Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

Vielen Dank an M. Footer, R. Lamason, M. Rengaranjan und Mitglieder des Theriot Lab für ihre Diskussionen und experimentelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde von NIH R01AI036929 (J.T.A), HHMI (J.T.A), das HHMI Gilliam Stipendium für Advanced Study (F.E.O.), der Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) und der American Heart Association (E.E.B.) unterstützt. Durchflusszytometrie wurde an der Stanford geteilt FACS-Anlage durchgeführt.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Zellen spürt eine Vielzahl von physischen Umwelt Hinweise, die nicht nur die Morphologie der Zellen, sondern auch ihren Ausdruck und Protein Genaktivität, was sich auf kritische Zelle Funktionen und Verhaltensweisen45,46beeinflussen können. Die Steifigkeit des ECM der Zellen wird zunehmend als eine wichtige Modulator zellulärer Motilität, Differenzierung, Proliferation und letztlich Zelle Schicksal47,48,49geschätzt. Zwar gab es viele Fortschritte im Verständnis der komplexen biomechanischen Interaktion zwischen Zellen und ihrer ECM, ist wenig bekannt über wie die Umwelt Steifigkeit beeinflusst die Empfindlichkeit der Zellen für bakterielle Infektionen. Um solche Studien zu erleichtern, haben wir diese neuartige Multi-gut Assay basiert auf der etablierten Herstellung von Polyacrylamid Hydrogele abstimmbaren Steifigkeit, die kompatibel mit Infektion Assays50entwickelt. Traditionell ist eine bakterielle Infektion der Zellen in Zellkultur auf Glas oder Polystyrol Flächen, etwa 1-3 Größenordnungen stabiler als das natürliche ECM der meisten adhärenten Zellen8,51untersucht worden. Der hier beschriebene Test öffnet neue Autobahnen durch das Studium der Bakterien-Wirt Interaktionen in einem physiologisch relevanten ökologischen Steifigkeit Regime aktivieren.
Für Proof of Concept des vorgestellten Tests wurden HMEC-1-Zellen als Modell anhaftende Wirtszellen und Lm als ein Modell bakterielle Erreger gewählt. Der Test kann jedoch für weitere Studien verlängert werden, wenn entsprechend geändert. Solche Studien können durch weitere Krankheitserreger wie Bakterien und Viren Infektion von anderen Säugetieren anhaftende Host Zelltypen beinhalten. Für diese besondere Probe Gele wurden Protein-beschichtet mit Kollagen ich, aber je nach Host Zelle, es ist möglich, eine andere ECM-Protein-Beschichtung, z. B. Laminin oder FIBRONEKTIN, verwenden um die Befestigung der Wirtszellen auf das Hydrogel zu erleichtern 52. eine weitere Überlegung, die die Host-Zelltyp abhängig ist der Hydrogel Steifigkeit Bereich untersucht werden. Das Spektrum der Steifigkeit sollte abhängen, was für den bestimmten Host Zelltyp physiologisch relevant ist und wie gut, dass Host legt bilden eine Monolage an eine bestimmte Steifigkeit Hydrogel. Ebenso können je nach Modell Erregers untersucht werden wollte, geringfügige Änderungen auf die Infektion Assay beschriebenen umgesetzt werden müssen.
Die Innovation des Assays im Vergleich zu bisherigen Methoden zur Herstellung Polyacrylamid Hydrogele24,50,53 liegt in bestimmte Besonderheiten in der vorgeschlagenen Infektion Test integriert. Erstens sind die Hydrogele auf Multi-gut unten Glasplatten, die das Screening von mehreren Bedingungen gleichzeitig ermöglicht, sowie die Automatisierung bestimmter Verfahren gebaut. Überwachung mehrerer Bedingungen gleichzeitig oder Prüfung mehrere Wiederholungen ist entscheidend, da das Ergebnis eines solchen Ansatzes von Faktoren wie der Host-Zelle-Passage und die genaue Anzahl der Bakterien hinzugefügt, um die Wirte infizieren beeinflusst werden kann, die oft ändern zwischen unabhängigen Experimenten. Eine zusätzliche Besonderheit dieses Tests ist, dass die Hydrogele eine Höhe von etwa 40 µm haben, die ist dünn genug, um Bild mit konventionellen Mikroskopie. Wir zeigten, dass wir sowohl live Zelle Mikroskopie und Zelle Fixierung und Immunostaining gefolgt von Bildgebung, ohne dabei hohe Hintergrundfluoreszenz erfolgreich durchführen können. Schließlich bestehen die Hydrogele aus zwei Schichten, mit dem oberen fluoreszierende Microbeads, nur in einem einzigen Fokalebene eingebettet haben. Dieses Attribut wird sichergestellt, dass keine Out-of-Focus Licht während der Aufnahme stören. Die Perlen können sowohl die Prüfung der Oberflächentopographie der Gele zu gewährleisten, dass sie einheitlich sind und verbessert die Leistung der TFM und MSM24,32,41. Mit TFM und MSM ist es möglich, die Zelle-ECM und Zellezelle Kräfte bzw. der Zellen, die auf unterschiedliche Steifigkeit Matrizen zu berechnen. Mit dieser neuartigen Assay, ist es möglich, solche Messungen der physikalischen Kräfte zu machen, durch den Vergleich des Beitrags der ökologischen Steifigkeit und der Infektion gleichzeitig. Nach diesem Ansatz hat die Effekt-Infektion auf Wirtszelle, die Mechanik während seines Kurses ermittelt werden kann. Darüber hinaus die Entwicklung der intrazellulären Spannungen der Zellen kann mit MSM berechnet werden und kann als ein Maß für die barriereintegrität der Monolayer verwendet werden. Endlich, Multi-auch angesichts des Assays, ist es möglich, gleichzeitig pharmakologische und genetische Störungen mit einer bakteriellen Infektion zu eingehender untersuchen, das komplexe Zusammenspiel von Host Cell Mechanik und Infektion einzuführen.
Eine inhärente Begrenzung der Technik liegt in der Wirkung Substrat Steifigkeit kann auf die proliferationsrate der Zellen auswirken. In der Regel in Infektion Assays müssen wir sicherstellen, dass die Host-Zelldichte unter verschiedenen Bedingungen übereinstimmt. Und zwar deshalb, weil Zelldichte von selbst auf die Anfälligkeit der Gastgeber auf eine Infektion auswirken kann. Die HMEC-1-Zellen, die als Wirtszellen dienten zeigen keinen signifikanten Unterschied in ihrer Zahl, wenn für 24 h auf die Hydrogele ausgesät. Jedoch könnten verschiedene Zelltypen differenzielle Verbreitung, abhängig von der Hydrogel-Steifigkeit aufweisen, die Infektion Studien beeinflussen können. In ähnlicher Weise kann Infektion Vorurteile entstehen, wenn Zellen keine Monolagen bilden oder befestigen Sie nicht gut auf die Hydrogele, wie tritt auf, wenn bestimmte Zelltypen auf sehr weichen Matrizen (z.B., menschlichen Nabelschnur Endothelzellen oder Madin Darby canine Nieren ausgesät werden epitheliale Zellen ausgesät auf 0,6 kPa Hydrogele54,55). Krankheitserreger angeht, können bestimmte Bakterien (z.B. Borrelien-Burdgorferi) auf Anhängen Zellen zu hosten und dringen sie aber kann auch durch sie transmigrate56. Wir haben noch nicht getestet, wenn dieser Assay für Erreger Seelenwanderung Studien funktionieren würde, aber es möglich, scheint da frühere Studien zu Neutrophilen einen endotheliale Zellen ausgesät auf PA Hydrogele dokumentiert worden sind, um57erfolgreich zu arbeiten. Es wurden viele Studien durchgeführt, die zeigt, wie Polyacrylamid Hydrogele von bestimmten Elastizitätsmodul herzustellen durch Mischen der entsprechenden Konzentrationen von Acrylamid und BIZ-Acrylamid24,25,26 ,27. Vor allem, wenn man wünscht, TFM Experimente auf Zellen mit Wohnsitz auf Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit durchführen, ist es jedoch entscheidend für die erwarteten Steifigkeit der Hydrogele entweder durch AFM oder andere Einrückung Techniken58bestätigen. Geringfügige Abweichungen vom erwarteten Wert können aufgrund verschiedener Lösungsmittel verwendet oder eine Stammlösung im Alter von Acrylamid entstehen, oder durch die Art und Weise AFM sind Messungen durchgeführt (z. B.die Form der AFM-Spitze). Zu guter Letzt ist die enthaltenen Lösungsansatz Aussaat Wirtszellen auf 2D Matrizen, die sich aus einer realistischeren und physiologisch relevanten 3D Szenario unterscheiden können. Jedoch, Herstellung von 3D Gele mit einstellbaren Steifigkeit, Säen sie mit Wirtszellen und dann mit Krankheitserregern zu infizieren noch umfasst einige technischen Schwierigkeiten. Allerdings erwarten wir, dass wir in naher Zukunft in der Lage, die aktuelle Probe für das Studium der Infektion in einer 3D Umgebung erweitern werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, das beschriebene Protokoll zusammen mit den vorläufigen Ergebnissen nachweisen, dass dieser neuartige Assay ein extrem nützliches Werkzeug für das Studium der Infektion von anhaftenden Wirtszellen mit pathogenen Keimen quantitativ und in einem viel mehr werden kann physiologisch relevanten Umfeld als zuvor überprüft. Die Macht der Herstellung von Polyacrylamid Hydrogele in der vorgeschlagenen Einrichtung liegt darin, dass der Test kompatibel mit der Leistung von mehreren Techniken wie Durchflusszytometrie, Immunostaining ist gefolgt von Lichtmikroskopie und Zugkraft Mikroskopie. Der Assay Studien, an denen die Infektion von anderen anhaftende Host Zelltypen durch Krankheitserreger, einsetzbar für die erwarten wir haben erhebliche Auswirkungen sowohl entwirren die Strategien, die mit dem Erreger infizieren Gastgeber und erleichtern die Entwicklung von therapeutische Interventionen gegen Infektionen.

Zellen in den tierischen Geweben sind in der Regel anhaftenden, Anbringen von benachbarten Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM). Die Verankerung der Zellen zu ihrer ECM ist entscheidend für viele zelluläre Prozesse von Zelle Motilität, Zell-Proliferation und das Überleben1,2. Zelluläre Verankerung an das ECM richtet sich nach der ECM-Zusammensetzung und Steifigkeit. Zellen reagieren auf Änderungen in den letzteren durch dynamisch neu arrangieren ihre Zytoskelett, Zelle-ECM und Zellezelle Verwachsungen, die wiederum kritisch Zelle Biomechanik und Funktionen3,4,5,6 ändern . ECM-Steifigkeit kann im Raum (d.h., anatomische Lage) rechtzeitig (d.h., Altern) und pathophysiologische Prozesse (z.B., Arteriosklerose, Krebs, Infektionen, etc.) variieren. Zum Beispiel es ist allgemein anerkannt, dass endotheliale Zellen auf härtere-im Vergleich zu weicher-Matrizen erhöhte Kräfte an ihrer ECM und zueinander ausüben und weisen erhöhte Motilität und Verbreitung7,8. Ebenso Fibroblasten mit Wohnsitz auf härtere Matrizen hohe KONTRAKTILE Kräften für ihre ECM zu vermitteln und zeigen erhöhte Proliferation, Motilität und ECM Produktion9,10,11. Die Steifigkeit ihrer ECM und bakteriellen Infektionen ist noch weitgehend unbekannt, obwohl Zelle Mechanik und Reaktion auf ECM Steifigkeit für verschiedene Zelltypen, die Beziehung zwischen anhaftende Wirtszellen ausgiebig untersucht wurden.
Um die Rolle der ECM Steifheit in Bakterien-Host-Zell-Interaktionen zu untersuchen, wurde L. Monocytogenes (Lm) als Modell Erregers gewählt. LM ist eine allgegenwärtige lebensmittelbedingte Bakterium, das systemische Infektion in einer Vielzahl von Säugetieren Hosts führen kann. Diese fakultativen intrazellulären Erreger aus dem Darmepithel zu entfernten Organen gelangen durchlaufen verschiedene Arten von vaskulären gefäßendothelien. Wenn sie die Blut - Hirn-Schranke durchbricht, kann Lm Meningitis verursachen, und wenn sie die Plazenta kreuzt, es kann dazu führen, dass Spontanaborte12,13. LM einzelnen Host Zelltypen infizieren kann und kann mit Hilfe von verschiedenen pathogenen Strategien tun. LM-Infektion ist meist im Zusammenhang mit Epithelzellen, untersucht worden, während viel weniger bekannt ist, über wie Lm infizieren kann und Bypass Endothelzellen Futter das Lumen der Blutgefäße14,15,16. Darüber hinaus ist es noch weitgehend unbekannt, wie die Steifigkeit des ECM Endothelzellen Wohnsitz Lm die Fähigkeit, diese Wirtszellen eindringen und breitete sich dann moduliert. LM und mehrere zusätzliche Bakterienarten (d.h., Rickettsia Parkeri) nutzen Sie die Vorteile des Aktin-Zytoskeletts des Wirtes Zellen, die sie, beide infizieren dringen in ihrem Zytoplasma und Erleichterung der Verbreitung von Zelle zu Zelle17 , 18 , 19. sie erreichen, dass durch die Expression von Proteinen, die befähigen, mit Host-Aktin-Polymerisation-Wege einzugreifen und Aktin Komet Schwänzen zu produzieren, die ihren Vortrieb16,20zu erleichtern. Als Folge einer Infektion muss der Wirtszelle Aktin-Zytoskelett, dynamisch in einer Art und Weise neu zu ordnen, die noch nicht vollständig möglicherweise Auswirkungen auf die Biomechanik von Wirtszellen, die auch die physikalischen Kräfte, die sie auf ihre ECM und auf jedem ausüben gekennzeichnet ist, andere. Um diese Prozesse zu untersuchen, wurden menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen (HMEC-1) als Modell Wirtszellen aus drei Gründen gewählt: 1. Endothelzellen sind dafür bekannt, sehr Mechanosensitive sein, da sie ständig ausgesetzt sind, auf unterschiedliche körperliche Signale21; (2) die Strategien, die LM beschäftigt, um endotheliale Zellen zu infizieren, sind noch weitgehend unbekannt22; und 3. HMEC-1 können sind eine immortalisierte Zelllinie und daher problemlos kultiviert und genetische Manipulation ausgesetzt.
Bakterielle Infektion von Wirtszellen wurde meist studierte in Vitro durch impfen Zellen auf Glas oder Polystyrol Substrate, die deutlich stabiler als die physiologische ECM die meisten Zellen12,14,23. Zu prüfen, die Infektion der Zellen auf eine Matrix, deren Steifigkeit physiologisch relevanten ist, ausgesät und die Rolle der ECM Steifigkeit auf die Infektion von Zellen durch bakterielle Krankheitserreger zu erhellen, folgten wir einen innovativen Ansatz, basierend auf Herstellung dünn Microbead eingebettet Polyacrylamid Hydrogele abstimmbaren Steifigkeit auf Multi-well-Platten. Die Neuheit der vorgeschlagene Ansatz liegt, dass es ermöglicht die Überwachung mehrerer Bedingungen gleichzeitig aufgrund seiner Multi-well-Format kompatibel mit mehreren Techniken aufgrund der besonderen Art ist die Substrate baute. HMEC-1-Zellen wurden auf dieser Protein-beschichtete Hydrogele entkernt und dann mit verschiedenen Lm-Stämme, die entweder nach Internalisierung fluoreszierende oder sind konstitutiv fluoreszierend infiziert. Die Rolle der ECM Steifigkeit auf Infektion Anfälligkeit von Wirtszellen HMEC-1 wurde von Durchflusszytometrie bewertet. Darüber hinaus wurden Immunostaining und Fluoreszenz-Mikroskopie zur Unterscheidung zwischen anhaftenden und internalisierten Bakterien verwendet. Schließlich wurde Traktion Force Microscopy (TFM) erfolgreich durchgeführt, um die Wirkung von Lm-Infektion auf die Traktion betont, die dass die endotheliale Zellen ausüben auf ihre Matrizen während der Infektion zu charakterisieren. Die vorgestellte Assay kann leicht geändert werden, um weitere Studien über die Wirkung von ECM Steifigkeit auf Infektion Suszeptibilität des adhärenten Zellen mit verschiedenen Zelllinien oder Krankheitserregern ermöglichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

Extrazelluläre Matrix Steifigkeit umfasst eines der mehrere mechanische Reize aus der Umwelt, die beeinflussen zellulären Verhalten, Funktion und Schicksal im Allgemeinen bekannt sind. Obwohl immer mehr adhärente Zellen-Typen Antworten auf Matrix Steifigkeit charakterisiert wurden, wie adhärenten Zellen Anfälligkeit für bakterielle Infektion hängt von der Matrix Steifigkeit weitgehend unbekannt, wie ist die Wirkung der bakteriellen Infektion auf die Biomechanik der Wirtszellen. Wir vermuten, dass die Anfälligkeit der endothelialen Zellen zu einer bakteriellen Infektion hängt von der Steifigkeit der Matrix, auf der sich diese Zellen befinden, und dass die Infektion des Wirtes mit Bakterien Zellen ihre Biomechanik ändert. Um diese beiden Hypothesen zu testen, wurden Endothelzellen als Modell Gastgeber und Listeria Monocytogenes als ein Modell-Erreger verwendet. Durch die Entwicklung eines neuartigen Multi-well-Format-Assays, zeigen wir, dass die Wirkung von Matrix Steifigkeit auf Endothelzellen von L. Monocytogenes -Infektion durch Durchflusszytometrie und Immunostaining gefolgt von Mikroskopie quantitativ bewertet werden kann. Darüber hinaus kann mit Traktion Rasterkraftmikroskopie, die Wirkung von L. Monocytogenes -Infektion auf Host Endothelzellen Biomechanik studiert werden. Die vorgeschlagene Methode ermöglicht die Analyse der Wirkung von Gewebe-relevanten Mechanik auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, die extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien. Diese Methode gilt auch für eine Vielzahl von anderen Arten von Studien zur Zelle Biomechanik und Reaktion auf Substrat Steifigkeit wo ist es wichtig, viele Wiederholungen parallel in jedem Experiment durchführen zu können.

ECM Steifigkeit-abhängige Infektanfälligkeit HMEC-1 Zellen Lm: PA-Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit, alle Oberfläche beschichtet mit Kollagen ich, wurden auf mehreren gut Glasplatten unten gebaut, wie in Schritt 1 des Protokolls beschrieben (siehe Abbildung 1). AFM-Messungen wurden durchgeführt, um die genaue Steifigkeit die Hydrogele zu bestätigen, wie zuvor beschrieben26,27 (siehe Abbildung 2). Frühere Studien haben gezeigt, dass die lokalen Compliance der Basalmembran der Endothelzellen von 1 kPa (z.B. Hirngewebe) bis 70 kPa (z.B. Aorta)36,37,38, reichen kann 39 , 40. daher, wir entschieden uns für die Infektion von HMEC-1-Zellen mit Wohnsitz auf Matrizen mit der folgenden Steifigkeit zu testen: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa und 70 kPa. Für jede Hydrogel Steifigkeit wurden sechs Hydrogele hergestellt, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu bewerten.
Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die ECM Steifigkeit-abhängige Infektanfälligkeit HMEC-1 Zellen Lm zu beurteilen (siehe Abbildung 3). HMEC-1-Zellen wurden mit einem Lm-Stamm (JAT985) infiziert, die einen fluoreszierenden Marker nach Internalisierung (actAp::mTagRFP), so dass die Erkennung von intrazellulären Bakterien nur (siehe Abbildungen 1 L - 1N) ausdrückt. JAT985 fehlt auch ActA, die Bakterien an der Ausbreitung von Zelle zu Zelle, da ActA ist notwendig für die Bildung von Aktin Komet Endstücke und anschließende bakterielle Verbreitung zu deaktivieren. 7 - 8 Stunden nach der Infektion, Infektion der HMEC-1-Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie. Um die Analyse einzelner Zellen zu gewährleisten, wurde der Großteil der Verteilung der Zellzahlen gated, mit der nach vorn im Vergleich zu Seite Streudiagramm, und dann in einem zweiter Schritt gating wurde durchgeführt, um die Zellen ausschließen, die Autofluoreszenz aufweisen (siehe Abbildungen 3A - 3 C ). Die vorläufigen Ergebnisse, dargestellt in Abbildung 3 zeigen, dass HMEC-1-Infektion mit Lm etwa zweifach für HMEC-1-Zellen mit Wohnsitz auf dem steifen 70 kPa Hydrogele im Vergleich zu Zellen mit Wohnsitz auf dem weichen 0,6 kPa Hydrogele größer (siehe Abbildungen 3 b - 3D). Lm-Infektion zurückkehrende HMEC-1 Zellen auf steif im Vergleich zu weichen Matrizen konnte wegen werden: 1. erhöht Lm Adhäsion auf HMEC-1; 2. erhöhte Lm Invasion in HMEC-1; oder 3. beide der oben genannten Co-auftritt. Um zu testen, welche Hypothese hält, HMEC-1-Zellen wurden auf Soft (3 kPa) und steif (70 kPa) Hydrogele entkernt und infiziert mit konstitutiv GFP Lm zum Ausdruck zu bringen (siehe Abbildungen 4A - 4 C). Die Proben wurden kurz nach der Infektion fixiert und die externe (haftenden) Bakterien waren voller Flecken mit Antikörpern. Verwenden quantitative Mikroskopie, fanden wir, dass es deutlich mehr Bakterien an HMEC-1 gibt, wenn die Wirtszellen auf steif im Vergleich zu weiche Gele befinden (siehe Abbildung 4D). In Übereinstimmung mit der Förderdaten zytometrie, gibt es deutlich mehr Bakterien verinnerlicht durch HMEC-1, wenn die Wirtszellen auf steif im Vergleich zu weiche Gele befinden (siehe Abbildung 4E). Die Invasion-Effizienz (Bakterien verinnerlicht/Gesamtzahl der Bakterien) der Lm in HMEC-1-Zellen ist jedoch ähnlich, unabhängig vom Substrat Steifigkeit (siehe Abbildung 4F).
Zugkraft Mikroskopie des Lm-infizierten HMEC-1-Zellen: LM-Infektion von HMEC-1-Zellen konnte die Biomechanik des infizierten Wirtszellen, einschließlich die Stärke der Anlage zu ihrer ECM oder miteinander, beeinflussen ihre barriereintegrität ändern. Wir wollten prüfen, ob dies der Fall sein könnte, mittels Rasterkraftmikroskopie Traktion32 zur Berechnung der Zelle-ECM Zugkräfte und Monolayer Stress Mikroskopie41 , die intrazellulären Zug Kräfte zu berechnen. Abbildung 5 zeigt Karten von der Verformung Feld, Traktion Spannungsfeld und intrazellulären Spannungsfeld zwischen HMEC-1-Zellen, die auf 20 kPa Hydrogele in verschiedenen Zeit Punkte nach der Infektion. Figuren 5A - 5D beziehen sich auf nicht infizierten Kontrollzellen HMEC-1 während Zahlen 5E - 5 H beziehen sich auf HMEC-1-Zellen mit Lm bei einer Vielzahl von Infektion gleich 300 Bakterien/Zelle infiziert. Diese Vorarbeiten legt nahe, dass infizierte HMEC-1-Zellen im Verlauf einer Infektion mit Lm, das Ausmaß ihrer Zelle-ECM und intrazellulären Spannungen reduzieren während, nicht für nicht infizierte Kontrollzellen beobachtet wird.
ECM Steifigkeit-abhängige Lm Verbreitung über HMEC-1 Monolagen: Time-Lapse Mikroskopie wurde zur Untersuchung der Wirkung Matrix Steifigkeit hat auf Lm Verbreitung durch HMEC-1 Monolagen. Wie Lm durch die Monolage verbreitet, erzeugen die Bakterien einen Schwerpunkt der Infektion, die als Funktion der Zeit (siehe Abb. 6A und Video Abbildungen 1 und 2) wächst. Bereich der Infektion Fokus wurde gemessen, indem man eine konvexe Hülle, das kleinste konvexe Polygon, das eine Reihe von Punkten, um die Bakterien42umfasst. Es gibt keine standard Metrik in das Feld, um die Effizienz von L. Monocytogenes Zell-Zell-Verbreitung durch eine Monolage von Wirtszellen zu messen. Zur Beurteilung der Ausbreitung Effizienz, einige haben die Anzahl der Wirtszellen in eine Infektion Fokus41gezählt, und andere haben gezogene Grenzen manuell um die Gruppe der Infektion Host Zellen43. Wir haben ein Konvexes Polygon um die Bakterien zu ziehen, weil es eine automatisierte, konsistente und rechnerisch günstig Prozess, die Effizienz von L. Monocytogenes Ausbreitung zu messen ist. Auf diese Weise fanden wir einen leichten Rückgang der Infektion Fokusbereich in der HMEC-1-Zellen ausgesät auf 70 kPa Hydrogele, wenn im Vergleich zu denen auf 3 kPa Matrizen (siehe Abbildung 6B und Video Abbildungen 1 und 2) ausgesät. Um die Wachstumsrate der Infektion Schwerpunkt zu ermitteln, wurde der radiale Abstand als Funktion der Zeit aufgetragen, indem man die Quadratwurzel des Bereichs der Infektion Fokus und dies durch Pi dividiert. Diese mathematische Transformation wird davon ausgegangen, dass die Form der Infektion Schwerpunkt etwa kreisförmig44. Um die Geschwindigkeit des Wachstums Fokus zu messen, wurde die Änderungsrate (d.h. die Steigung) der Radialabstand für beide Matrizen 3 und 70 kPa gemessen. Dieser Ansatz erläutert, dass die Infektion Fokus schneller und monoton in HMEC-1-Zellen ausgesät auf 3 kPa Matrizen wuchs. Jedoch wuchs der Fokus deutlich langsamer (erste 200 min) und etwas langsamer (200 bis 600 min) in Zellen ausgesät auf 70 kPa Matrizen (siehe Abbildung 6C). In der Tat weitere Daten bestätigte, dass die Infektion konzentrieren, im Durchschnitt zwei-Fach langsamer 70 kPa Matrizen, vor allem während der ersten 200 min wuchs in (siehe Abbildung 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> Abbildung 3 : ECM Steifigkeit-abhängige Anfälligkeit der HMEC-1-Zellen Lm Invasion mit Durchflusszytometrie gemessen .  HMEC-1-Zellen mit Lm (JAT985) infiziert waren und die Infektion wurde durch Durchflusszytometrie analysiert. A. dieses Panel zeigt eine Seite gegen vorwärts Streudiagramm für repräsentative HMEC-1-Zellen, die aus einem einzigen Brunnen. Die Massen Verteilung der Zellen wurde ausgewählt, über gating um auszuschließen Schutt (links) und Zell-Dubletten oder Drillinge (rechts). B. dieses Diagramm zeigt ein Histogramm des Logarithmus der Fluoreszenzintensität Lm pro Zelle für HMEC-1 auf Weiche 0,6 kPa überzogen. C. dieses Diagramm zeigt ein Histogramm des Logarithmus der Fluoreszenzintensität Lm pro Zelle für HMEC-1 vernickelt auf steifen 70 kPa Hydrogele. Die Histogramme für N = 4 bis 6 Wiederholungen sind in verschiedenen Farben dargestellt. Die nicht infizierten Kontrollzellen Histogramm ist lila. Das Tor zum definieren was infiziert ist wird in rot angezeigt. Das Innenministerium ist 100 und die Infektion war bewerteten 8 h nach der Infektion. D. Daten zeigen Prozentsatz der infizierten HMEC-1-Zellen versus Hydrogel Steifigkeit (N = 5). Die horizontalen Balken zeigen die Daten bedeuten. Der P-Wert wurde berechnet mit dem nicht-parametrische Wilcoxon Rang Summe Test. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> Video Abbildung 1: Verbreitung von intrazellulären Lm (Rot-Kanal) durch eine HMEC-1 Zelle Monolayer (Phase) auf einem 3-kPa-Substrat ausgesät. Die Zellen wurden in Leibovitzs L-15 Medien abgebildet (10 % FBS, 20 µg/mL von Gentamicin) innen eine Klimakammer, 37 ˚C equilibriert. Die Bilder wurden alle 5 min. gesammelt. Die Film-Geschwindigkeit ist 15 Frames/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> Video- Abb. 2: Verbreitung der intrazellulären Lm (Rot-Kanal) durch eine HMEC-1 Zelle Monolayer (Phase) auf einem 70 kPa Substrat ausgesät. Die Zellen wurden in Leibovitzs L-15 Medien abgebildet (10 % FBS, 20 µg/mL von Gentamicin) innen eine Klimakammer auf 37 ° C equilibriert. Die Bilder wurden alle 5 min. gesammelt. Die Film-Geschwindigkeit ist 15 Frames/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Elastizitätsmodul (E, kPa)</td>
			<td>Acrylamid-% (ab 40 % Lager)</td>
			<td>Bisacrylamide % (ab 2 % Lager)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,6</td>
			<td>3</td>
			<td>0,045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0.195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
</tbody></table> Tabelle 1. Zusammensetzung der Polyacrylamid (PA) Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit. In dieser Tabelle den Prozentsatz auf 40 % Acrylamid-Lösung und der Prozentsatz der Lager 2 % Bis-Acrylamid-Lösung für eine bestimmte Steifigkeit (Elastizitätsmodul, E) zu erreichen sind in verschiedenen Spalten angegeben.
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> Zusatzmaterial 1. Berechnung der intrazellulären Spannungen von berechneten Traktion betont. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Wir haben eine Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zum Sondieren der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen entwickelt. Dieser Assay ist kompatibel mit Durchflusszytometrie, Immunostaining und Traktion Rasterkraftmikroskopie, zulassend quantitative Messungen der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien.

Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

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Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

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Protokolle für die Untersuchung die Host-Gewebeverteilung, Transmission-Modus und Effekt auf der Host-Fitness eines Densovirus im Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...