension.</a> Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).</li><li>Li, X., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+forces+control+a+cell-cycle+checkpoint.">Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint.</a> Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+the+force+produced+by+the+mitotic+spindle+in+anaphase.">Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase.</a> Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forces+that+move+chromosomes+in+mitosis.">The forces that move chromosomes in mitosis.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+IV.+Polarized+motions+within+the+spindle+and+models+for+mitosis.">Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis.</a> Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+chromosomes+and+centrosomes+on+spindle+assembly+as+observed+in+living+cells.">The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).</li><li>Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+cut+mitotic+spindles:+clean+cuts+and+stable+microtubules.">Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules.</a> Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes+initiate+spindle+assembly+upon+experimental+dissolution+of+the+nuclear+envelope+in+grasshopper+spermatocytes.">Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+distribution:+experiments+on+cell+hybrids+and+in+vitro.">Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reduction+of+chromosome+number+in+meiosis+is+determined+by+properties+built+into+the+chromosomes.">The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).</li><li>Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulated+bivalents+can+trigger+mini-spindle+formation+in+Drosophilamelanogaster+spermatocyte+cytoplasm.">Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm.</a> Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).</li><li>Forer, A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+autosome+movements+and+of+sex-chromosome+movements+on+sex-chromosome+segregation+in+crane+fly+spermatocytes.">Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes.</a> Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).</li><li>Camenzind, R., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+non-random+chromosome+segregation+in+spermatocytes+of+Gryllotalpa+hexadactyla.+A+micromanipulation+analysis.">The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis.</a> Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).</li><li>Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-segregation+of+sex+chromosomes+in+the+male+black+widow+spider+Latrodectus+mactans+(Araneae,+Theridiidae).">Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae).</a> Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).</li><li>Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+the+amphitelically+attached+univalent+X+chromosome+in+the+spittlebug+Philaenus+spumarius.">Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius.</a> Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).</li><li>Golding, A. E., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype,+sex+determination,+and+meiotic+chromosome+behavior+in+two+pholcid+(Araneomorphae,+Pholcidae)+spiders:+implications+for+karyotype+evolution.">Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution.</a> PLoS One. 6, e24748 (2011).</li><li>Doan, R. N., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+reveals+an+XO-XX+sex+determining+system+in+the+orb-weaving+spider+Neoscona+arabesca+(Walckenaer).">Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer).</a> Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+chromosomes+reveals+that+cohesion+release+during+cell+division+is+gradual+and+does+not+require+tension.">Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension.</a> Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , (2018).</li><li>Ellis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+micromanipulators.">Piezoelectric micromanipulators.</a> Science. 138 (3537), 84-91 (1962).</li><li>Ellis, G. W., Begg, D. A., Zimmerman , . A. M., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation+studies.">Chromosome micromanipulation studies.</a> Mitosis/Cytokinesis. , 155-179 (1981).</li><li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microforge+attachment+for+the+biological+microscope.">A microforge attachment for the biological microscope.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).</li><li>Alsop, G. B., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+continuously+dictate+distribution+of+actin+filaments+and+positioning+of+cell+cleavage+in+grasshopper+spermatocytes.">Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase'+and+cytokinesis+in+the+absence+of+chromosomes.">Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes.</a> Nature. 382, 466-468 (1996).</li></ol>

Con la práctica, moviendo los cromosomas en la célula puede convertirse en segunda naturaleza. Agujas que son lo suficientemente rígidos y suficientemente delgada con punta son difíciles "conseguir la habilidad de" fabricación, pero esta capacidad también viene con la práctica. Las agujas que son tan finas que se deforman cuando se movió en el aceite de halocarburos no será útiles para empujar los cromosomas en la célula. Las agujas que son tan embotan que sus consejos son visibles y tan grandes como 1/3 de la...

Micromanipulación ha revelado las partes del mecanismo para un cromosoma congression, puesto de control de eje y movimientos de cromosoma anafase. La primera publicación que describe los resultados de experimentos de micromanipulación era por Robert Chambers1. Cámaras utilizan un micromanipulador mecánica con una aguja de vidrio adjunta para sondear el citoplasma de un número de diferentes tipos de células. Por desgracia, métodos de contraste que permitieron la visualización de los cromosomas y de muchos otros componentes celulares en las células vivas no estaban disponibles en el momento, para que experimentos de cámaras no pueden mostrar los efectos de reubicar estos componentes celulares. Principios micromanipulations que alteración la posición del cromosoma el aparato de cámaras usado para barrer el midzone del huso en células de la anafase, mostrando que tales manipulaciones podrían alterar la posición de los brazos del cromosoma en neuroblastos de saltamontes de anafase2 . Nicklas y sus colaboradores fueron los primeros en realizar finos micromanipulations de cromosomas, estirando los cromosomas3, separarlas del husillo e induciendo una reorientación3,4, estabilizar una malorientation aplicación de tensión a los cromosomas5,6,7, y midiendo las fuerzas producidas por ejes en anafase8,9. Otro trabajo en el laboratorio de Nicklas demostró que los gránulos citoplásmicos también podrían ser manipulado10 y que los centrosomas podrían cambiarse por micromanipulación11. Micromanipulación no es sólo útil para mover los cromosomas y otros componentes celulares. Una aguja de micromanipulación puede cortar limpiamente a través de un huso mitótico en las células de demembranated12 o se puede utilizar para disolver el sobre nuclear13. Además, se pueden fusionar células adyacentes por micromanipulación14,15.
Con una amplia variedad de experimentos interesantes que pueden hacerse mediante micromanipulación, sorprende a primera vista que se han realizado experimentos de micromanipulación por muy pocos biólogos de cromosoma. Una de las razones para esta deficiencia es que las células cultivadas se dividen mitotically que se derivan de los tejidos vertebrados y se utilizan para estudiar los movimientos del cromosoma son extremadamente difíciles de micromanipulate. Estas células de cultivo de tejidos en general tienen un citoesqueleto cortical que "se pone en el camino" de la micromanipulación de la aguja y los cromosomas ya no se puede llegar por la aguja o muele la aguja a través de la célula, conduciendo a una ruptura de la célula y la muerte. Nos y otros experimentadores que usan micromanipulación, hemos encontrado células artrópodas para ser susceptibles de micromanipulación. Espermatocitos de artrópodos se extienden fácilmente bajo una capa de aceite de halocarburos y parecen tener un mucho menos robusto citoesqueleto cortical subyacente a la membrana de la célula durante la división celular. Así, los testículos artrópodos proporcionan una buena fuente de células dividirse meiotically (espermatocitos) y mitotically dividirse las células (espermatogonios) con cromosomas fácilmente accesibles para la micromanipulación. Un seccionamiento serial de un espermatocito de saltamontes fijado durante una manipulación reveló que la aguja no penetra la membrana de la célula; la membrana de la célula se deforma alrededor de la aguja (Nicklas R.B., comunicación personal). Espermatocitos de un número de taxones de insectos y arañas han estado micromanipulated con éxito, incluyendo saltamontes, orando Mantis, moscas de la fruta, moscas grúa, grillos, spittlebugs, polillas, arañas viuda negra, arañas del sótano y las arañas orbe-que teje 3,7,17,18,19,20,21,22. Las células cultivadas, mitotically dividirse de insectos pueden ser micromanipulated. Por ejemplo, los cromosomas en neuroblastos saltamontes en un cultivo primario tienen cromosomas que pueden ser fácilmente micromanipulated2,23. Sospechamos que el cultivado líneas derivadas de Drosophila y otros insectos también se micromanipulatable, aunque no hemos probado la técnica con estas células. Vamos a mostrar cómo dividir celdas de saltamontes y grillos se puede preparar para una micromanipulación. Grillos son fáciles de obtener de la mayoría de las tiendas para mascotas en cualquier momento del año. Saltamontes son fácilmente obtenibles en el verano a menos que el investigador tiene acceso a una colonia de laboratorio, pero la especie utilizada (Melanoplus sanguinipes) ha aplanado fácilmente las células y los cromosomas largos, fácil de manipular.
Otra razón por qué se han realizado experimentos de micromanipulación por un puñado de biólogos es que micromanipuladores que mueven los cromosomas bien están raramente disponibles en el mercado. Hemos encontrado que un micromanipulador piezoeléctrico controlado por joystick controla el movimiento de la aguja sin vibración, deriva o desfase entre el movimiento de la palanca de mando y el movimiento de la aguja, pero otros tipos de manipuladores con éxito pueden empujar los cromosomas alrededor de la célula. Los micromanipuladores diseñados por Ellis y Begg25,26 son ideales para la micromanipulación de los cromosomas, aunque utilizan tecnología más antigua. Micromanipuladores piezoeléctricos están actualmente disponibles y utilizados en electrofisiología; sin embargo, estos micromanipuladores no son normalmente controlado por joystick. Control de joystick es clave para los movimientos requeridos para un exitoso micromanipulación, y un joystick personalizado debe ser construido de tal manera para trabajar los micromanipuladores piezoeléctricos actualmente disponibles para una micromanipulación de cromosoma. Los micromanipuladores piezoeléctricos controlado por joystick que mejor funcionan tienen control directo de posición, en que el movimiento de la palanca de mando se traduce directamente en un movimiento de la aguja.
Un micromanipulador piezoeléctrico nuevo diseño puede construirse de piezas comercialmente disponibles que pueden ser reemplazados fácilmente y de algunos pequeños componentes impresos 3D, y funciona bien para cromosoma micromanipulación24. El micromanipulador sensibilidad ajustable, posicionamiento manual gruesa y no tiene vibración, deriva o retraso en el movimiento de la aguja y el control directo de la posición de la aguja. Los científicos pueden construir el instrumental quirúrgico con instrucciones disponibles en línea24. A continuación se presentan los métodos para la preparación de un cultivo celular de espermatocito primario y micromanipulating los cromosomas dentro de las células en esa cultura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">VWR micro cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48366 249</td>
			<td style="width:167px;">25x25 mm, no 1.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>AA44224-KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">KEL-F Oil #10</td>
			<td style="width:71px;">Ohio Valley Specialty Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microdissecting Scissors, Stainless Steel</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3271-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dumont #5 fine foreceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order--call to request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective</td>
			<td style="width:71px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">microforge</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Narashige</td>
			<td style="width:119px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">micromanipulator</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick</td>
			<td style="width:119px;">PCS-6300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes

Ha sido un método esencial para iluminar el mecanismo para cromosoma congression, el puesto de control de huso y los movimientos de cromosoma anafase la micromanipulación de los cromosomas y ha sido clave para entender lo que controla movimientos del cromosoma durante División de célula. Un biólogo experto puede utilizar un micromanipulador para separar los cromosomas del eje, para volver a colocar los cromosomas dentro de la célula y para aplicar fuerzas a los cromosomas con una aguja de pequeño de vidrio con una punta muy fina. Mientras que las perturbaciones se pueden hacer a los cromosomas utilizando otros métodos como las trampas ópticas y otros usos de un láser, hasta la fecha, ningún otro método permite la reposición de componentes celulares en la escala de decenas a cientos de micras con poco a ningún daño a la célula .
La selección y preparación de las células apropiadas para la micromanipulación de los cromosomas, específicamente describiendo la preparación de saltamontes y grillo espermatocito primario para el uso en proyección de imagen de células vivas y micromanipulación, son se describe aquí. Además, mostramos la construcción de una aguja para utilizarse para mover los cromosomas en la célula y el uso de un micromanipulador piezoeléctrico controlado por joystick con una aguja de vidrio para reposicionar los cromosomas dentro de las células divisorias. Un resultado de ejemplo muestra el uso de un micromanipulador para separar un cromosoma de un eje en un espermatocito primario y para volver a colocar ese cromosoma dentro de la célula.

La figura 6 muestra una micromanipulación de muestra de 2 espermatocitos primarios adyacentes saltamontes en varios ejemplos de los posibles usos de micromanipulación. Este experimento se realizó usando un microscopio de contraste de fases invertido,. El 0:00 (las horas se muestran en min:s) la imagen muestra las células antes de la manipulación. Un cromosoma en la célula de la parte inferior se muestra bajo tensión aplicada por la aguja de micromanipu...

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Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

En este protocolo, se describen la selección y preparación de células apropiadas para la micromanipulación y el uso de un micromanipulador piezoeléctrico para volver a colocar los cromosomas dentro de las células.

Micromanipulación de los cromosomas de espermatocitos de insectos

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología celular, como, ¿qué importancia es la tensión para satisfacer el punto de control del husillo y cuál es el papel en la fijación del husillo en el comportamiento cromosómica en la miosis? La principal ventaja de esta técnica es que es una técnica no letal que permite al experimentador aplicar tensión o reposicionar cromosomas en una célula viva. Para empezar, prepare un portaobjetos de 75 por 25 milímetros con un agujero circular de 20 milímetros de diámetro cortado fuera del centro.Luego, ejecuta una cubierta de 25 por 25 milímetros número 1.5 a través de una llama de quemador de bunsen durante dos segundos. Aplique grasa al vacío alrededor del borde del orificio en el portaobjetos de vidrio. A continuación, coloque el resbalón de la cubierta sobre el orificio y presiónelo para formar un sello hermético.Da la vuelta a la diapositiva y rellena el pozo de disección recién creado con aceite de halocarbono. Después de obtener algunos grillos machos adultos, utilice tijeras diseccionantes para cortar a través de la superficie dorsal paralela al eje largo del abdomen, directamente detrás de los cogollos de las alas. Luego, apriete suavemente el abdomen para empujar los testículos a través del corte en el exoesqueleto.Usando fórceps, coloque los testículos aislados en el pozo de disección. Bajo el microscopio de disección, utilice fórceps puntiadores finos para dividir los testículos en trozos más pequeños y eliminar cualquier grasa. A continuación, extienda el contenido de los testículos debajo del aceite en la superficie de la abertura de la cubierta.Continúe extendiendo el contenido de los testículos hasta que la porción de propagación apenas sea visible a simple vista. Si es necesario, se pueden utilizar pozos de disección adicionales cargados de aceite. En primer lugar, coloque el extremo de un tubo de vidrio en la llama del quemador bunsen.Sostenga el extremo del tubo para crear un ángulo de 150 grados y un área extendida de tubos de vidrio estrechos. Romper el tubo en la región delgada para que la región delgada que se extiende desde el ángulo creado anteriormente sea de aproximadamente 10 milímetros de largo. Usando el microforge, derrita la punta de la aguja de vidrio, formando un ángulo de 45 grados entre la aguja y el alambre de platino del microforja.A continuación, tire del vidrio lejos del cable mientras apaga simultáneamente el calor. Coloque la diapositiva previamente preparada en el escenario de un microscopio de contraste de fase invertido. A continuación, busque las celdas divisorias y centrarlas en el campo de visión utilizando la ampliación más baja posible.Coloque el microneedle en el soporte de la aguja del micromaniprógrafo. A continuación, coloque manualmente el microaquí en la trayectoria de luz del microscopio. Enfoque el microscopio varios planos focales por encima del plano que contiene las células.A continuación, utilice el controlador de joystick para cambiar la posición del micronúleo varias veces para encontrar la sombra de la aguja en los ejes x e y. Reajuste la posición de la aguja hasta que la posición de la punta sea visible, luego, ajuste la posición de la aguja a lo largo del eje z hasta que la punta esté enfocada. A continuación, vuelva a enfocarse en las células y enfoque el microscopio justo encima del plano celular.A continuación, reajuste la posición de la aguja para que la punta esté enfocada en este plano focal. Repita este proceso utilizando el objetivo de aumento más alto y un ajuste de mayor sensibilidad. Reenfoque en las celdas y ajuste su posición, para que permanezcan en el centro del campo de visión.Utilice el joystick para controlar el microneedle mientras empuja los cromosomas dentro de la célula. Asegúrese de que la punta de la aguja permanece en el plano por encima de las células. Para mover el cromosoma, concéntrese en un cromosoma cerca de la parte superior de la célula.A continuación, ajuste el eje z en el joystick para enfocar la punta de la aguja y mueva la aguja con el joystick en x e y. Coloque la punta de la aguja directamente sobre el cromosoma de interés y empújela en la dirección deseada. Aplique suficiente tensión para separar el cromosoma del husillo.Finalmente, coloque el cromosoma en cualquier lugar dentro de la célula. Usando este protocolo, es posible reposicionar, aplicar tensión y separar completamente un cromosoma de un husillo usando micromanipulación. En este ejemplo, se impidió que dos cromosomas manipulados se reconocieran al husillo al ser continuamente empujados con una aguja de micromanipulación.Una vez masterizadas, las muestras se pueden preparar para la manipulación, y el micromanipulador se puede colocar en 15 a 20 minutos. Los experimentos de micromanipulación pueden tardar entre unos segundos y varias horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular cromosomas en el lado de la célula más alejados del resbalón de la cubierta.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran el punto de control del husillo en saltamontes y rezando mantis.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo<em&gt; C. elegans</em&gt; línea germinal

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Modelo de impacto cortical controlado de lesión cerebral de ratón con trasplante terapéutico de células neuronales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...