Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

نتقدم بالشكر إلى م. تذييل، R. لاماسون، م. رينجارانجان، وأعضاء مختبر ثيريوت لمناقشاتهم ودعم تجريبية. وأيد هذا العمل R01AI036929 المعاهد الوطنية للصحة (J.A.T.)، HHMI (J.A.T.)، وزمالة غيليام HHMI للدراسة المتقدمة (F.E.O.)، وزمالة خريج جامعة ستانفورد (F.E.O.)، وجمعية القلب الأمريكية (E.E.B.). وأجرى التدفق الخلوي في "مرفق نظام مراقبة الأصول الميدانية المشتركة في جامعة ستانفورد".

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

بمعنى خلايا العديد من الإشارات البيئية المادية، التي يمكن أن تؤثر على مورفولوجيا الخلايا ليس فقط، بل أيضا على الجينات النشاط التعبير والبروتين، مما يؤثر على الخلية الحيوية وظائف والسلوكيات45،46. ويقدر متزايد صلابة لإدارة المحتوى في المؤسسة الخلايا المغير هامة حركية الخلوية والتمايز، والانتشار، وفي نهاية المطاف خلية مصير47،،من4849. على الرغم من أن هناك العديد من أوجه التقدم الأخيرة في فهم التفاعل المعقد بين الخلايا وإدارة المحتوى في المؤسسة على النشاط الحيوي، يعرف الكثير عن تصلب البيئة كيف يؤثر على قابلية الخلايا للعدوى البكتيرية. لتسهيل مثل هذه الدراسات، قمنا بتطوير هذا الفحص جيدا متعددة رواية استناداً إلى تلفيق راسخة من الهلاميات المائية polyacrylamide من صلابة الانضباطي الذي يتوافق مع فحوصات العدوى50. تقليديا، درست عدوى بكتيرية من الخلايا في نسيج الثقافة على الزجاج أو البوليستيرين السطوح التي حوالي 1-3 أوامر من حجم أقسى من المحتوى الطبيعي من8،الخلايا الأكثر ملتصقة51. والرزن الموصوفة هنا فتح الطرق الجديدة بتمكين دراسة التفاعلات البكتيريا المضيفة في نظام تصلب بيئية ذات صلة فسيولوجيا.
لإثبات المفهوم للمقايسة المقدمة، تم اختيار الخلايا هميك-1 كنموذج الخلايا المضيفة ملتصقة و Lm ممرض جرثومي نموذج. ومع ذلك، يمكن تمديد المقايسة لإجراء المزيد من الدراسات إذا كان تعديل مناسب. يمكن أن تشمل هذه الدراسات الإصابة بأنواع مختلفة من الثدييات المضيفة ملتصقة الخلية بمسببات إضافية، بما في ذلك البكتيريا والفيروسات. لهذا التحليل خاصة، المواد الهلامية كانت البروتينات المغلفة مع الكولاجين أنا، ولكن تبعاً لنوع الخلية المضيفة، من الممكن استخدام بروتين ECM مختلفة-طلاء، مثل laminin أو فيبرونيكتين، تيسيرا للمرفق للخلايا المضيفة للفائدة على المائية 52-وهناك اعتبار آخر يعتمد على نوع الخلية المضيفة هو مدى صلابة المائية ينبغي أن تدرس. ينبغي أن يتوقف مدى صلابة على ما هو ذات الصلة الفيزيولوجية لنوع الخلية المضيفة محددة ومدى تعلق التي تستضيف تشكيل أحادي الطبقة في هيدروجيل صلابة معطى. وبالمثل، اعتماداً على الممرض النموذج المطلوب لفحصها، قد تحتاج تعديلات طفيفة سيتم تنفيذها على فحص الإصابة المبينة في هذا التقرير.
ابتكار التحليل مقارنة بالطرق السابقة للتصنيع polyacrylamide الهلاميات المائية24،،من5053 يكمن في بعض ميزات فريدة من نوعها إدماج التحليل المقترح العدوى. أولاً، الهلاميات المائية مبنية على لوحات أسفل الزجاج جيدا المتعددة، الذي يتيح فحص شروط متعددة في وقت واحد، فضلا عن أتمتة إجراءات معينة. رصد ظروف متعددة في نفس الوقت أو دراسة replicates متعددة أمر حاسم نظراً لنتائج مثل هذا النهج يمكن أن يتأثر بعوامل مثل مرور الخلية المضيفة والعدد الدقيق للبكتيريا المضافة لتصيب الأجهزة المضيفة، التي غالباً ما تتغير بين التجارب المستقلة. ميزة إضافية فريدة من نوعها لهذا التحليل أن الهلاميات المائية ارتفاع حوالي 40 ميكرومتر، ورقيقة ما يكفي الصورة باستخدام الفحص المجهري التقليدي. لقد أظهرنا أننا يمكن بنجاح تنفيذ خلية حية مجهرية وتثبيت الخلية، وإيمونوستينينج تليها التصوير، دون الأخذ بالأسفار خلفية عالية. وأخيراً، الهلاميات المائية مصنوعة من طبقتين، مع واحد العلوي بعد المضمنة ميكروبيدس نيون، تقتصر المستوى البؤري واحد. هذه السمة يضمن أنه لن يكون هناك أي ضوء خارج نطاق التركيز التدخل أثناء التصوير. ويتيح وجود الخرز كل دراسة التضاريس السطحية للمواد الهلامية لضمان أن تكون موحدة ويحسن أداء ينص، والرجال الذين يمارسون اللواط24،،من3241. ينص والرجال الذين يمارسون اللواط، من الممكن لحساب قوي ECM خلية وخلية-خلية على التوالي من الخلايا المقيمة على اختلاف مصفوفات صلابة. باستخدام هذا الفحص الرواية، من الممكن جعل هذه القياسات للقوى المادية بمقارنة كل مساهمة من صلابة البيئية والإصابة في وقت واحد. في أعقاب مثل هذا نهج، على أثر العدوى الخلية المضيفة يمكن تحديد ميكانيكا طوال مساره. بالإضافة إلى ذلك، تطور الضغوط داخل الخلية من الخلايا يمكن حسابها باستخدام الرجال الذين يمارسون اللواط ويمكن استخدامها كمقياس لسلامة الحاجز أحادي الطبقة. وأخيراً، نظراً لطبيعة متعددة جيدا التحليل، من الممكن ﻹدخال الاضطرابات الوراثية والدوائية مع عدوى بكتيرية، التحقيق بمزيد من التعمق في التفاعل المعقد بين الميكانيكا الخلية المضيفة والإصابة في وقت واحد.
قد يكون أحد الملازمة للحد من هذه التقنية تكمن في صلابة الركازة تأثير على معدل انتشار الخلايا. عادة، في فحوصات العدوى، نحن بحاجة إلى ضمان أن كثافة الخلايا المضيفة تحت ظروف مختلفة هو نفسه. وهذا نظراً لكثافة الخلية بحد ذاته يمكن أن يكون لها تأثير على قابلية المضيفين للإصابة. عدم إظهار الخلايا هميك-1 التي استخدمت كالخلايا المضيفة اختلافاً كبيرا في عددها عند المصنف ح 24 على الهلاميات المائية. ومع ذلك، أنواع مختلفة من الخلايا قد يحمل الانتشار التفاضلي، اعتماداً على صلابة المائية، التي يمكن أن التحيز دراسات عدوى. وبالمثل، يمكن أن تنشأ التحيز العدوى عند الخلايا لا تشكل مونولاييرس أو لا تقم بإرفاق جيدا في الهلاميات المائية، كما يحدث عند بعض أنواع الخلايا هي تبذر في مصفوفات لينة جداً (مثلاً، والخلايا البطانية البشرية الحبل السري أو مدين-داربي الكلاب الكلي الخلايا الظهارية المصنف على 0.6-الجيش الشعبي الكوري الهلاميات المائية54،55.) وبقدر ما يتعلق بمسببات الأمراض، يمكن إرفاق بعض البكتيريا (مثلاً، بوردجورفيري البورليه) على استضافة الخلايا وغزو لهم ولكن يمكن أيضا ترانسميجراتي من خلالهم56. ونحن لم بعد اختبارها إذا سيعمل هذا التحليل لدراسات الهجرة الممرض، ولكن يبدو من الممكن منذ تم توثيق الدراسات السابقة على العَدلات ترانسميجراتينج غشائي الخلايا المصنفة في الهلاميات المائية السلطة الفلسطينية أن تعمل بنجاح من57. وهناك الكثير من الدراسات التي أجريت تبين كيفية صنع الهلاميات المائية polyacrylamide لمعامل معين للشباب عن طريق خلط التركيزات المناسبة من الاكريلاميد ومكررا-مادة اكريلاميد24،25،26 ،27. ومع ذلك، خاصة عند أحد يرغب في القيام بتجارب ينص على الخلايا المقيمين في الهلاميات المائية صلابة متفاوتة، المهم لتأكيد صلابة المتوقعة من الهلاميات المائية عن طريق فؤاد أو سائر تقنيات المسافة البادئة58. انحرافات طفيفة من القيمة المتوقعة يمكن أن تنشأ بسبب مختلف المذيبات المستخدمة أو حلاً أسهم اكريلاميد الذين تتراوح أعمارهم بين، أو بطرق فؤاد القياسات المنجزة (مثلاً، شكل تلميح فؤاد). وأخيراً، يستند النهج المقدمة في هذه الوثيقة البذر الخلايا المضيفة في مصفوفات ثنائية الأبعاد، التي يمكن أن تختلف عن سيناريو ثلاثي الأبعاد أكثر واقعية وفسيولوجيا ذات الصلة. بيد تصنيع المواد الهلامية 3D مع تصلب الانضباطي، بذر منهم مع الخلايا المضيفة وثم يصيب لهم مع مسببات الأمراض، لا يزال يشمل بعض الصعوبات التقنية. ومع ذلك، نحن نتوقع أن في المستقبل القريب ونحن سوف تكون قادرة على توسيع نطاق التحليل الحالي لدراسة الإصابة في أجواء ثلاثية الأبعاد.
خلاصة القول، البروتوكول وصف جنبا إلى جنب مع النتائج الأولية تقديم أدلة على أن هذا التحليل رواية يمكن أن تصبح أداة مفيدة للغاية لدراسة الإصابة بالخلايا المضيفة ملتصقة بالبكتيريا المسببة للمرض بطريقة كمية، وفي كثير ذات الصلة فسيولوجيا البيئة مما سبق فحصها. السلطة من اختﻻق polyacrylamide الهلاميات المائية في إعداد المقترح يكمن في ذلك المقايسة متوافق مع أداء تقنيات متعددة مثل التدفق الخلوي، إيمونوستينينج متبوعاً بالفحص المجهري الخفيفة وقوة الجر مجهرية. التحليل يمكن أن يستخدمها للدراسات المتعلقة بعدوى أنواع الخلايا المضيفة ملتصقة مختلف مسببات الأمراض، التي نتوقع سيكون لها أثر كبير في كشف كل الاستراتيجيات التي تصيب الكائنات الممرضة المضيفين وتيسير تطوير التدخلات العلاجية ضد الالتهابات.

الخلايا في الأنسجة الحيوانية الأكثر عادة ملتصقة، إرفاق كل من الخلايا المجاورة وهذه المصفوفة خارج الخلية (ECM). مرسى الخلايا لإدارة المحتوى في المؤسسة أمر بالغ الأهمية للعديد من العمليات الخلوية التي تتراوح من حركية خلية خلية الانتشار والبقاء على قيد الحياة1،2. مرسى الخلوية لإدارة المحتوى في المؤسسة يعتمد على كل من تكوين إدارة المحتوى في المؤسسة وصلابة. الخلايا التي تستجيب للتغيرات في هذا الأخير بإعادة ترتيب بشكل حيوي على سيتوسكيليتون، والالتصاقات ECM خلية وخلية خلية، مما يغير بدوره حاسمة خلية الميكانيكا الحيوية ووظائف3،،من45،6 . يمكن أن تختلف صلابة ECM في الفضاء (أيموقع التشريحية)، في الوقت المناسب (أي، الشيخوخة)، وفي العمليات الفيزيولوجية المرضية (مثلاً، وتصلب الشرايين، والسرطان، والعدوى، إلخ). على سبيل المثال، من المقبول على نطاق واسع أن غشائي الخلايا الموجودة على تشديد-بالمقارنة مع ليونة مصفوفات بذل زيادة القوات إدارة المحتوى في المؤسسة وبعضها البعض ويحمل زيادة حركية وانتشار7،من8. وبالمثل، الليفية المقيمين في مصفوفات أغلظ نقل قوات الهوس عالية لإدارة المحتوى في المؤسسة على وإظهار زيادة انتشار وحركية، وإدارة المحتوى في المؤسسة إنتاج9،،من1011. على الرغم من أن ميكانيكا الخلية واستجابة لتصلّب إدارة المحتوى في المؤسسة وقد درست على نطاق واسع لمختلف أنواع الخلايا، العلاقة بين الخلايا المضيفة ملتصقة، تصلب إدارة المحتوى في المؤسسة، والعدوى البكتيرية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير.
لدراسة دور صلابة ECM في تفاعلات الخلية البكتيريا المضيفة، اختير لام الليستريه (Lm) الممرض النموذجي. لم هو بكتيريا تنقلها الأغذية في كل مكان يمكن أن تسبب العدوى المجموعية في مجموعة متنوعة واسعة من المضيفين الثدييات. يمكن نقل هذا الممرض داخل الخلايا اختياري من ظهارة الأمعاء إلى الأجهزة البعيدة بمروره بأنواع مختلفة من الجهاز الوعائي. إذا أنها تخرق حاجز الدم في الدماغ، لم يمكن أن يسبب التهاب السحايا، وعندما يعبر المشيمة، فإنه يمكن أن يسبب الإجهاض العفوي12،13. يمكن أن تصيب مضيف مختلف أنواع الخلايا Lm ويمكن القيام بذلك باستخدام استراتيجيات متميزة المسببة للأمراض. ودرست العدوى Lm معظمها في سياق الخلايا الظهارية، بينما يعرف أقل بكثير عن كيف يمكن أن تصيب Lm وتجاوز خلايا بطانية بطانة التجويف الأوعية الدموية14،،من1516. وعلاوة على ذلك، أنها لا تزال غير معروفة إلى حد كبير كيف ينظم صلابة لإدارة المحتوى في المؤسسة التي يقيم فيها خلايا بطانية Lm للقدرة على غزو هذه الخلايا المضيفة وانتشرت بعد ذلك. Lm وعدة أنواع بكتيرية إضافية (أي، باركيري الريكتسية) الاستفادة من cytoskeleton أكتين المضيفة غزو في السيتوبلازم الخلايا أنها تصيب على حد سواء وتيسير نشر خلية إلى17 , 18 , 19. أنها تحقيق ذلك من خلال التعبير عن البروتينات التي تمكنهم من التدخل في مسارات بلمرة الأكتين المضيف وإنتاج أكتين ذيول المذنبات التي تيسر على الدفع إلى الأمام16،20. نتيجة للإصابة، أكتين سيتوسكيليتون للخلية المضيفة يحتاج إلى إعادة ترتيبها بشكل حيوي بطريقة لا تزال غير كاملة تتسم، يحتمل أن تؤثر على الميكانيكا الحيوية الخلايا المضيفة بما في ذلك القوات المادية التي يبذلونها إدارة المحتوى في المؤسسة وعلى كل الأخرى. لدراسة هذه العمليات، اختيرت البشرية خلايا بطانية microvascular (هميك-1) نموذج الخلايا المضيفة لثلاثة أسباب: 1-تعرف خلايا بطانية لتكون الغاية ميتشانوسينسيتيفي كما أنهم يتعرضون باستمرار لاختلاف21من الرموز المادية؛ 2-استراتيجيات Lm توظف لتصيب خلايا بطانية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير22؛ و 3. هميك-1 هي خط خلية مخلدة ويمكن، لذلك، بسهولة مثقف وتعرض للتلاعب بالجينات.
وقد العدوى البكتيرية من الخلايا المضيفة معظمهم درس في المختبر بزرع الخلايا على الزجاج أو البوليستيرين الركازات التي أشد كثيرا مما ECM الفسيولوجية لمعظم الخلايا12،،من1423. دراسة عدوى الخلايا المصنفة في مصفوفة التي تصلب من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة، وتوضيح دور صلابة ECM على عدوى الخلايا من مسببات الأمراض البكتيرية، اتبعنا نهج مبتكر يستند إلى اختﻻق رقيقة الهلاميات المائية جزءا لا يتجزأ من ميكروبيد polyacrylamide من تيبس الانضباطي في لوحات متعددة جيدا. تكمن جدة النهج المقترح يسمح رصد ظروف متعددة في وقت واحد بسبب شكلها متعددة جيدا، وفي هذا ومتوافق مع تقنيات متعددة بسبب طريقة خاصة مبنية ركائز. هميك-1 الخلايا المصنفة في هذه الهلاميات المائية المغلفة بالبروتين وثم المصابين بسلالات مختلفة لم تصبح الفلورسنت عند تدخيل أو أنها مؤثرا الفلورسنت. وتم تقييم دور صلابة ECM على قابلية الإصابة بالخلايا المضيفة هميك-1 بالتدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت الفحص المجهري إيمونوستينينج والأسفار للتفريق بين البكتيريا المنضمة والمدخلة. أخيرا، أجرى الفحص المجهري قوة الجر (ينص) بنجاح لتميز أثر العدوى Lm في الجر وتشدد على أن تمارس خلايا المضيف بطانية على تلك المصفوفات أثناء الإصابة. يمكن بسهولة تعديل المقايسة المقدمة لتمكين مزيد من دراسات بشأن تأثير صلابة ECM على قابلية العدوى من الخلايا ملتصقة باستخدام خطوط مختلفة الخلية أو مسببات الأمراض.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

تصلب المصفوفة خارج الخلية تضم واحداً من المحفزات الميكانيكية البيئية متعددة معروفة جيدا للتأثير على السلوك الخلوية، ومهام، ومصير عموما. على الرغم من أن تتسم متزايدة أكثر من خلية ملتصقة أنواع الردود على صلابة مصفوفة، كيف تمسكا الخلايا التعرض للعدوى البكتيرية يعتمد على صلابة مصفوفة مجهولة إلى حد كبير، كما هو أثر العدوى البكتيرية على الميكانيكا الحيوية للخلايا المضيفة. نحن افترض أن قابلية خلايا المضيف بطانية لعدوى بكتيرية يعتمد على صلابة المصفوفة التي تتواجد هذه الخلايا، وأن انتقال العدوى إلى المضيف الخلايا مع البكتيريا ستتغير الميكانيكا الحيوية. لاختبار هذه الفرضيات اثنين، ممرض نموذجي خلايا بطانية كنموذج المضيفين و الليستريه المستوحدة . النامية تحليل رواية تنسيق متعدد جيدا، نظهر أن أثر صلابة مصفوفة على عدوى خلايا البطانية لام الليستريه يمكن تقييمها كمياً عن طريق التدفق الخلوي و immunostaining متبوعاً بالفحص المجهري. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام مجهر القوة الجر، أثر العدوى الليستريه L. في الميكانيكا الحيوية غشائي خلية المضيف يمكن دراستها. تسمح الطريقة المقترحة لتحليل تأثير ميكانيكا النسيج ذات الصلة على العدوى البكتيرية من الخلايا ملتصقة، الذي يعد خطوة حاسمة نحو فهم التفاعلات النشاط الحيوي بين الخلايا، وهذه المصفوفة خارج الخلية، و البكتيريا المسببة للأمراض. هذا الأسلوب ينطبق أيضا على مجموعة متنوعة من أنواع أخرى من الدراسات المتعلقة بالميكانيكا الحيوية في الخلية واستجابة لتصلّب الركيزة حيث من المهم أن تكون قادرة على أداء replicates عديدة في نفس الوقت في كل تجربة.

إدارة المحتوى في المؤسسة قابلية الخلايا هميك-1 تعتمد على صلابة للعدوى Lm: السلطة الفلسطينية الهلاميات المائية من صلابة متفاوتة، كل سطح المغلفة مع الكولاجين أنا، بنيت على لوحات أسفل الزجاج متعدد جيدا كما هو موضح في الخطوة 1 من البروتوكول (انظر الشكل 1). وأجريت قياسات فؤاد لتأكيد صلابة الدقيق من الهلاميات المائية، كما هو موضح سابقا26،27 (انظر الشكل 2). وقد أظهرت الدراسات السابقة أن امتثال الغشاء الطابق السفلي لخلايا بطانية المحلية يمكن أن تتراوح بين 1 كيلو باسكال (مثلاً، أنسجة المخ) 70 كيلو باسكال (مثلاً، الشريان الاورطي)36،،من3738، 39 , 40-ولذلك، اخترنا لاختبار عدوى الخلايا هميك-1 يقيمون في مصفوفات مع تصلب التالية: 0.6 الجيش الشعبي الكوري الكوري 3، 20 كيلوباسكال و 70 كيلو باسكال. لكل صلابة المائية، كانت ملفقة الهلاميات المائية الستة لتقييم إمكانية تكرار نتائج نتائج.
كان يستخدم التدفق الخلوي لتقييم قابلية تعتمد على صلابة ECM هميك-1 الخلايا للإصابة Lm (انظر الشكل 3). هميك-1 الخلايا كانوا مصابين بسلالة Lm (JAT985) الذي يعبر عن علامة نيون بعد استيعاب (actAp::mTagRFP)، مما يتيح الكشف عن البكتيريا داخل الخلايا فقط (انظر الأرقام 1 لتر - 1N). كما يفتقر JAT985 ActA، تعطيل البكتيريا من الانتشار من خلية إلى أخرى، حيث ActA ضروري لتشكيل ذيول المذنب أكتين ونشر البكتيريا اللاحقة. 7-وكان تقييم ح 8 بعد انتهاء العدوى، عدوى الخلايا هميك-1 باستخدام التدفق الخلوي. لضمان تحليل الخلايا المفردة، الجزء الأكبر توزيع عدد خلايا كانت بوابات استخدام الأمام مقابل الجانب مبعثر مؤامرة، وثم أنجزت خطوة ثانية النابضة باستبعاد الخلايا التي يحمل أوتوفلوريسسينسي (انظر الأرقام 3A - ج 3 ). وتظهر النتائج الأولية المبينة في الشكل 3 أن العدوى هميك-1 مع Lm من شقين هما أكبر لخلايا هميك-1 يقيمون في الهلاميات المائية الجيش الشعبي الكوري 70 شديدة بالمقارنة مع الخلايا الموجودة على 0.6 لينة، الجيش الشعبي الكوري الهلاميات المائية (انظر أرقام 3B - 3D). يمكن أن تكون زيادة قابلية الإصابة Lm هميك-1 الخلايا المقيمة على شديدة بالمقارنة مع المصفوفات لينة المقرر أن: 1. زيادة التصاق Lm على هميك-1؛ 2-زيادة Lm الاجتياح هميك-1؛ أو 3. كلا أعلاه اشترك تحدث. لاختبار الذي يحمل فرضية، الخلايا هميك-1 كانت تبذر في الناعمة (3 كيلو باسكال) وتصلب الهلاميات المائية (70 كيلو باسكال) والمصابين مؤثرا بروتينات فلورية خضراء معربا عن Lm (انظر الأرقام 4A - 4 ج). العينات التي تم إصلاحها بعد وقت قصير من العدوى والبكتيريا (الانضمام) الخارجية كانت ملطخة بالأجسام المضادة. استخدام كمية مجهرية، وجدنا أن هناك أكثر بكثير من البكتيريا التمسك هميك-1 عندما تتواجد الخلايا المضيفة على شديدة بالمقارنة مع المواد الهلامية الناعمة (انظر الشكل 4د). متسقة مع بيانات التدفق الخلوي، وهناك أكثر بكثير من البكتيريا استيعاب هميك-1 عندما تتواجد الخلايا المضيفة على شديدة بالمقارنة مع المواد الهلامية الناعمة (انظر الشكل 4ه). بيد أن غزو كفاءة (البكتيريا المنضوية إلى مجموع عدد من البكتيريا) Lm في خلايا هميك-1 مماثلة، بغض النظر عن صلابة الركازة (انظر الشكل 4و).
قوة الجر الفحص المجهري للخلايا المصابة Lm هميك-1: يمكن أن يغير Lm العدوى من الخلايا هميك-1 الميكانيكا الحيوية الخلايا المضيفة المصابة، بما في ذلك قوة مرفق بها إدارة المحتوى في المؤسسة أو لبعضها البعض، التي تؤثر على سلامة الحاجز. سعينا إلى تقييم ما إذا كان يمكن أن يكون الحال باستخدام "مجهر القوة الجر"32 لحساب قوي الجر ECM الخلية و "مجهرية الإجهاد أحادي الطبقة"41 لحساب القوات المتوترة داخل الخلايا. ويصور الشكل 5 خرائط تشوه حقل وحقل الإجهاد الجر، وحقل التوتر داخل الخلايا من الخلايا هميك-1 يقيمون في الهلاميات المائية 20-الجيش الشعبي الكوري في نقاط زمنية مختلفة العدوى بعد. الأرقام 5A - د 5 تشير إلى الخلايا مصابة التحكم هميك-1 بينما 5E الأرقام -- ح 5 تشير إلى هميك-1 الخلايا المصابة مع Lm في تعدد الإصابة يساوي 300 البكتيريا/خلية. هذا العمل الأولية تشير إلى أن الخلايا المصابة هميك-1 تقليل حجم الخلية-إدارة المحتوى في المؤسسة، وتشدد داخل الخلايا أثناء العدوى مع Lm، في حين أنه لم يلاحظ للخلايا التحكم غير مصاب.
إدارة المحتوى في المؤسسة تعتمد على صلابة Lm نشرها عبر مونولاييرس هميك-1: تم استخدام الوقت الفاصل بين الفحص المجهري للتحقيق في التأثير صلابة مصفوفة قد على Lm نشرها من خلال مونولاييرس هميك-1. كما لم ينتشر عن طريق أحادي الطبقة، البكتيريا خلق بؤرة للعدوى التي تنمو كدالة للزمن (انظر الشكل 6A و الفيديو الأرقام 1 و 2). وتم قياس مجال التركيز العدوى باﻻعتماد هال محدب، أصغر مضلع محدب يشمل مجموعة من النقاط حول البكتيريا42. هناك لا متري قياسية في مجال قياس كفاءة انتشار لام الليستريه خلية إلى خلية عن طريق أحادي الطبقة خلايا المضيفة. لتقييم كفاءة انتشار، بعضها تم إحصاء عدد الخلايا المضيفة في تركيز عدوى41، والبعض الآخر حدود مرسومة يدوياً حول المجموعة من الخلايا المضيفة الإصابة43. لقد اخترنا لرسم مضلع محدب حول البكتيريا، لأنها عملية تلقائية ومتسقة وغير مكلفة حسابياً لقياس كفاءة انتشار لام الليستريه . بالقيام بذلك، وجدنا انخفاضا طفيفا في مجال التركيز العدوى في الخلايا هميك-1 المصنف على 70 كيلو باسكال الهلاميات المائية عند مقارنتها بتلك التي تبذر في 3 مصفوفات كيلوباسكال (انظر الشكل 6ب و الفيديو الأرقام 1 و 2). لتحديد معدل النمو تركز الإصابة، كان رسم المسافة الشعاعية كدالة للزمن بأخذ الجذر التربيعي لمجال التركيز الإصابة بقسمة هذا بي. يفترض هذا التحول الرياضية شكل التركيز الإصابة دائرية تقريبا44. لقياس سرعة نمو التركيز، وتم قياس معدل التغير (أي، المنحدر) المسافة شعاعي للمصفوفات 3 و 70-الجيش الشعبي الكوري على حد سواء. توضيح هذا النهج أن التركيز العدوى نما أسرع وإخفاق في هميك-1 خلايا المصنف على المصفوفات 3-الجيش الشعبي الكوري. ومع ذلك، نمت التركيز أبطأ كثيرا (أول 200 دقيقة)، وأبطأ قليلاً (200 إلى 600 دقيقة) في خلايا المصنف إلى مصفوفات 70-الجيش الشعبي الكوري (انظر الشكل 6ج). وفي الواقع، أكد تحليل مزيدا من البيانات أن التركيز العدوى نما، في المتوسط، شقين أبطأ في مصفوفات 70-الجيش الشعبي الكوري، ولا سيما خلال 200 دقيقة الأولى (انظر الشكل 6د).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> الشكل 3 : إدارة المحتوى في المؤسسة تعتمد على صلابة قابلية الخلايا هميك-1 لغزو Lm تقاس باستخدام التدفق الخلوي .  كانوا مصابين بالخلايا هميك-1 Lm (JAT985) والعدوى تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي. أ. يظهر هذا الفريق جانب مقابل مؤامرة مبعثر إلى الأمام للممثل هميك-1 خلايا قادمة من بئر واحدة. تم تحديد توزيع الجزء الأكبر من الخلايا عن طريق النابضة لاستبعاد الحطام (يسار) وخلية دوبليتس أو ثلاثة توائم (يمين). ب. يوضح هذا الرسم البياني الرسم بياني لوغاريتم شدة الأسفار Lm كل خلية مطلي هميك-1 في الجيش الشعبي الكوري 0.6 الناعمة. ج-يوضح هذا الرسم البياني الرسم بياني لوغاريتم شدة الأسفار Lm كل خلية هميك-1 مطلي في تصلب الهلاميات المائية الجيش الشعبي الكوري 70. رسوم بيانية لقيم N = 4-6 وترد replicates بألوان مختلفة. مراقبة وقاية الخلايا الرسم البياني الأرجواني. بوابة المستخدمة لتعريف ما هو مصاب يظهر باللون الأحمر. وزارة الداخلية هو 100، والإصابة بالعدوى بعد ح 8 المقررة. د. البيانات تظهر النسبة المئوية للخلايا المصابة هميك-1 مقابل تصلب المائية (N = 5). تصوير أشرطة أفقية يعني للبيانات. فحسبت القيمة مع اختبار "مجموع الدرجة الرتبي" غير حدودي. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> الفيديو رقم 1: نشر Lm داخل الخلايا (القناة الحمراء) عن طريق أحادي الطبقة خلية هميك-1 (المرحلة) المصنف على الركازة 3-الجيش الشعبي الكوري- الخلايا تم تصويرها في وسائط الإعلام L-15 ليبوفيتش في (10% FBS، 20 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين) داخل دائرة للبيئة اكويليبراتيد إلى 37 ˚C. وجمعت الصور كل 5 دقائق. سرعة الفيلم 15 الإطارات/س. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> الفيديو رقم 2: نشر Lm داخل الخلايا (القناة الحمراء) عن طريق أحادي الطبقة خلية هميك-1 (المرحلة) المصنف على الركازة 70-الجيش الشعبي الكوري- الخلايا تم تصويرها في وسائط الإعلام L-15 ليبوفيتش في (10% FBS، 20 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين) داخل دائرة للبيئة اكويليبراتيد إلى 37 درجة مئوية. وجمعت الصور كل 5 دقائق. سرعة الفيلم 15 الإطارات/س. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>معامل يونغ (ه، الجيش الشعبي الكوري)</td>
			<td>الاكريلاميد في المائة (من الأسهم 40%)</td>
			<td>% بيساكريلاميدي (من الأسهم 2%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.6</td>
			<td>3</td>
			<td>0.045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0.195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
</tbody></table> الجدول 1. تكوين الهلاميات المائية polyacrylamide (السلطة الفلسطينية) من صلابة متفاوتة. في هذا الجدول، النسبة المئوية للأسهم 40% الاكريلاميد الحل والنسبة المئوية للأسهم 2% مكررا-مادة اكريلاميد حل لتحقيق صلابة معينة (معامل يونغ، ﻫ) ترد في أعمدة مختلفة.
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> مواد تكميلية 1. عملية حسابية للتوتر داخل الخلايا من تشدد محتسب الجر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

وقد وضعنا مقايسة المستندة إلى بولياكريلاميدي تنسيق متعدد جيدا لسبر تأثير صلابة المصفوفة خارج الخلية على العدوى البكتيرية من الخلايا ملتصقة. هذا التحليل متوافق مع التدفق الخلوي، وإيمونوستينينج، ومجهر القوة الجر، مما يسمح للقياسات الكمية للنشاط الحيوي تفاعلات بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية، والبكتيريا المسببة للأمراض.

مقايسة المستندة إلى بولياكريلاميدي تنسيق متعدد جيدا لدراسة أثر صلابة المصفوفة خارج الخلية على العدوى البكتيرية من الخلايا ملتصقة

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

A الفحص المرئي لمراقبة T6SS بوساطة المسابقة الجرثومي

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

باستخدام الكيمياء فوق لقياس تأثير عدوى فيروسية في خلية المضيف RNA التجميعي

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

التحقيق في آثار البروبيوتيك على المكورات الرئوية الاستعمار باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; الالتزام الفحص

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

تنفيذ نظام العدوى أساس إدراج-نافذ غشاء لدراسة آثار يفرز البكتيرية السموم على خلايا المضيف الثدييات

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

فحوصات لدراسة دور فيترونيكتين في التصاق البكتيريا ومقاومة المصل

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

توسع الأوعية السفن المعزولة وعزل مصفوفة خارج الخلية من الفئران ضيق الجلد

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

بروتوكولات للتحقيق في توزيع الأنسجة المضيف، نقل واسطة، وتأثير ذلك على الرشاقة المضيف من Densovirus في دودة اللوز القطن

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...