Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

Vores tak til M. sidefod, R. Lamason, M. Rengaranjan og medlemmer af Theriot Lab for deres diskussioner og eksperimentel understøttelse. Dette arbejde blev støttet af NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam Fellowship for Advanced Study (F.E.O.), Stanford Graduate stipendium (F.E.O.) og American Heart Association (E.E.B.). Flowcytometri blev udført på Stanford delt FACS facilitet.

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Celler kan fornemme en række fysiske miljømæssige stikord, som kan påvirke cellernes morfologi, men også deres gen udtryk og protein aktivitet, hvilket påvirker afgørende celle funktioner og adfærd,45,46. Stivhed af ECM celler er i stigende grad værdsat som et vigtigt modulator af cellulære motilitet, differentiering, spredning og i sidste ende celle skæbne47,48,49. Selv om der har været mange de seneste fremskridt i forståelsen af komplekse biomekaniske interaktion mellem celler og deres ECM, er lidt kendt om hvordan miljømæssige stivhed påvirker modtagelighed af celler til bakteriel infektion. For at lette sådanne undersøgelser, udviklet vi denne nye multi godt analyse baseret på den veletablerede fabrikation af polyacrylamid hydrogels afstemmelige stivhed, som er kompatibel med infektion assays50. Traditionelt, er en bakteriel infektion af celler i vævskultur blevet undersøgt på glas eller polystyren overflader, der er ca 1-3 størrelsesordener stivere end de naturlige ECM mest vedhængende celler8,51. Analysen beskrives her åbner nye motorveje ved at aktivere studiet af bakterier-værtssammenspil i en fysiologisk relevante miljømæssige stivhed regime.
Til bevis for begrebet præsenteres analysen blev HMEC-1 celler valgt som model vedhængende værtsceller og Lm som en model bakteriel patogen. Analysen kan dog forlænges for yderligere undersøgelser, hvis passende modificeret. Sådanne undersøgelser kan omfatte infektion af forskellige pattedyr vedhængende vært celletyper af yderligere patogener, herunder bakterier og vira. For denne særlige assay, gels var protein-coated med kollagen jeg, men afhængigt af værten celletype, er det muligt at bruge en anden ECM protein-belægning, såsom laminin eller fibronektin, at lette udlæg i værtsceller af interesse på hydrogel 52. en yderligere overvejelse, der afhænger af værten celletype er rækken hydrogel stivhed skal undersøges. Rækken af stivhed bør afhænge af hvad er fysiologisk relevante for den specifikke vært celletype og hvor godt at vært lægger danner en éncellelag på en given stivhed hydrogel. Ligeledes, afhængigt af model patogenet ønskede at blive undersøgt, mindre ændringer muligvis skal gennemføres på infektion analysen beskrevet heri.
Innovation af analysen i forhold til tidligere metoder til fremstilling polyacrylamid hydrogels24,50,53 ligger i visse unikke funktioner integreret i den foreslåede infektion assay. Først, hydrogels er bygget på flere godt glas bundplade, som gør det muligt for screening af flere betingelser samtidig samt automatisering af visse procedurer. Overvåger flere betingelser på samme tid eller undersøge flere gentagelser er afgørende, da resultatet af en sådan fremgangsmåde kan være påvirket af faktorer såsom vært celle passage og den præcise antal bakterier tilføjet for at inficere værter, som ofte ændre mellem uafhængige forsøg. En ekstra unik funktion af denne analyse er, at hydrogels har en højde på cirka 40 µm, som er tynd nok til at billedet ved hjælp af konventionelle mikroskopi. Vi viste, at vi med succes kan udføre både levende celle mikroskopi og celle fiksering og immunfarvning efterfulgt af imaging, uden at indføre høje baggrund fluorescens. Endelig, hydrogels er fremstillet af to lag, med den øverste have indlejret fluorescerende microbeads, indespærret i en enkelt fokalplan. Denne attribut sikrer, at der vil være nogen out-of-fokus lys indblanding under imaging. Tilstedeværelsen af perlerne kan både gennemgangen af den overflade topografi af gel til at sikre, at de er ensartede og forbedrer ydeevnen af TFM og MSM24,32,41. Med TFM og MSM er det muligt at beregne de celle-ECM og cell-celle kræfter henholdsvis celler bosat på varierende stivhed matricer. Med denne roman assay, er det muligt at foretage sådanne målinger af fysiske kræfter ved at sammenligne både bidrag af miljømæssige stivhed og infektion samtidigt. Efter en sådan fremgangsmåde har virkning infektion på vært celle mekanik i hele sit løb kan bestemmes. Desuden udviklingen af de intracellulære belastninger af celler kan beregnes ved hjælp af MSM og kan bruges som en foranstaltning af barriere integriteten af éncellelag. Endelig, da multi godt af analysen, det er muligt at samtidig indføre farmakologiske og genetiske forstyrrelser med en bakteriel infektion, at undersøge mere indgående komplekse samspillet mellem vært celle mekanik og infektion.
En iboende begrænsning af teknikken, der ligger i effekt substrat stivhed kan have om spredning sats af celler. Typisk, i infektion assays, vi skal sikre, at host celle tæthed under forskellige betingelser er de samme. Det er fordi celle tæthed i sig selv kan have en effekt på modtagelighed af værter til infektion. HMEC-1 celler, der blev brugt som værtsceller viser ikke en signifikant forskel i deres antal, når frøet i 24 timer på hydrogels. Dog kan forskellige celletyper udviser differential spredning, afhængigt af hydrogel stivhed, der kan bias infektion undersøgelser. Ligeledes kan infektion bias opstår, når cellerne ikke danne encellelag eller Monter ikke godt på hydrogels, som opstår, når visse celletyper udsås på meget blød matricer (fx, menneskelige navlestrengen endotelceller eller Madin-Darby canine nyre epitelceller seedede på 0,6-kPa hydrogels54,55). Så vidt angår patogener visse bakterier (fx, Borrelia burdgorferi) kan vedhæfte på vært celler og invadere dem men kan også transmigrate gennem dem56. Vi har endnu ikke testet hvis dette assay ville arbejde for patogenet transmigration undersøgelser, men det synes muligt, da tidligere undersøgelser af neutrofiler transmigrating endotelceller seedede på PA hydrogels har dokumenteret for at arbejde med succes57. Der har været masser af undersøgelser viser hvordan man fremstiller polyacrylamid hydrogels af en bestemt Youngs modulus ved at blande de relevante koncentrationer af acrylamid og bis-acrylamid24,25,26 ,27. Især når man ønsker at udføre TFM eksperimenter på celler bosat på hydrogels af varierende stivhed, er det imidlertid afgørende at bekræfte den forventede stivhed af hydrogels enten gennem AFM eller andre indrykning teknikker58. Mindre afvigelser fra den forventede værdi kan opstå på grund af forskellige opløsningsmiddel anvendes eller en stamopløsning, hvis alderen acrylamid, eller af måder AFM målinger er udført (f.eks.figur af AFM tip). Endelig er tilgang præsenteres heri baseret på såning værtsceller på 2D matricer, som eventuelt kan afvige fra en mere realistisk og fysiologisk relevante 3D scenario. Men fremstiller 3D geler med afstemmelige stivhed, såning dem med værtsceller og derefter inficerer dem med patogener, stadig omfatter visse tekniske vanskeligheder. Ikke desto mindre forventer vi, at vi i den nærmeste fremtid vil være stand til at udvide den nuværende assay for at studere infektion i 3D omgivelser.
Sammenfattende beskrevet protokollen sammen med de foreløbige resultater fremlægge bevis at denne roman assay kan blive et ekstremt nyttigt værktøj til at studere infektion af vedhængende værtsceller med patogene bakterier i en kvantitativ mode og meget mere fysiologisk relevante miljø end tidligere undersøgt. Magt opdigte polyacrylamid hydrogels i den foreslåede setup ligger i, at analysen er kompatibel med udførelsen af flere teknikker såsom flowcytometri, immunfarvning efterfulgt af lysmikroskopi og trækkraft kraft mikroskopi. Analysen kan anvendes til undersøgelser der involverer infektion af forskellige vedhængende vært celletyper af patogener, som vi forventer vil have en betydelig indvirkning i både optrævler strategier som patogener inficere værter og lette udviklingen af terapeutiske indgreb mod infektioner.

Celler i de fleste dyrevæv er typisk vedhængende, både tilstødende celler og deres ekstracellulære matrix (ECM). Forankring af celler til deres ECM er kritiske for mange cellulære processer lige fra celle motilitet til celle spredning og overlevelse1,2. Cellulære anchorage til ECM afhænger både af ECM sammensætning og stivhed. Celler reagerer på ændringer i sidstnævnte af dynamisk re-arrangere deres cytoskeleton, celle-ECM og cell-celle sammenvoksninger, som til gengæld kritisk ændre celle biomekanik og funktioner3,4,5,6 . ECM stivhed kan variere i rummet (dvs., anatomiske placering), tid (dvs., aldring) og patofysiologiske processer (f.eks., åreforkalkning, kræft, infektioner, osv.). For eksempel er det almindeligt accepteret at endothelial celler bosat på stivere-i forhold til blødere-matricer udøve øget styrker deres ECM og hinanden og udviser øget motilitet og spredning7,8. Ligeledes fibroblaster bosat på stivere matricer give høj kontraktile styrker til deres ECM og vise øget spredning, motilitet og ECM produktion9,10,11. Selv om celle mekanik og svar på ECM stivhed er blevet undersøgt udførligt for forskellige celletyper, forholdet mellem vedhængende værtsceller, er stivhed af deres ECM, og bakterielle infektioner stadig stort set ukendt.
For at undersøge rollen for ECM stivhed i bakterier-værtssammenspil celle, blev L. monocytogenes (Lm) valgt som model patogenet. LM er en allestedsnærværende fødevarebårne bakterie, der kan forårsage systemisk infektion i en bred vifte af pattedyr værter. Denne fakultativ intracellulære patogenet kan flytte fra den intestinale epitel til fjerntliggende organer ved gennemkører forskellige typer af vaskulære endothelia. Hvis det krænker blod - hjerne barrieren, Lm kan forårsage meningitis, og når den krydser placenta, kan det medføre spontan abort12,13. LM kan inficere forskellige vært celletyper og kan gøre det ved hjælp af forskellige patogene strategier. LM infektion er blevet undersøgt for det meste i forbindelse med epitelceller, mens langt mindre vides om hvordan Lm kan inficere og bypass endothelial celler foring lumen af blodkar14,15,16. Desuden, det er stadig stort set ukendt, hvordan stivhed af ECM hvor endotelceller bor modulerer LMS evne til at invadere disse værtsceller og derefter sprede. LM og flere ekstra bakteriel arter (dvs., Rickettsia parkeri) drage fordel af actin cytoskelettet af værten celler de inficerer både invadere i deres cytoplasma og lette celle til celle formidling17 , 18 , 19. de opnå dette gennem udtryk af proteiner, der kunne forstyrre vært actin polymerisering veje og producere actin komet haler, at lette deres fremad fremdrift16,20. Som følge af infektion skal cellen vært actin cytoskeleton dynamisk flytte rundt på en måde, der er stadig ikke fuldt karakteriseret, potentielt påvirker biomekanik af værtsceller, herunder de fysiske kræfter de lægge på deres ECM og på hver andre. For at undersøge disse processer, menneskelige mikrovaskulære endotelceller (HMEC-1) blev valgt som model værtsceller af tre grunde: 1. endotelceller er kendt for at være meget mechanosensitive som de konstant er udsat for forskellige fysiske stikord21; 2. strategier Lm beskæftiger for at inficere endotelceller er stadig stort set ukendt22; og 3. HMEC-1 kan er en udødeliggjort cellelinie og, derfor nemt dyrkes og udsat for genmanipulation.
Bakteriel infektion i værtsceller har for det meste været undersøgt in vitro- ved såning celler på glas eller polystyren substrater, der er betydeligt hårdere end de fleste celler12,14,23fysiologiske ECM. At undersøge infektion af celler seedede på en matrix, hvis stivhed er fysiologisk relevante og at belyse rollen af ECM stivhed på infektion af celler af bakterielle patogener, fulgte vi en innovativ tilgang baseret på opdigte tynd microbead-embedded polyacrylamid hydrogels afstemmelige stivhed på multi godt plader. Nyhed af den foreslåede tilgang ligger i, at det giver mulighed for overvågning flere betingelser samtidig på grund af dens multi godt format og i, at det er kompatibelt med flere teknikker på grund af den særlige måde, substraterne er bygget. HMEC-1 celler var seedet på disse protein-coated hydrogels og derefter inficeret med forskellige Lm stammer, der enten bliver fluorescerende på internalisering eller er constitutively fluorescerende. Rollen af ECM stivhed på infektion modtagelighed af vært HMEC-1 celler blev evalueret ved flowcytometri. Derudover immunfarvning og Fluorescens mikroskopi blev brugt til at skelne mellem vedhængende og internaliseret bakterier. Endelig, trækkraft kraft mikroskopi (TFM) blev med held udført for at karakterisere effekten af Lm infektion på trækkraft understreger, at værten endotelceller øve på deres matricer under infektion. Præsenteres analysen kan let modificeret til at give yderligere undersøgelser af virkningen af ECM stivhed på infektion modtagelighed for vedhængende celler ved hjælp af forskellige cellelinjer eller patogener.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

Ekstracellulær matrix stivhed består en af de flere miljømæssige mekaniske stimuli, der er kendt for at påvirke cellulære adfærd, funktion og skæbne i almindelighed. Selv om stadig flere vedhængende celletyper svar til matrix stivhed er blevet karakteriseret, hvordan tilhænger cellernes følsomhed over for bakteriel infektion afhænger matrix stivhed er stort set ukendt, som er effekten af bakteriel infektion på den biomekanik af værtsceller. Vi hypotesen, at modtagelighed i endothelial værtsceller til en bakteriel infektion afhænger stivhed matrix som disse celler opholde sig, og at infektion af værten celler med bakterier vil ændre deres biomekanik. For at teste disse to hypoteser, blev endotelceller brugt som model værter og Listeria monocytogenes som en model patogen. Ved at udvikle en roman multi godt format assay, viser vi, at effekten af matrix stivhed på infektion i endothelial celler af L. monocytogenes kan vurderes kvantitativt gennem flowcytometri og immunfarvning efterfulgt af mikroskopi. Derudover kan benytter trækkraft force mikroskopi, effekten af L. monocytogenes infektion på vært endotel celle biomekanik blive undersøgt. Den foreslåede metode giver mulighed for analyse af effekten af væv-relevante mekanikere på bakteriel infektion af vedhængende celler, som er et afgørende skridt mod forståelse de biomekaniske interaktion mellem celler, deres ekstracellulære matrix, og sygdomsfremkaldende bakterier. Denne metode er også gældende for en bred vifte af andre typer af undersøgelser på celle biomekanik og svar til substrat stivhed hvor det er vigtigt at være i stand til at udføre mange gentagelser parallelt i hvert forsøg.

ECM stivhed-afhængige modtagelighed af HMEC-1 celler til Lm infektion: PA hydrogels af varierende stivhed, alle overflade-belagt med kollagen jeg, blev bygget på flere godt glas bundplade, som beskrevet i trin 1 i protokollen (Se figur 1). AFM målinger blev udført for at bekræfte den nøjagtige stivhed af hydrogels, som tidligere beskrevet26,27 (Se figur 2). Tidligere undersøgelser har vist, at den lokale overholdelse af basalmembranen i endothelial celler kan variere fra 1 kPa (fx, hjernevæv) til 70 kPa (fx, aorta)36,37,38, 39 , 40. Derfor valgte vi at teste infektion af HMEC-1 celler bosat på matricer med følgende stivhed: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa og 70 kPa. For hver hydrogel stivhed, blev seks hydrogels fabrikeret for at vurdere reproducerbarhed af resultaterne.
Flowcytometri blev brugt til at vurdere den ECM stivhed-afhængige modtagelighed af HMEC-1 celler til Lm infektion (Se figur 3). HMEC-1 celler var smittet med en Lm stamme (JAT985), der udtrykker en fluorescerende markør efter internalisering (actAp::mTagRFP), giver mulighed for påvisning af intracellulære bakterier kun (Se figur 1 L - 1N). JAT985 mangler også ActA, forhindrede bakterier i at sprede sig fra celle til celle, da ActA er nødvendigt for dannelsen af actin komet haler og efterfølgende bakteriel formidling. 7 - 8 h efter infektionen, HMEC-1 celler infektion blev vurderet ved hjælp af flowcytometri. For at sikre, at analysen af enkelt celler, hovedparten af fordelingen af celletal var gated bruger frem versus side scatter plot, og derefter en anden gating skridt blev udført for at udelukke celler, der udviser autofluorescence (Se tal 3A - 3 C ). De foreløbige resultater, der er afbildet i figur 3 viser, at HMEC-1 infektion med Lm ca to gange større for HMEC-1 celler bosiddende på de stive 70 kPa hydrogels i forhold til cellerne bosiddende på de bløde 0,6 kPa hydrogels (Se tal 3B - 3D). øget Lm infektion modtagelighed af HMEC-1 celler bosat på stive i forhold til bløde matricer kunne være grund til: 1. øget Lm vedhæftning på HMEC-1; 2. øget Lm invasion i HMEC-1; eller 3. begge de ovenstående Co-forekommende. For at teste hvilken hypotese holder, HMEC-1 celler var seedet på soft (3 kPa) og stiv (70 kPa) hydrogels og inficeret med constitutively normal god landbrugspraksis udtrykker Lm (Se tal 4A - 4 C). Prøverne blev fastsat kort efter infektion og de eksterne (vedhængende) bakterier blev plettet af antistoffer. Ved hjælp af kvantitative mikroskopi, fandt vi, at der er betydeligt flere bakterier tilslutte sig HMEC-1, når værtsceller opholde sig på stive i forhold til blød gel (Se figur 4D). Overensstemmelse med flow flowcytometri data, der er betydeligt flere bakterier internaliseret af HMEC-1, når værtsceller opholde sig på stive i forhold til blød gel (Se figur 4E). Dog invasion effektivitet (bakterier internaliseret/samlet antal bakterier) af Lm til HMEC-1 celler er den samme, uanset substrat stivhed (Se figur 4F).
Trækkraft force mikroskopi af Lm-inficeret HMEC-1 celler: LM infektion af HMEC-1 celler kunne ændre biomekanik af inficerede værtsceller, herunder styrken af tilknytning til deres ECM eller til hinanden, påvirker deres barriere integritet. Vi forsøgte at vurdere, om det kunne være tilfældet ved hjælp af trækkraft Force mikroskopi32 til at beregne de celle-ECM trækkraft styrker og éncellelag Stress mikroskopi41 til at beregne de intracellulære tensional styrker. Figur 5 viser kort over deformation felt, trækkraft stress felt og intracellulære spændinger inden for HMEC-1 celler bosat på 20-kPa hydrogels på forskellige tidspunkter point efter infektionen. Tal 5A - 5 D refererer til ikke-inficerede kontrol HMEC-1 celler, mens tallene 5E - 5 H refererer til HMEC-1 celler inficeret med Lm på en mangfoldighed af infektion lig med 300 bakterier/celle. Dette indledende arbejde tyder på, at inficerede HMEC-1 celler reducere størrelsen af deres celle-ECM og intracellulære understreger i løbet af en infektion med Lm, der henviser til, at der ikke er observeret for ikke-inficerede kontrol celler.
ECM stivhed-afhængige Lm udbredelse på tværs af HMEC-1 encellelag: Time-lapse mikroskopi blev brugt til at undersøge effekten matrix stivhed har på Lm formidling gennem HMEC-1 monolag. Da Lm spredes gennem éncellelag, skabe bakterier fokus på infektion, der vokser som funktion af tiden (Se figur 6A og Video tallene 1 og 2). Området af infektion fokus blev målt ved at tegne en konvekse skrog, den mindste konvekst polygon, der omfatter et sæt punkter, omkring bakterier42. Der er ingen standard metrisk i feltet for at måle effektiviteten af L. monocytogenes celle til celle spredning gennem en éncellelag af værtsceller. For at vurdere spredningen effektivitet, nogle har optalt antal værtsceller i en infektion fokus41, og andre har trukket grænserne manuelt omkring gruppen af infektion vært celler43. Vi har valgt at tegne et konvekst polygon omkring bakterier, fordi det er en automatiseret, konsekvent og beregningsmæssigt billig proces til at måle effektiviteten af L. monocytogenes spredning. Dermed, fandt vi en mindre nedgang i infektion fokusområde i HMEC-1 celler seedede på 70 kPa hydrogels sammenlignet med dem seedede på 3 kPa matricer (Se figur 6B og Video tallene 1 og 2). For at bestemme væksten af infektion fokus, var den radiale afstand afbildet som en funktion af tid ved at tage kvadratroden af området i infektion fokus og dividere det med pi. Denne matematiske transformation forudsætter, at formen af infektion fokus er nogenlunde cirkulær44. For at måle hastigheden af fokus vækst, blev antallet af ændring (dvs., skrænten) af den radiale afstand til både 3 og 70 kPa matricer målt. Denne tilgang belyst, at infektion fokus voksede hurtigere og monoton i HMEC-1 celler seedede på 3-kPa matricer. Imidlertid voksede fokus betydeligt langsommere (første 200 min.) og lidt langsommere (200 til 600 min) i celler seedede på 70 kPa matricer (Se figur 6C). Faktisk analyse af yderligere data bekræftede, at infektion fokus voksede, i gennemsnit to gange langsommere i 70-kPa matricer, især i de første 200 min. (Se figur 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> Figur 3 : ECM stivhed-afhængige modtagelighed af HMEC-1 celler til Lm invasion målt ved hjælp af flowcytometri .  HMEC-1 celler blev smittet med Lm (JAT985) og infektion blev analyseret ved flowcytometri. A. Dette panel viser en side versus forward scatter plot for repræsentative HMEC-1 celler kommer fra en enkelt brønd. Bulk fordelingen af celler blev udvalgt via gating for at udelukke vragrester (venstre) og celle dubletter eller trillinger (til højre). B. denne graf viser et histogram over logaritmen af Lm fluorescens intensitet pr. celle for HMEC-1 forgyldt på bløde 0,6 kPa. C. denne graf viser et histogram over logaritmen af Lm fluorescens intensitet pr. celle til HMEC-1 forgyldt på stiv 70 kPa hydrogels. Histogrammer for N = 4-6 gentagelser er vist i forskellige farver. Kontrol inficerede celler histogrammet er lilla. Porten bruges til at definere, hvad er inficeret er vist med rødt. MOI er 100 og infektionen var vurderet 8 h efter infektionen. D. Data viser procentdelen af inficerede celler, HMEC-1 versus hydrogel stivhed (N = 5). De vandrette bjælker skildrer de data nedrig. P-værdi blev beregnet med den ikke-parametrisk Wilcoxon rang summen test. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> Video figur 1: formidling af intracellulære Lm (røde kanal) gennem en HMEC-1 cell éncellelag (fase) seedede på en 3-kPa substrat. Cellerne blev afbildet i Leibovitz's L-15 medier (10% FBS, 20 µg/mL af gentamicin) indeni en miljømæssig kammer ekvilibreres til 37 ˚C. Billederne blev indsamlet hvert 5 min. Film hastighed er 15 frames/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> Video figur 2: spredning af intracellulære Lm (røde kanal) gennem en HMEC-1 cell éncellelag (fase) seedede på 70 kPa substrat. Cellerne blev afbildet i Leibovitz's L-15 medier (10% FBS, 20 µg/mL af gentamicin) indeni en miljømæssig kammer ekvilibreres til 37 ° C. Billederne blev indsamlet hvert 5 min. Film hastighed er 15 frames/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Young's modulus (E, kPa)</td>
			<td>Acrylamid % (fra 40% stock)</td>
			<td>Bisacrylamide % (fra 2% stock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,6</td>
			<td>3</td>
			<td>0,045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0.195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
</tbody></table> Tabel 1. Sammensætning af polyacrylamid (PA) hydrogels af varierende stivhed. i denne tabel, procentdel af stock 40% acrylamid løsning og procentdelen af lager 2% bis-acrylamid løsning til at opnå en given stivhed (Youngs modulus, E) er angivet i forskellige kolonner.
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> Supplerende materiale 1. Beregning af intracellulære spændinger fra beregnede trækkraft understreger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Vi har udviklet en multi godt format polyacrylamid-baseret analyse for sondering effekten af ekstracellulære matrix stivhed på bakteriel infektion af vedhængende celler. Denne analyse er kompatibel med flowcytometri, immunfarvning og trækkraft force mikroskopi, giver mulighed for kvantitative målinger af de biomekaniske interaktion mellem celler, deres ekstracellulære matrix og sygdomsfremkaldende bakterier.

En multi godt Format polyacrylamid-baseret analyse for at undersøge effekten af ekstracellulære Matrix stivhed på bakteriel infektion af vedhængende celler

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

En Visual analysen til overvågning T6SS-medieret bakteriel konkurrence

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Brug Klik Chemistry at måle effekten af ​​Viral infektion på Host-celle RNA-syntese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersøge effekterne af probiotika på Pneumokok Colonization Brug af en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adhærenceprøven

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

At analysere virkningen af ​​stromacellers om ansættelse af Leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementering af en permeabel membran Insert-baserede infektion System at studere virkningerne af udskilt bakterielle toksiner på pattedyrværtsceller

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Assays til at studere rollen, som Vitronectin i bakteriel adhæsion og Serum modstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilation af isoleret Fartøjer og isoleringen af ​​den ekstracellulære matrix af Tight-hud Mus

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Protokoller til Undersøgelse af Host-væv Distribution, Transmission-tilstand, og Effekt på Host Fitness af en densovirus i bomuldsfrøkapselorm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...