Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

Onze dank aan M. voettekst, R. Lamason, M. Rengaranjan en leden van de Theriot Lab voor hun discussies en experimentele ondersteuning. Dit werk werd gesteund door NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), de HHMI Gilliam Fellowship voor geavanceerde studie (F.E.O.), de Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) en de American Heart Association (E.E.B.). Stroom cytometry werd uitgevoerd op de Stanford gedeeld FACS faciliteit.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Cellen kunnen een verscheidenheid van fysieke milieu signalen, waardoor niet alleen de cellen morfologie, maar ook hun gen expressie en eiwit activiteit, waardoor dus kritisch cel functies en gedrag45,46kunt voelen. De stijfheid van de ECM van cellen wordt steeds meer gewaardeerd als een belangrijke modulator van cellulaire motiliteit, differentiatie, proliferatie, en uiteindelijk cel lot47,48,49. Al zijn er vele recente vooruitgang in het begrip van de complexe biomechanische interactie tussen cellen en hun ECM, is weinig bekend over hoe milieu stijfheid is van invloed op de gevoeligheid van cellen voor bacteriële infectie. Ter vergemakkelijking van dergelijke studies, ontwikkelden we deze roman multi goed test gebaseerd op de reeds lang gevestigde fabricage van polyacrylamide hydrogels afstembare stijfheid die verenigbaar met de infectie testen50 is. Traditioneel, is een bacteriële infectie van cellen in de weefselkweek onderzocht op glas of polystyreen oppervlakken die ongeveer 1-3 ordes van grootte stijver dan de natuurlijke ECM van meest Adherente cellen8,51 zijn. De hier beschreven test opent nieuwe snelwegen doordat de studie van bacteriën-gastheer interacties in een fysiologisch relevante milieu stijfheid regime.
Voor het bewijs van concept van de voorgestelde bepaling, werden HMEC-1 cellen gekozen als model aanhangend gastheer cellen en Lm als een model bacteriële ziekteverwekker. De bepaling kan echter worden verlengd voor verdere studies, als op de juiste manier gewijzigd. Dergelijke studies kunnen betrekking hebben op besmetting van andere zoogdieren aanhangend host celtypes door extra ziekteverwekkers, zoals bacteriën en virussen. Voor deze bijzondere assay, gels zijn eiwitten-bedekt met collageen ik, maar het is afhankelijk van het celtype host, kunt u gebruik maken van het eiwit van een verschillende ECM-coating, zoals laminin of fibronectin, ter vergemakkelijking van de bijlage van de cellen van de gastheer van de rente over de hydrogel 52. een aanvullende vergoeding die afhankelijk van het celtype host is het bereik van de stijfheid hydrogel worden bestudeerd. Het bereik van stijfheid moet afhangen van wat is fysiologisch relevant voor de specifieke host celtype en hoe goed die host hecht een enkelgelaagde vormen op een bepaalde stijfheid hydrogel. Ook, afhankelijk van het model pathogen wensten te worden onderzocht, lichte wijzigingen mogelijk moet worden toegepast op de bepaling van de infectie die hierin worden beschreven.
De innovatie van de bepaling in vergelijking met de vorige methoden voor productie polyacrylamide hydrogels24,50,53 in bepaalde unieke functies ligt geïntegreerd in de bepaling van de voorgestelde infectie. Ten eerste zijn de hydrogels gebouwd op multi goed onder glasplaten, waarmee de screening van meerdere voorwaarden gelijktijdig evenals de automatisering van bepaalde procedures. Monitoring meerdere voorwaarden op hetzelfde moment of meerdere replicatieonderzoeken is van cruciaal belang omdat de uitkomst van een dergelijke aanpak kan worden beïnvloed door factoren zoals de ontvangende cel passage en het precieze aantal bacteriën toegevoegd aan het infecteren van de gastheren te onderzoeken, die vaak wijzigen tussen onafhankelijke experimenten. Een extra bijzonderheid van deze bepaling is dat de hydrogels een hoogte van ongeveer 40 µm hebben, die is dun genoeg om het imago met behulp van klassieke microscopie. We toonden dat we met succes uitvoeren kunnen levende cel microscopie en fixatie van de cel zowel immunokleuring gevolgd door imaging, zonder hoge achtergrond fluorescentie. Tot slot de hydrogels bestaan uit twee lagen, met de bovenste plaat fluorescerende microbeads, opgesloten in een enkele brandvlak hebben ingesloten. Dit kenmerk zorgt ervoor dat er geen out-of-focus licht mengen tijdens imaging. De aanwezigheid van de parels kan zowel het onderzoek naar de oppervlakte topografie van de gels om ervoor te zorgen dat ze zijn uniform en verbetert de prestaties van TFM en MSM24,32,41. Met TFM en MSM is het mogelijk om te berekenen van de cel-cel en cel-ECM krachten respectievelijk van cellen die zich op verschillende stijfheid matrices. Met deze nieuwe test, is het mogelijk te maken van dergelijke metingen van fysieke krachten door het vergelijken van beide de bijdrage van milieu stijfheid en infectie gelijktijdig. Na een dergelijke aanpak, de infectie effect heeft op de gastheercel mechanica in haar loop kan worden bepaald. Bovendien, de evolutie van de intracellulaire stress van cellen kan worden berekend met behulp van MSM en kan worden gebruikt als een maatregel van de integriteit van de barrière van de enkelgelaagde. Tot slot, gezien de multi goed aard van de test, is het mogelijk om gelijktijdig farmacologische en genetische verstoringen met een bacteriële infectie, te onderzoeken in meer diepte het complexe samenspel tussen gastheer cel mechanica en infectie.
Een inherente beperking van de techniek in de stijfheid van de substraat effect ligt zou kunnen hebben op het tempo van de proliferatie van de cellen. Meestal in infectie testen moeten ervoor zorgen dat de celdichtheid host onder verschillende omstandigheden hetzelfde. Dat komt omdat de celdichtheid zelf kan een effect hebben op de gevoeligheid van gastheren aan infectie. De HMEC-1-cellen die werden gebruikt als gastheer cellen weergeven een significant verschil in hun nummer wanneer geplaatste gedurende 24 uur op de hydrogels niet. Verschillende soorten cellen kunnen echter differentiële proliferatie, afhankelijk van de stijfheid van de hydrogel, die kan infectie studies bias vertonen. Ook kan bias van de infectie ontstaan wanneer cellen geen monolayers vormen of koppel niet goed op de hydrogels, zoals treedt op wanneer bepaalde soorten cellen worden overgeënt op zeer zacht matrices (b.v., menselijke navelstreng endotheliale cellen of Madin-Darby canine kidney epitheliale cellen zaadjes op 0.6-kPa hydrogels54,55). Wat ziekteverwekkers betreft, bepaalde bacteriën (bijvoorbeeld Borrelia burdgorferi) kunnen koppelen naar host cellen en vallen ze maar ook via hen kunt transmigrate56. We hebben nog niet getest als deze test voor pathogen transmigratie studies zou werken, maar het lijkt mogelijk aangezien vorige studies over transmigrating endotheliale cellen ontpit op PA hydrogels neutrofielen zijn gedocumenteerd te werken succesvol57. Er zijn veel studies verricht waaruit blijkt hoe voor de vervaardiging van polyacrylamide hydrogels van een bepaalde Youngs modulus door het mengen van de juiste concentraties van acrylamide en bis-acrylamide24,25,26 ,27. Vooral wanneer een verlangens TFM experimenten uitvoeren op cellen op hydrogels verschillende stijfheid, is het echter cruciaal voor het bevestigen van de verwachte stijfheid van de hydrogels via AFM of andere inspringing technieken58. Lichte afwijkingen van de verwachte waarde kunnen ontstaan als gevolg van een ander oplosmiddel gebruikt of een stamoplossing leeftijd acrylamide, of door de manieren AFM metingen zijn uitgevoerd (bijvoorbeeldde vorm van de AFM tip). Tot slot, de hierin gepresenteerde benadering is gebaseerd op het zaaien van de cellen van de gastheer op 2D matrices, die van een realistischer en fysiologisch relevante 3D scenario afwijken kunnen. Echter omvat productie 3D gels met afstembare stijfheid, zaaien ze met cellen van de gastheer en vervolgens besmetten ze met ziekteverwekkers, nog steeds bepaalde technische problemen. Wij verwachten evenwel dat wij in de nabije toekomst kunnen uitbreiden van de huidige bepaling zullen voor de studie van infectie in een 3D omgeving.
Kortom, het beschreven protocol samen met de voorlopige resultaten bewijzen dat deze nieuwe bepaling een uiterst nuttig hulpmiddel voor de studie van infectie van aanhangend gastheer cellen met pathogene bacteriën op een kwantitatieve manier en in een nog veel meer kan worden fysiologisch relevante milieu dan eerder onderzocht. De kracht van het fabriceren van polyacrylamide hydrogels in de voorgestelde setup ligt daarin de bepaling compatibel met de prestaties van meerdere technieken zoals stroom cytometry, immunokleuring is gevolgd door de lichte microscopie en tractie kracht microscopie. De bepaling kan worden gebruikt voor studies waarbij de infectie van andere aanhangend host celtypes door ziekteverwekkers, dat wij zal hebben een aanzienlijke invloed verwachten in zowel het ontrafelen van de strategieën waarbij pathogenen infecteren hosts en bij het bevorderen van de ontwikkeling van therapeutische interventies tegen infecties.

Cellen in de meest dierlijke weefsels zijn meestal aanhangend, zowel naar naburige cellen en hun extracellulaire matrix (ECM). De ankerplaats van cellen aan hun ECM is essentieel voor veel cellulaire processen, variërend van de beweeglijkheid van cel naar cel proliferatie en survival1,2. Cellulaire bevestigingspunt aan de ECM, is afhankelijk van zowel de samenstelling van de ECM en de stijfheid. Cellen reageren op veranderingen in de laatste door dynamisch herschikken hun cytoskelet, cel-cel en cel-ECM verklevingen, die op zijn beurt kritisch cel biomechanica en functies3,4,5,6 wijzigen . ECM stijfheid kan variëren in de ruimte (dat wil zeggen, anatomische locatie) tijdig (dat wil zeggen, veroudering), en in de pathofysiologische processen (b.v., arteriosclerose, kanker, infecties, enz.). Bijvoorbeeld, het is algemeen aanvaard dat endotheliale cellen op stijver-in vergelijking met zachtere-matrices uitoefenen van grotere krachten aan hun ECM en met elkaar en vertonen verhoogde beweeglijkheid en proliferatie7,8. Evenzo fibroblasten woonachtig op stijver matrices geven hoge contractiele krachten aan hun ECM en Toon meer proliferatie, beweeglijkheid en ECM productie9,10,11. Hoewel cel mechanica en reactie op ECM stijfheid zijn uitvoerig bestudeerd voor verschillende soorten cellen, de relatie tussen aanhangend gastheer cellen, is de stijfheid van hun ECM, en bacteriële infecties nog grotendeels onbekend.
De rol van ECM stijfheid in bacteriën-gastheer interacties van de cel studeren, werd L. monocytogenes (Lm) gekozen als het model pathogeen. LM is een alomtegenwoordige voedsel bacterie die leiden systemische infectie in een breed scala aan zoogdieren hosts tot kan. Deze facultatief intracellulaire pathogenen kunt verplaatsen van het intestinaal epitheel tot verre organen door het doorlopen van de verschillende soorten vasculaire endothelia. Als het schendt de bloed - hersen barrière, Lm meningitis kan veroorzaken, en wanneer deze de placenta kruist, het kan leiden tot spontane abortus12,13. LM kan infecteren andere host celtypes en kunt doen met behulp van verschillende pathogene strategieën. LM-infectie is meestal in het kader van epitheliale cellen, onderzocht, terwijl is veel minder bekend over hoe Lm kan infecteren en rondweg endotheliale cellen voering de lumen van bloedvaten14,15,16. Bovendien, het is nog grotendeels onbekend hoe de stijfheid van de ECM waar endotheliale cellen woont moduleert Lm de mogelijkheid om te vallen van deze cellen van de gastheer en vervolgens verspreiden. LM- en verschillende extra bacteriesoorten (d.w.z., Rickettsia parkeri) te profiteren van het actine cytoskelet van de ontvangende cellen ze beide besmetten binnenvallen in hun cytoplasma en vergemakkelijken van cel naar cel verspreiding17 , 18 , 19. zij bereiken dat door middel van de expressie van eiwitten waarmee ze interfereren met host actine polymerisatie trajecten en produceren van actine komeet staarten die hun voorwaartse voortstuwing16,20te vergemakkelijken. Als gevolg van infectie moet van de gastheercel actine cytoskelet dynamisch opnieuw rangschikken op een manier die nog niet volledig wordt gekenmerkt, potentieel beïnvloeden de biomechanica van de cellen van de gastheer met inbegrip van de fysieke krachten die zij op hun ECM en op elk uitoefenen andere. Om te onderzoeken van deze processen, menselijke microvasculaire endotheliale cellen (HMEC-1) werden gekozen als model gastheer cellen om drie redenen: 1. endotheliale cellen zitten bekend voor zitten zeer mechanosensitive als ze worden voortdurend blootgesteld aan variërende fysieke signalen21; 2. de strategieën die LM hanteert ter endotheliale cellen infecteren zijn nog grotendeels onbekend22; en 3. HMEC-1 kan een vereeuwigd cellijn zijn en daarom worden gemakkelijk gekweekt en onderworpen aan genetische manipulatie.
Bacteriële infectie van cellen van de gastheer is meestal studeerde in vitro door het zaaien van de cellen op glas of polystyreen substraten die aanzienlijk stijver dan de fysiologische ECM van de meeste cellen12,14,23. De infectie van cellen zaadjes op een matrix waarvan stijfheid fysiologisch relevante is bestuderen en toelichten van de rol van ECM stijfheid op de infectie van cellen door bacteriële pathogenen, we gevolgd een innovatieve aanpak gebaseerd op het fabriceren van dun microbead-embedded polyacrylamide hydrogels afstembare stijfheid op multi goed platen. De nieuwheid van de voorgestelde aanpak ligt in die zin dat het zorgt voor de opvolging van meerdere voorwaarden gelijktijdig als gevolg van de multi goed formaat en in dat deze compatibel is met meerdere technieken als gevolg van de bijzondere manier die de substraten zijn gebouwd. HMEC-1 cellen waren ontpit op deze eiwitten-bedekt hydrogels en dan besmet met verschillende Lm-stammen die TL op internalisering geworden zijn of constitutively tl. De rol van ECM stijfheid op infectie gevoeligheid van gastheer HMEC-1 cellen werd door stroom cytometry beoordeeld. Daarnaast immunokleuring en fluorescentie microscopie werden gebruikt om de daaraan vastzittende en verinnerlijkte bacteriën van elkaar onderscheiden. Ten slotte, tractie Force microscopie (TFM) werd met succes uitgevoerd karakteriseren van het effect van Lm infectie op de tractie benadrukt dat endotheliale cellen van de gastheer uitoefenen op hun matrices tijdens infectie. De voorgestelde bepaling kan eenvoudig worden aangepast zodat verdere studies over het effect van ECM stijfheid op infectie gevoeligheid van Adherente cellen met behulp van verschillende cellijnen of ziekteverwekkers.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

Stijfheid van de extracellulaire matrix bestaat uit een van de meerdere milieu mechanische stimuli die zijn goed-gekend om te beïnvloeden cellulaire gedrag, functie en lot in het algemeen. Hoewel steeds meer aanhangend celtypes reacties op matrix stijfheid hebben gekenmerkt, hoe aanhanger cellen gevoeligheid voor bacteriële infectie is afhankelijk van stijfheid van de matrix is grotendeels onbekend, als is het effect van bacteriële infectie op de biomechanica van de cellen van de gastheer. We veronderstellen dat de gevoeligheid van de endotheliale cellen van de gastheer voor een bacteriële infectie is afhankelijk van de stijfheid van de matrix waarop deze cellen zich bevinden, en dat de infectie van de ontvangende met bacteriën cellen hun biomechanica veranderen zal. Om te testen deze twee hypothesen, werden endotheliale cellen gebruikt als model hosts en Listeria monocytogenes als een model ziekteverwekker. Door het ontwikkelen van een nieuwe multi goed formaat assay, laten we zien dat het effect van matrix stijfheid op infectie van endotheliale cellen door L. monocytogenes kwantitatief kan worden beoordeeld door middel van stroom cytometry en immunokleuring gevolgd door microscopie. Daarnaast kan gebruikt tractie kracht microscopie, het effect van L. monocytogenes infectie op host endothelial cel biomechanica worden bestudeerd. De voorgestelde methode geschikt is voor de analyse van het effect van weefsel-relevante mechanica op bacteriële infectie van Adherente cellen, die een essentiële stap naar het begrip van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix, en pathogene bacteriën. Deze methode geldt ook voor een grote verscheidenheid van andere types van studies inzake cel biomechanica en reactie op substraat stijfheid waar het is belangrijk om te kunnen vervullen vele replicatieonderzoeken parallel in elk experiment.

ECM stijfheid-afhankelijke gevoeligheid van cellen van de HMEC-1 voor Lm-infectie: PA hydrogels verschillende stijfheid, alle oppervlak-gecoat met collageen I, werden gebouwd op multi goed glazen bodem platen zoals beschreven in stap 1 van het protocol (Zie Figuur 1). AFM metingen werden uitgevoerd om te bevestigen de exacte stijfheid van de hydrogels, zoals eerder beschreven26,27 (Zie Figuur 2). Afgelopen studies hebben aangetoond dat de plaatselijke naleving van het membraan van de kelder van endotheliale cellen van 1 kPa (b.v., hersenweefsel) tot 70 kPa (b.v., aorta)36,37,38, variëren kan 39 , 40. Daarom, kozen we voor het testen van de besmetting van HMEC-1 cellen die zich op matrices met de volgende stijfheid: 0.6 kPa, 3 kPa, 20 kPa en 70 kPa. Voor elke hydrogel stijfheid, waren zes hydrogels gefabriceerd om na te gaan van de reproduceerbaarheid van de resultaten.
Stroom cytometry werd gebruikt voor het beoordelen van de gevoeligheid van de ECM-stijfheid-afhankelijke cellen van de HMEC-1 voor Lm-infectie (Zie Figuur 3). HMEC-1 cellen waren besmet met een Lm-stam (JAT985) die een fluorescerende markeerdraad na de internalisering (actAp::mTagRFP), waardoor de detectie van intracellulaire bacteriën enige (Zie figuren 1 L - 1N) uitdrukt. JAT985 ontbreekt ook ActA, het uitschakelen van de bacteriën verspreiden van cel naar cel, aangezien ActA is noodzakelijk voor de vorming van actine komeet staarten en verdere bacteriële verspreiding. 7 - 8 h na infectie, infectie van de HMEC-1 cellen werd beoordeeld met behulp van stroom cytometry. Om ervoor te zorgen de analyse van afzonderlijke cellen, was het grootste deel van de distributie van de graven van de cel gated met behulp van het doorsturen versus kant scatterplot, en vervolgens een tweede gating stap werd uitgevoerd om uit te sluiten van cellen die autofluorescence vertonen (Zie figuren 3A - 3 C ). De voorlopige resultaten afgebeeld in Figuur 3 blijkt dat HMEC-1 infectie met Lm ongeveer twee-voudige groter voor HMEC-1 cellen die zich bevinden op de stijve 70 kPa hydrogels in vergelijking met de cellen die zich bevinden op de zachte 0.6 kPa hydrogels (Zie cijfers 3B - 3D). de verhoogde vatbaarheid Lm infectie van cellen van de HMEC-1 op stijf in vergelijking met zachte matrices kan te wijten zijn aan: 1. verhoogd Lm hechting op HMEC-1; 2. verhoogde Lm invasie in HMEC-1; of 3. zowel de bovenstaande samen die zich voordoet. Om te testen welke hypothese houdt, HMEC-1 cellen waren ontpit op zachte (3 kPa) en stijf (70 kPa) hydrogels en besmet met constitutively GFP Lm uiten (Zie de figuren 4A - 4 C). De monsters werden vastgesteld kort na infectie en de externe (daaraan vastzittende) bacteriën waren bevlekt met antilichamen. Met behulp van kwantitatieve microscopie, vonden wij dat er aanzienlijk meer bacteriën vast te houden aan de HMEC-1 wanneer de cellen van de gastheer bevinden zich op stijf in vergelijking met zachte gels (Zie Figuur 4D). In overeenstemming met de stroom cytometry gegevens, zijn er beduidend meer bacteriën geïnternaliseerd door HMEC-1 wanneer de cellen van de gastheer bevinden zich op stijf in vergelijking met zachte gels (Zie Figuur 4E). Echter, de invasie efficiëntie (bacteriën geïnternaliseerd/totaal aantal bacteriën) van Lm in HMEC-1 cellen is vergelijkbaar, ongeacht substraat stijfheid (Zie Figuur 4F).
Tractie kracht microscopie van HMEC-1 Lm-geïnfecteerde cellen: LM infectie van cellen van de HMEC-1 kon de biomechanica van besmette gastheer cellen, met inbegrip van de sterkte van de bijlage aan hun ECM of aan elkaar, waardoor de integriteit van hun barrière wijzigen. Wij willen beoordelen of dat het geval kunnen zijn zou met behulp van tractie Force microscopie32 cel-ECM tractie krachten en enkelgelaagde Stress microscopie41 voor de berekening van de intracellulaire spanning krachten wilt berekenen. Figuur 5 toont kaarten van de vervorming veld, tractie stress veld en intracellulaire spanning gebied van cellen van de HMEC-1 op 20-kPa hydrogels op verschillende tijdstippen punten na infectie. Cijfers 5A - 5 D verwijzen naar niet-geïnfecteerde control HMEC-1 cellen terwijl cijfers 5E - 5 H verwijzen naar HMEC-1-cellen geïnfecteerd met Lm op een veelheid van infectie gelijk is aan 300 bacteriën/cel. Deze voorbereidende werkzaamheden suggereert dat geïnfecteerde cellen van de HMEC-1 de omvang van hun cel-ECM en intracellulaire benadrukt in de loop van een infectie met Lm verminderen, terwijl dat niet wordt waargenomen voor niet-geïnfecteerde cellen.
ECM stijfheid-afhankelijke Lm verspreiding over HMEC-1 monolayers: Time-lapse microscopie werd gebruikt voor het onderzoeken van het effect matrix stijfheid heeft op Lm verspreiding via HMEC-1 monolayers. Als Lm via de enkelgelaagde verspreidt, maken de bacteriën een focus van infectie die als een functie van de tijd (Zie Figuur 6A en Video figuren 1 en 2 groeit). Het gebied van de infectie focus werd gemeten door het opstellen van een convex omhulsel, de kleinste convexe veelhoek die een verzameling van punten, rond de bacteriën42omvat. Er is geen standaard metrische in het veld voor het meten van de doelmatigheid van L. monocytogenes cel-naar-cel verspreiding via een monolayer van cellen van de gastheer. Om te beoordelen verspreiding efficiëntie, sommige hebben het aantal cellen van de gastheer van een infectie focus41geteld, en anderen hebben getrokken grenzen handmatig rond de groep van cellen43van de gastheer van de infectie. We kozen voor een convexe veelhoek om rond te tekenen de bacteriën, omdat het is een geautomatiseerde, consistent en rekenkundig goedkope proces voor het meten van de doelmatigheid van L. monocytogenes verspreiding. Door dit te doen, vonden we een lichte daling in het focusgebied infectie in de cellen van de HMEC-1 ontpit op 70 kPa hydrogels in vergelijking met die zaadjes op 3 kPa matrices (Zie Figuur 6B en Video figuren 1 en 2). Om te bepalen van het tempo van de groei van de focus van de infectie, was de radiale afstand uitgezet als functie van de tijd door het nemen van de vierkantswortel van het gebied van de focus van de infectie en dit te delen door pi. Deze mathematische transformatie wordt ervan uitgegaan dat de vorm van de infectie focus ruwweg cirkelvormige44 is. Voor het meten van de snelheid van de groei van de focus, werd de mate van verandering (dat wil zeggen, de helling) van de radiale afstand voor beide 3 - en 70-kPa matrices gemeten. Deze benadering wordt toegelicht dat de infectie focus groeide sneller en monotoon in HMEC-1 cellen ontpit op 3-kPa matrices. Echter groeide de focus aanzienlijk langzamer (eerste 200 min) en iets trager (200 tot 600 min) in cellen ontpit op 70-kPa matrices (Zie Figuur 6C). Inderdaad, de analyse van verdere gegevens bevestigd dat de infectie focus, gemiddeld, twee-voudige langzamer in 70-kPa matrices, vooral tijdens de eerste 200 min groeide (Zie Figuur 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> Figuur 3 : ECM stijfheid-afhankelijke gevoeligheid van cellen van de HMEC-1 voor Lm invasie gemeten met behulp van stroom cytometry .  HMEC-1 cellen waren besmet met Lm (JAT985) en de infectie werd geanalyseerd door stroom cytometry. A. dit paneel toont een kant tegenover doorsturen scatterplot voor representatieve HMEC-1 cellen afkomstig van een enkele goed. De verdeling van de bulk van de cellen werd geselecteerd via gating uitsluiten van puin (links) en cel paren of drieling (rechts). B. deze grafiek ziet u een histogram van de logaritme van de intensiteit van de fluorescentie Lm per cel voor HMEC-1 verguld op zachte 0.6 kPa. C. deze grafiek toont een histogram van de logaritme van de intensiteit van de fluorescentie Lm per cel voor HMEC-1 verzinkt op stijve 70 kPa hydrogels. De histogrammen voor N = 4-6 replicatieonderzoeken worden weergegeven in verschillende kleuren. De controle niet-geïnfecteerde cellen histogram is paars. De poort gebruikt om te definiëren wat is geïnfecteerd is in rood weergegeven. De MOI is 100 en de infectie was beoordeeld 8 h na infectie. D. gegevens tonen percentage van geïnfecteerde cellen van de HMEC-1 versus hydrogel stijfheid (N = 5). De horizontale balken verbeelden de gegevens betekenen. De P-waarde werd berekend met de niet-parametrische Wilcoxon Rank-Sum test. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> Video Figuur 1: verspreiding van intracellulaire Lm (rode kanaal) door middel van een HMEC-1 cel enkelgelaagde (fase) zaadjes op een substraat 3-kPa. De cellen waren beeld in Leibovitz van L-15 media (10% FBS, 20 µg/mL gentamicine) binnen een milieu kamer geëquilibreerd aan 37 ˚C. De beelden werden verzameld elke 5 min. De snelheid van film is 15 frames/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> Video Figuur 2: verspreiding van intracellulaire Lm (rode kanaal) door middel van een HMEC-1 cel enkelgelaagde (fase) zaadjes op een substraat 70-kPa. De cellen waren beeld in Leibovitz van L-15 media (10% FBS, 20 µg/mL gentamicine) binnen een milieu kamer geëquilibreerd tot 37 ° C. De beelden werden verzameld elke 5 min. De snelheid van film is 15 frames/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Youngs modulus (E, kPa)</td>
			<td>Acrylamide % (vanaf 40% voorraad)</td>
			<td>Bisacrylamide % (vanaf 2% voorraad)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.6</td>
			<td>3</td>
			<td>0.045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0.195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
</tbody></table> Tabel 1. Samenstelling van polyacrylamide (PA) hydrogels verschillende stijfheid. In deze tabel wordt het percentage voorraad 40% acrylamide oplossing en het percentage van de stockoplossing 2% BIB-acrylamide om een bepaalde stijfheid (Youngs modulus, E) worden aangeduid in verschillende kolommen.
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> Aanvullend materiaal 1. Berekening van intracellulaire spanning van berekende tractie stress. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

We hebben een multi goed formaat polyacrylamide gebaseerde assay voor het effect van extracellulaire matrix stijfheid op bacteriële infectie van Adherente cellen indringende ontwikkeld. Deze test is compatibel met stroom cytometry immunokleuring en tractie kracht microscopie, waardoor voor kwantitatieve metingen van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix en pathogene bacteriën.

Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Na Cell-lot in<em&gt; E. coli</em&gt; Na Infectie door Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Een Visual Assay om T6SS-gemedieerde Bacteriële Concurrentie Monitor

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Onderzoek naar de effecten van probiotica op Pneumococcal Kolonisatie Met behulp van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Hechting Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Tests voor de bestudering van de rol van Vitronectin in bacteriële hechting en een Serum

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilatatie van geïsoleerde Schepen en de isolatie van de extracellulaire matrix van Tight-skin Muizen

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Protocollen voor het onderzoeken van de host-weefsel Distribution, transmissie-mode, en het effect op de Host Geschiktheid van een Densovirus in de katoenkever

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...