Name: micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes
Uploaded: 2018-10-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes at JoVE.com

Vi tackar Jessica Hall för hennes värdefulla diskussion.

1. beredning av primära insekt Spermatocyte cellkultur för mikromanipulation
<ol><li>Bild förberedelse<ol>
<li>Erhålla en 75 x 25 mm glasskiva med ett 20 mm diameter cirkulärt hål klippa ut i mitten av bilden. Obs: Dessa sänktes från ett enstaka pappersark fönsterglas till storleken av en glasskiva med ett hål i mitten.</li>
		<li>Kör en 25 x 25 mm #1.5 täckglas genom en Bunsen-brännare flamma för 2 s.</li>
		<li>Vakuum smörj runt kanten av hålet i glasskiva</li>
		<li>Placera täckglaset på hålet ...

<ol>
	<li>Chambers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+II.+The+cell+aster:+a+reversible+gelation+phenomenon.">Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon.</a> Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).</li><li>Carlson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+of+the+dividing+neuroblast+of+the+grasshopper,+Chortophaga+viridifasciata.">Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata.</a> Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).</li><li>Nicklas, R. B., Staehly, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+I.+The+mechanics+of+chromosome+attachment+to+the+spindle.">Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle.</a> Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+II.+Induced+reorientation+and+the+experimental+control+of+segregation+in+meiosis.">Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis.</a> Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+3.+Spindle+fiber+tension+and+the+reorientation+of+mal-oriented+chromosomes.">Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).</li><li>Nicklas, R. B., Ward, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+error+correction+in+mitosis:+microtubule+capture,+release,+and+tension.">Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension.</a> Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).</li><li>Li, X., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+forces+control+a+cell-cycle+checkpoint.">Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint.</a> Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+the+force+produced+by+the+mitotic+spindle+in+anaphase.">Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase.</a> Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forces+that+move+chromosomes+in+mitosis.">The forces that move chromosomes in mitosis.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+IV.+Polarized+motions+within+the+spindle+and+models+for+mitosis.">Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis.</a> Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+chromosomes+and+centrosomes+on+spindle+assembly+as+observed+in+living+cells.">The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).</li><li>Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+cut+mitotic+spindles:+clean+cuts+and+stable+microtubules.">Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules.</a> Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes+initiate+spindle+assembly+upon+experimental+dissolution+of+the+nuclear+envelope+in+grasshopper+spermatocytes.">Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+distribution:+experiments+on+cell+hybrids+and+in+vitro.">Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reduction+of+chromosome+number+in+meiosis+is+determined+by+properties+built+into+the+chromosomes.">The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).</li><li>Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulated+bivalents+can+trigger+mini-spindle+formation+in+Drosophilamelanogaster+spermatocyte+cytoplasm.">Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm.</a> Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).</li><li>Forer, A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+autosome+movements+and+of+sex-chromosome+movements+on+sex-chromosome+segregation+in+crane+fly+spermatocytes.">Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes.</a> Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).</li><li>Camenzind, R., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+non-random+chromosome+segregation+in+spermatocytes+of+Gryllotalpa+hexadactyla.+A+micromanipulation+analysis.">The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis.</a> Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).</li><li>Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-segregation+of+sex+chromosomes+in+the+male+black+widow+spider+Latrodectus+mactans+(Araneae,+Theridiidae).">Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae).</a> Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).</li><li>Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+the+amphitelically+attached+univalent+X+chromosome+in+the+spittlebug+Philaenus+spumarius.">Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius.</a> Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).</li><li>Golding, A. E., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype,+sex+determination,+and+meiotic+chromosome+behavior+in+two+pholcid+(Araneomorphae,+Pholcidae)+spiders:+implications+for+karyotype+evolution.">Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution.</a> PLoS One. 6, e24748 (2011).</li><li>Doan, R. N., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+reveals+an+XO-XX+sex+determining+system+in+the+orb-weaving+spider+Neoscona+arabesca+(Walckenaer).">Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer).</a> Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+chromosomes+reveals+that+cohesion+release+during+cell+division+is+gradual+and+does+not+require+tension.">Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension.</a> Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , (2018).</li><li>Ellis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+micromanipulators.">Piezoelectric micromanipulators.</a> Science. 138 (3537), 84-91 (1962).</li><li>Ellis, G. W., Begg, D. A., Zimmerman , . A. M., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation+studies.">Chromosome micromanipulation studies.</a> Mitosis/Cytokinesis. , 155-179 (1981).</li><li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microforge+attachment+for+the+biological+microscope.">A microforge attachment for the biological microscope.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).</li><li>Alsop, G. B., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+continuously+dictate+distribution+of+actin+filaments+and+positioning+of+cell+cleavage+in+grasshopper+spermatocytes.">Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase'+and+cytokinesis+in+the+absence+of+chromosomes.">Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes.</a> Nature. 382, 466-468 (1996).</li></ol>

Med övning, kan flyttar kromosomer i cellen bli en andra natur. Nålar som är tillräckligt styva och tillräckligt tunn spets är svårt att ”få knep för” fabricera, men denna förmåga kommer också med praktiken. Nålar som är så fina att de deformeras när flyttade i halocarbon oljan blir inte användbar för att driva kromosomer i cellen. Nålar som är så trubbig att deras tips är synliga och lika stora som 1/3 av en kromosom bredd (eller större) är mycket sannolikt att döda cellen. Skapandet av en n...

Mikromanipulation har avslöjat delar av mekanismen för en kromosom congression, spindel checkpoint och Anaphasen kromosom rörelser. Den tidigaste publikation som beskriver resultaten av mikromanipulation experiment var av Robert Chambers1. Chambers används en mekanisk micromanipulator med en bifogad glas nål sond cytoplasman i ett antal olika celltyper. Tyvärr, kontrast metoder som tillät visualisering av kromosomer och många andra cellulära komponenter i levande celler inte var tillgängliga vid tiden så Chambers experiment inte kunde Visa effekterna av ompositionering sådana cellulära komponenter. Tidig micromanipulations som förändrade kromosomen position används Chambers apparaten för att sopa den spindeln midzone i Anaphasen celler, visar att sådana manipulationer kan ändra positionen för kromosom armar i Anaphasen gräshoppa neuroblasts2 . Nicklas och hans medarbetare var först att utföra fina micromanipulations av kromosomer, stretching kromosomerna3, du lossar dem från spindeln och förmå en omorientering3,4, stabilisera en malorientation av spänning för kromosomerna5,6,7, och mäta de krafter som produceras av spindlar i Anaphasen8,9. Annat arbete av Nicklas lab visade att cytoplasmiska korn också kan vara manipulerade10 och att centrosomes skulle flyttas av mikromanipulation11. Mikromanipulation är inte bara användbart för att flytta kromosomer och andra cellulära komponenter. En mikromanipulation nål renlig kan skära genom en mitotiska spindeln i demembranated celler12 eller kan användas för att upplösa den nuclear envelope13. Intilliggande celler kan dessutom vara smält av mikromanipulation14,15.
Med ett så brett utbud av intressanta experiment som kan göras med mikromanipulation är det vid första anblicken förvånande att mikromanipulation experiment har gjorts av mycket få kromosom biologer. En orsak till denna brist är att de mitotiskt dividera odlade celler som härrör från ryggradsdjur vävnader och används ofta för att studera kromosom rörelser är extremt svåra att micromanipulate. Dessa vävnadsodling celler har i allmänhet en kortikal cytoskelettet att ”kommer i vägen” av mikromanipulation nål, och kromosomerna antingen inte kan nås av nålen eller nålen slipar igenom cellen, vilket leder till en cell bristning och döden. Vi och andra praktiker som använder mikromanipulation, har hittat leddjur celler att vara mottagliga för mikromanipulation. Leddjur spermatocyter sprids lätt under ett lager av halocarbon olja och verkar ha en mycket mindre robust kortikala cytoskelettet underliggande cellmembranet under en celldelning. Således, leddjur testiklarna ger en bra källa av meiotically-att dela upp celler (spermatocyter) och mitotiskt-att dela upp celler (spermatogonier) med lättillgängligt kromosomer för mikromanipulation. En seriell sektionering av en gräshoppa spermatocyte fast under en manipulation avslöjade att nålen aldrig tränger cellmembranet; cellmembranet deformerar runt nålen (Nicklas R.B., personlig kommunikation). Spermatocyter från ett antal insekt och spider taxa har varit micromanipulated framgångsrikt, inklusive gräshoppor, be mantids, bananflugor, crane flugor, syrsor, spittlebugs, nattfjärilar, svarta änkan spindlar, källare spindlar och orb-vävning spindlar 3,7,17,18,19,20,21,22. Odlade, mitotiskt-att dela upp celler från insekter kan vara micromanipulated. Till exempel har kromosomerna i grasshopper neuroblasts i en primär kultur kromosomer som kan vara lätt micromanipulated2,23. Vi misstänker att de tillgängliga odlade linjer härrör från Drosophila och andra insekter blir också micromanipulatable, men vi inte har testat tekniken med dessa celler. Vi visar hur delande celler från gräshoppor och syrsor kan förberedas för en mikromanipulation. Syrsor är lätt att få från de flesta djuraffärer som helst på året. Gräshoppor är bara enkelt kan erhållas i sommaren om forskaren har tillgång till ett laboratorium koloni, men de arter som används (Melanoplus sanguinipes) har lätt tillplattad celler och lång, lätt-till-manipulera kromosomer.
En annan orsak varför mikromanipulation experiment har gjorts av en liten handfull biologer är att micromanipulators som flyttar kromosomer väl är sällan tillgängliga i marketplace. Vi har funnit att en joystick-kontrollerade piezoelektriska micromanipulator styr nålen rörelsen med ingen vibration, drift eller eftersläpning mellan den joystick rörligheten och nål, men andra typer av manipulatorer kan också framgångsrikt driva kromosomer runt i cellen. De micromanipulators designad av Ellis och Begg25,26 är idealiska för mikromanipulation kromosomer, även om de använder äldre teknik. Piezoelektriska micromanipulators är för närvarande tillgängliga och används ofta i elektrofysiologi; dessa micromanipulators är dock inte vanligtvis joystick-kontrollerade. Joystick kontroll är nyckeln till de mjuka rörelser som krävs för en lyckad mikromanipulation, och så en anpassad joystick bör utformas för att göra de nu befintliga piezoelektriska micromanipulators arbeta för en kromosom mikromanipulation. De joystick-kontrollerade piezoelektriska micromanipulators som fungerar bäst har direkt position kontroll, där rörelsen av joysticken översätter direkt till en nål rörelse.
En nydesignade piezoelektriska micromanipulator kan konstrueras från kommersiellt tillgängliga delar som lätt kan ersättas och några små 3D-utskrivna komponenter, och det fungerar bra för kromosom mikromanipulation24. Micromanipulator har justerbar känslighet, manuell grov positionering, och inga vibrationer, drift eller lagg i nålen rörelsen och direkt position kontroll av nålen. Forskare kan konstruera den micromanipulator som använder instruktioner tillgängliga online24. Nedan är metoderna för att förbereda en primär spermatocyte cellkultur och för micromanipulating kromosomer i cellerna i det kulturen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">VWR micro cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48366 249</td>
			<td style="width:167px;">25x25 mm, no 1.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>AA44224-KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">KEL-F Oil #10</td>
			<td style="width:71px;">Ohio Valley Specialty Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microdissecting Scissors, Stainless Steel</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3271-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dumont #5 fine foreceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order--call to request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective</td>
			<td style="width:71px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">microforge</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Narashige</td>
			<td style="width:119px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">micromanipulator</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick</td>
			<td style="width:119px;">PCS-6300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes

Mikromanipulation kromosomer har varit en viktig metod för upplysande mekanismen för kromosom congression, spindel checkpoint och Anaphasen kromosom rörelser, och har varit nyckeln till att förstå vad som styr kromosom rörelser under en celldelning. En skicklig biolog kan använda en micromanipulator för att lossa kromosomer från spindeln, flytta kromosomer i cellen, och att tillämpa styrkor till kromosomer med ett litet glas nål med en mycket fin spets. Medan störningar kan göras till kromosomer med andra metoder såsom optiska svällning och andra användningar av en laser, hittills, tillåter ingen annan metod ompositioneringen av cellulära komponenter på skalan av tiotals till hundratals mikrometer med liten eller ingen skada på cellen .
Urval och förberedelse av lämpliga celler för mikromanipulation kromosomer, som specifikt beskriver utarbetandet av gräshoppa och cricket spermatocyte primära cellkulturer för användning i live-cell imaging och mikromanipulation, är beskrivs här. Dessutom visar vi byggandet av en nål användas för flyttar kromosomer i cellen, och användning av en joystick-kontrollerade piezoelektriska micromanipulator med ett glas nålen bifogas det flytta kromosomer inom delande celler. Ett provresultat visar användningen av en micromanipulator att lösgöra en kromosom från en spindel i en primär spermatocyte och flytta den kromosomen inom cellen.

Figur 6 visar en prov mikromanipulation av 2 intilliggande gräshoppa primära spermatocyter i flera exempel på de möjliga användningsområdena för mikromanipulation. Detta experiment gjordes med hjälp av en inverterad, faskontrastmikroskop. 0:00 (gånger visas är i min:s) bilden visar båda cellerna före manipulering. En kromosom i cellen längst ned visas under spänning appliceras av mikromanipulation nålen (0:05; svart pil) och sedan helt friståe...

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes at JoVE.com

Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

I detta protokoll beskriver vi urval och förberedelse av lämpliga celler för mikromanipulation och användning av en piezoelektrisk micromanipulator att flytta kromosomer i dessa celler.

Mikromanipulation kromosomer i insekt spermatocyter

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i cellbiologi, såsom, hur viktigt är spänning för att tillfredsställa spindeln checkpoint, och vad är rollen på spindel fastsättning i kromosom beteende i mios? Den största fördelen med denna teknik är att det är en nonlethal teknik som gör det möjligt för experimentören att tillämpa spänning på, eller ompositionera kromosomer i en levande cell. Till att börja med förbereda en 75 med 25 millimeter glida med en 20 millimeter diameter cirkulärt hål utskuren ur mitten.Kör sedan en 25 gånger 25 millimeters nummer 1,5 täckspring genom en bunsenbrännarlåga i två sekunder. Lägg på vakuumfett runt hålets kant i glasglaset. Därefter placerar du luckan över hålet och trycker på det för att bilda en tät förslutning.Vänd på glidbanan och fyll den nyskapade dissektionen väl med halocarbonolja. Efter att ha skaffat några vuxna manliga syrsor, använd dissekera saxar för att skära genom ryggytan parallellt med den långa axeln av buken, direkt bakom vingknopparna. Sedan försiktigt pressa buken för att driva testikorna genom snittet i exoskelettet.Med hjälp av tövövingar, placera de isolerade testikkårerna i dissektionen väl. Under dissekering mikroskop, använd fina pekar forceps att dela testiklar i mindre bitar, och ta bort eventuellt fett. Sprid sedan ut innehållet i testiken under oljan på täcksprundens yta.Fortsätt att sprida innehållet i testiken tills spridningen delen är knappt synlig för blotta ögat. Ytterligare oljebelastad dissektions brunnar får användas vid behov. Först, placera slutet av ett glasrör i lågan av Bunsen brännare.Håll i änden av slangen för att skapa en 150 graders vinkel och ett utökat område med smala glasrör. Bryt slangen i den tunna regionen så att den tunna regionen som sträcker sig från den tidigare skapade vinkeln är cirka 10 millimeter lång. Smält glasnålens spets med hjälp av mikroforgen och bildar en 45 graders vinkel mellan nålen och mikroforgens platinatråd.Dra sedan bort glaset från ledningen samtidigt som värmen ska stängas av. Placera den tidigare beredda bilden på scenen för ett inverterat faskontrastmikroskop. Sedan hittar du de skiljeceller och centrera dem i synfältet med hjälp av lägsta möjliga förstoring.Placera mikronålen i mikromanipulatorns nålhållare. Placera sedan manuellt mikrodockan i mikroskopets ljusväg. Fokusera mikroskopet flera fokalplan ovanför planet som innehåller cellerna.Därefter använder joysticken styrenheten för att placera om mikronålen flera gånger för att hitta skuggan av nålen i x- och y-axlarna. Justera nålens läge tills spetsens läge är synligt, justera sedan nålens position längs z-axeln tills spetsen är i fokus. Därefter fokusera på cellerna, och fokusera mikroskopet strax ovanför cellplanet.Sedan, justera nålens position så att spetsen är i fokus i detta fokalplan. Upprepa den här processen med hjälp av målsättningen för högre förstoring och en inställning för högre känslighet. Fokusera om på cellerna, och justera deras position, så att de stannar kvar i mitten av synfältet.Använd joysticken för att styra mikrodockan när den skjuter kromosomer runt inuti cellen. Se till att nålspetsen blir kvar i planet ovanför cellerna. För att flytta kromosomen, fokusera på en kromosom nära toppen av cellen.Justera sedan z-axeln på joysticken för att få nålspetsen i fokus, och flytta nålen med styrspaken i x och y. Placera nålspetsen direkt på kromosomen av intresse, och tryck den i önskad riktning. Applicera tillräckligt med spänning för att separera kromosomen från spindeln.Placera slutligen kromosomen var som helst i cellen. Med hjälp av detta protokoll är det möjligt att flytta om, applicera spänning på och helt lossa en kromosom från en spindel med hjälp av mikromanipulation. I det här exemplet hölls två manipulerade kromosomer från att sätta tillbaka spindeln genom att kontinuerligt knuffas med en micromanipulation nål.När behärskar, prover kan förberedas för manipulation, och mikromanipulator kan placeras i 15 till 20 minuter. Micromanipulation experiment kan ta allt från några sekunder till flera timmar. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att manipulera kromosomer på sidan av cellen längst bort från locket slip.Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom cellbiologi att utforska spindeln checkpoint i gräshoppor och be mantis.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic tillvägagångssätt för att bedöma Bildande av neurala anslutningar i en samodlingssystemet

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik till Target mikroinjektion till utvecklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Njure

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Rumsliga och tidsmässiga analys av aktiva ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; arvslinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Tillämpningen av RNAi och värme-chock-inducerad transkription faktorn uttryck att omprogrammera könsceller att nervceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation analyser att utvärdera bindningen av Drosophila skåran med Trans-ligander och dess hämning av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrollerad kortikal effekt modell av mus hjärnskada med terapeutisk transplantation av humana inducerade pluripotenta stamceller-härledda neurala celler

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...