Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

אנו מודות מ תחתונה, ר' Lamason, מ Rengaranjan, חברי המעבדה Theriot שלהם לדיונים ותמיכה ניסיוני. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), לאחווה גילהם HHMI מחקר מתקדם (F.E.O.), את סטנפורד בוגר אחווה (F.E.O.) של איגוד הלב האמריקאי (E.E.B.). Cytometry זרימה בוצעה במתקן סטנפורד משותפים FACS.

המחברים אין לחשוף.

התאים יכולים לחוש מגוון הפיזי רמזים סביבתיים, אשר יכולים להשפיע לא רק מורפולוגיה התאים, אלא גם גנים ביטוי וחלבון הפעילות שלהם, ובכך משפיע על התא קריטי פונקציות והתנהגויות45,46. הנוקשות של ה-ECM של תאים מוערכת יותר ויותר כמו אפנן חשוב של תנועתיות תאית התמיינות, התפשטות, בסופו של דבר תא גורל47,48,49. אמנם היו רבים ההתקדמות בהבנת biomechanical האינטראקציה המורכבת בין התאים שלהם ECM, מעט מאוד ידוע על נוקשות איך הסביבה משפיעה על הרגישות של תאים זיהום חיידקי. כדי להקל על מחקרים כאלה, פיתחנו assay רב טוב הרומן הזה מבוסס על הזיוף ומבוססת של hydrogels לזיהוי של נוקשות tunable אשר תואם עם זיהום מבחני50. באופן מסורתי, זיהום חיידקי של תאים בתרביות רקמה נחקרה על זכוכית או משטחים פוליסטירן המהווים כ 1-3 סדרי גודל נוקשה מאשר ה-ECM. טבעי של תאים חסיד ביותר8,51. וזמינותו המתוארים כאן נפתח כבישים מהירים חדשים על-ידי הפעלת חקר חיידקים-פונדקאי אינטראקציות במשטר נוקשות הסביבתיים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.
להוכחת הרעיון של וזמינותו שהוצגו, HMEC-1 תאים נבחרו וגם התאים המארחים חסיד מודל Lm בתור מודל פתוגן חיידקי. עם זאת, ניתן להאריך וזמינותו עבור מחקרים נוספים אם משתנה בהתאם. מחקרים כאלה יכול לכלול זיהום של סוגי תאים מארח חסיד יונקים שונים על ידי פתוגנים נוספים, כולל חיידקים ווירוסים. עבור assay המסוים הזה, ג'לים היו חלבון מצופה עם קולגן אני, אך בהתאם לסוג התא המארח, זה אפשרי לשימוש שונה ECM חלבון-ציפוי, כגון laminin או fibronectin, כדי להקל על ההחזקה של התאים מארח ריבית על הידרוג 52. שיקול נוסף זה תלוי בסוג התא המארח הוא הטווח נוקשות הידרוג שילמדו. הטווח של נוקשות תלויה מבחינה פיזיולוגית רלוונטי עבור סוג התא המארח ספציפי ומצרף כמה טוב המארח ויוצרים על טפט-הידרוג נתון נוקשות. באופן דומה, בהתאם הפתוגן דגם רצוי להיבדק, שינויים קלים ייתכן שיהיה עליך ליישם וזמינותו זיהום כפי שיתואר בהמשך.
החידוש של וזמינותו לעומת שיטות קודמות עבור ייצור לזיהוי hydrogels24,50,53 טמון תכונות ייחודיות מסוימת השתלב וזמינותו זיהום המוצע. קודם כל, hydrogels בנויים על לוחות זכוכית רב טוב, המאפשרת הקרנת הסרט תנאים מרובים בו זמנית, כמו גם האוטומציה של תהליכים מסוימים. ניטור תנאים מרובים באותו הזמן או בחינת משכפל מרובים חיוני כיוון התוצאה של גישה כזו יכול להיות מושפע מגורמים כגון המעבר התא המארח, מספרם המדויק של חיידקים נוספים כדי להדביק את המארחים, אשר לעתים קרובות לשנות בין הניסויים עצמאית. תכונה ייחודית נוספת של זה וזמינותו היא hydrogels בגובה של-40 מיקרומטר, אשר הוא דק מספיק כדי התמונה באמצעות מיקרוסקופ רגיל. הראינו כי אנחנו יכול לבצע בהצלחה תא חי מיקרוסקופ, קיבוע תא וגם immunostaining ואחריו הדמיה, ללא היכרות עם רקע זריחה. לבסוף, hydrogels עשויים משתי שכבות, עם אחד העליון שיש מוטבע גרגרי פלורסנט, כלוא בתוך מטוס מוקד בודד. תכונה זו מבטיחה כי יהיה אור out-of-להתמקד לא להתערב במהלך דימות. הנוכחות של החרוזים מאפשר לשני בדיקת הטופוגרפיה עיליים של ג'לים כדי להבטיח כי הם אחידים, משפר את הביצועים של TFM ו- MSM24,32,41. TFM, MSM, אפשרי לחשב את הכוחות תא-ECM תא-תא בהתאמה של תאים המתגוררים על משתנה מטריצות קשיחות. שימוש assay הרומן הזה, זה ניתן לבצע מדידות כאלה כוחות פיזיים על-ידי השוואת שני התרומה של נוקשות הסביבה ושל זיהום בעת ובעונה אחת. בעקבות גישה כזו, יש הזיהום השפעה על התא המארח מכניקה לכל אורכו יכול להיקבע. בנוסף, האבולוציה של הלחצים תאיים של תאים ניתן לחשב באמצעות MSM והוא יכול לשמש כאמצעי של המכשול בשלמות טפט. בסופו של דבר, בהתחשב באופי רב טוב של וזמינותו, זה אפשרי להכיר בו זמנית לפליטת תרופתי ו גנטי עם זיהום חיידקי, לחקור לעומק הגומלין המורכבים בין מכניקת התא המארח זיהום.
אחד הגבלה הטבועה של הטכניקה טמון את קשיחות המצע אפקט ייתכן על קצב התפשטות של תאים. בדרך כלל, במבחני זיהום, עלינו להבטיח כי הצפיפות התא המארח בתנאים שונים הוא זהה. זה בגלל צפיפות תא בפני עצמו יכול להשפיע על הרגישות של המארחים לזיהום. התאים HMEC-1 שימשו התאים המארחים אל תראה הבדל משמעותי במספר שלהם כאשר נזרע במשך 24 שעות ביממה-hydrogels. עם זאת, לסוגי תאים שונים עלול להפגין התפשטות דיפרנציאלי, בהתאם הקשיחות הידרוג זה יכול הטיה זיהום מחקרים. באופן דומה, הטיה זיהום יכול להיווצר כאשר התאים לא בצורת monolayers או אל תצרף גם על hydrogels, כפי מתרחשת כאשר סוגי תאים מסוימים הם נזרע על מטריצות רך מאוד (למשל, תאי אנדותל הטבור אנושי או מדין טומי הכלבי כליות תאים אפיתל נזרע על 0.6-kPa-hydrogels-54,-55). למיטב ידיעתם פתוגנים, חיידקים מסוימים (למשל, Borrelia burdgorferi) באפשרותך לצרף אל לארח תאים, לפלוש אותם אבל יכול גם transmigrate דרכם56. לא עוד בדקנו אם וזמינותו הזה יעבוד ללימודי גלגול הפתוגן, אבל זה נראה אפשרי מאז מחקרים קודמים על נויטרופילים transmigrating תאי אנדותל נזרע על הרשות הפלסטינית hydrogels תועדו לעבודה בהצלחה57. היו הרבה מחקרים שנערכו המדגימה את ייצור לזיהוי hydrogels של האלסטיות נתון על ידי ערבוב את ריכוזי המתאים אקרילאמיד ו- bis-אקרילאמיד24,25,26 ,27. עם זאת, במיוחד כאשר אחד רצונות לביצוע ניסויים TFM על תאים המתגוררים על hydrogels של נוקשות בדרגות שונות, חיוני כדי לאשר את הנוקשות הצפוי של hydrogels או באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי או בטכניקות אחרות כניסה58. סטיות קטן מהערך צפוי יכולה לנבוע עקב של הממס שונים בשימוש או פתרון מניות אקרילאמיד בגילאי, או על ידי הדרכים AFM מדידות שבוצעו (למשל, הצורה של קצה AFM). בסופו של דבר, הגישה שהוצגו במסמך זה מבוסס על זריעת התאים המארחים על מטריצות 2D, שיכול להיות שונה משער תרחיש 3D מציאותית יותר ורלוונטי פיזיולוגית. עם זאת, ייצור ג'לים 3D עם נוקשות tunable, seeding אותם עם התאים המארחים, ואז מדביקים אותם עם פתוגנים, עדיין כוללת קשיים טכניים מסוימים. עם זאת, אנו צופים כי בעתיד הקרוב נוכל להרחיב את הבדיקה הנוכחית ללמוד זיהום סביבה תלת-ממד.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר יחד עם תוצאות ראשוניות לספק ראיות כי assay הרומן הזה יכול להיות כלי שימושי ביותר ללמוד זיהום של התאים המארחים חסיד עם חיידקים פתוגניים בצורה כמותית, הרבה יותר סביבת רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מאשר בעבר שנבדקו. הכוח של בדיית לזיהוי hydrogels בכיוונון המוצע שקרים וזמינותו היא תואמת הביצועים של טכניקות מרובות כגון cytometry זרימה, immunostaining ואחריו מיקרוסקופ אור, וכוח המתיחה מיקרוסקופ. וזמינותו יכול לשמש עבור מחקרים שכללו הזיהום של סוגי תאים חסיד מארח שונים על ידי פתוגנים, אשר אנו צופים תהיה בעלת השפעה משמעותית בשני להתיר את האסטרטגיות שלפיו פתוגנים להדביק מחשבים מארחים, הקלה על הפיתוח של התערבויות טיפוליות נגד זיהומים.

תאים ברקמות בעלי חיים ביותר הם בדרך כלל חסיד, הצמדת התאים הסמוכים וגם כדי שלהם מטריצה חוץ-תאית (ECM). המעגנה תאים ECM שלהם הוא קריטי עבור תהליכים תאיים רבים החל תנועתיות תא לתא1,התפשטות והישרדות2. Anchorage הסלולר ל ECM תלוי ECM הרכב והן נוקשות. התאים מגיבים לשינויים האחרונים על ידי באופן דינמי סידור מחדש שלהם שלד התא, התא-ECM ו תא-cell הדבקויות, אשר בתורו אנושות לשנות תא ביומכניקה ופונקציות3,4,5,6 . ECM נוקשות יכול להשתנות בחלל (קרי, מיקום אנטומי), זמן (כלומר, הזדקנות), וכן התהליכים הקשורים pathophysiological (למשל, טרשת עורקים, סרטן, זיהומים, וכו '). למשל, מקובל כי אנדותל תאים המתגוררים על נוקשה-לעומת רך-מטריצות להפעיל כוחות מוגברת שלהם ECM, אחד את השני ולגלות מוגברת תנועתיות והתפשטות7,8. באופן דומה, fibroblasts המתגוררים על מטריצות נוקשה להקנות את כוחות כויץ גבוהה שלהם ECM ולהראות התפשטות מוגברת, תנועתיות ו- ECM ייצור9,10,11. למרות תא מכניקה והתגובה ECM נוקשות נחקרו בהרחבה עבור סוגי תאים שונים, הקשר בין התאים המארחים חסיד, הנוקשות של שלהם ECM, זיהומים חיידקיים הוא עדיין אינו מודע לקיומם.
ללמוד את התפקיד של נוקשות ECM באינטראקציות תא חיידקים-מארח, ל' monocytogenes (Lm) נבחר את הפתוגן מודל. Lm הוא חיידק נפוץ המועבר במזון שיכולים לגרום זיהום סיסטמי במגוון רחב של מחשבים מארחים יונקים. זה פתוגן תאיים עיצוב גבות ניתן להעביר האפיתל במעי לאיברים מרוחקים באמצעות חציית סוגים שונים של כלי הדם endothelia. אם זה מפרה את מחסום דם - מוח, Lm עלולה לגרום לדלקת קרום המוח, כאשר יחצה את השליה, זה יכול לגרום הפלה ספונטנית12,13. Lm יכול להדביק מארח שונים סוגי תאים, באפשרותך לעשות זאת באמצעות אסטרטגיות פתוגניים ברורים. Lm זיהום נחקרה בעיקר בהקשר של תאי אפיתל, בעוד הרבה פחות ידוע על איך יכול להדביק Lm ו מעקף התאים אנדותל המצפים לומן של כלי הדם14,15,16. יתר על כן, לא ידוע עדיין במידה רבה איך הנוקשות של ECM שבו שוכנות תאי אנדותל מודולציה היכולת של Lm לפלוש אלה בתאי המארח להתפשט. באימות Lm ומספר נוסף מינים חיידקי (קרי, parkeri ריקטסיה) לנצל שלד התא אקטין של המחשב המארח תאים הם הדביקו לשניהם לפלוש לתוך הציטופלסמה שלהם וכדי להקל על הפצת לתא17 , 18 , 19. הם להשיג את זה דרך הביטוי של חלבונים המאפשרים להם להתערב עם מסלולים פלמור אקטין מארח וליצור זנבות כוכב השביט אקטין המאפשרים16,שלהם הנעה קדימה20. בעקבות זיהום, שלד התא אקטין של התא המארח צריך לארגן מחדש באופן דינמי באופן מתאפיין עדיין לא לגמרי, פוטנציאל להשפיע על ביומכניקה של התאים מארח כולל את הכוחות הפיזיקליים שהם מפעילים על ECM שלהם ועל כל אחרים. לבחון תהליכים אלה, תאי אנדותל microvascular אדם (HMEC-1) נבחרו כתאי מארח מודל שלוש סיבות: 1. תאי אנדותל ידועים להיות מאוד mechanosensitive כפי שהם נחשפים כל הזמן משתנה סימנים פיזיים21; 2. אסטרטגיות ש-lm מעסיקה להדביק תאי אנדותל הם עדיין אינו מודע לקיומם22; ו- 3. HMEC-1 הם קו תא מונצחים, יכול, לפיכך, להיות בקלות תרבותי ונחשפו לבצע מניפולציות גנטיות.
זיהום חיידקי של התאים המארחים בעיקר למד כבר במבחנה על-ידי זריעת תאי זכוכית או מצעים פוליסטירן הנמצאים באופן משמעותי נוקשה מאשר ה-ECM פיזיולוגיים של רוב התאים12,14,23. כדי לבחון את הזיהום של תאים נזרע על מטריצה נוקשות אשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית וכדי להבהיר את התפקיד של ECM נוקשות על הזיהום של תאים על ידי פתוגנים חיידקיים, עקבנו אחר גישה חדשנית המבוססת על בדיית דק hydrogels microbead-מוטבע לזיהוי של נוקשות tunable על רב טוב צלחות. החידוש של הגישה המוצעת טמון בכך שהיא מאפשרת ניטור תנאים מרובים בו זמנית עקב תבנית רב טוב שלה, כי הוא תואם עם טכניקות מרובות בשל אופן מסוים שסובסטרטים בנויות. HMEC-1 התאים היו נזרע על אלה hydrogels מצופים חלבון, אז נגוע זנים Lm להפוך פלורסנט על הפנמה או הם צורונים פלורסנט. תפקידו של ה-ECM נוקשות על זיהום הרגישות של התאים HMEC-1 המארחים הוערך על ידי cytometry זרימה. בנוסף, מיקרוסקופ immunostaining, קרינה פלואורסצנטית שימשו כדי להבדיל בין חיידקים למביטה והקפדה. לבסוף, מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM) בוצעה בהצלחה כדי לאפיין את ההשפעה של Lm חדירתו הלחצים המתיחה זה תאי אנדותל מארח להפעיל על מטריצות שלהם במהלך זיהום. וזמינותו שהוצגו ניתן לשנות בקלות כדי לאפשר יותר מחקרים על ההשפעה של ECM נוקשות על זיהום הרגישות של תאים חסיד באמצעות שורות תאים שונים או פתוגנים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

מטריצה חוץ-תאית נוקשות כוללת אחת של גירויים מרובים מכני הסביבה כי הם כידוע להשפיע על התנהגות הסלולר פונקציה, גורל באופן כללי. למרות התגובות של סוגי תאים חסיד ויותר מטריצת קשיחות מאפינים, כמה מחסידי הרגישות התאים לזיהום חיידקי תלוי מטריצת קשיחות אינו ידוע במידה רבה, כמו היא ההשפעה של זיהום חיידקי על ביומכניקה של התאים המארחים. אנו משערים כי הרגישות של תאי אנדותל מארח זיהום חיידקי תלוי הנוקשות של המטריקס שבו שוכנים תאים אלה, כי הזיהום של המחשב המארח תאים עם חיידקים ישתנה ביומכניקה שלהם. כדי לבדוק את ההשערות שני אלה, תאי אנדותל שימשו מודל hosts ו ליסטריה חיידק מודל. על ידי פיתוח וזמינותו של הרומן עיצוב רב טוב, אנו מראים כי להיות מוערך באופן כמותי ההשפעה של מטריקס נוקשות על זיהום של תאי אנדותל מאת ל' monocytogenes דרך cytometry זרימה, immunostaining ואחריו מיקרוסקופ. בנוסף, באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה, ההשפעה של זיהום monocytogenes ל' על המארח תא אנדותל ביומכניקה יכול להילמד. השיטה המוצעת מאפשרת הניתוח של ההשפעה של מכניקה רקמות רלוונטיות על זיהום חיידקי של תאים חסיד, וזה צעד קריטי להבנת יחסי גומלין ביו-מכני תאים, שלהם מטריצה חוץ-תאית, ו חיידקים פתוגניים. שיטה זו ישימה גם מגוון רחב של סוגים אחרים של מחקרים על ביומכניקה תא והתגובה קשיחות המצע איפה זה חשוב להיות מסוגל לבצע משכפל רבים במקביל ניסוי.

ECM תלויי-נוקשות הרגישות של תאים HMEC-1 לזיהום Lm: הרשות hydrogels של נוקשות בדרגות שונות, כל משטח מצופה עם קולגן אני, נבנו על לוחות זכוכית רב טוב כפי שמתואר שלב 1 של הפרוטוקול (ראה איור 1). AFM מדידות בוצעו כדי לאשר את הנוקשות המדויק של hydrogels, כפי שתואר לעיל26,27 (ראה איור 2). מחקרים שנעשו בעבר הראו כי הציות המקומי של קרום המרתף של תאי אנדותל יכול לנוע בין 1 kPa (למשל, רקמת המוח) עד 70 kPa (למשל, אבי העורקים)36,37,38, 39 , 40. לכן, בחרנו לבחון את הזיהום של תאים HMEC-1 המתגוררים על מטריצות עם הקשיחות הבאים: 0.6 kPa, 3 kPa, 20 kPa ו 70 kPa. עבור כל הידרוג נוקשות, שש hydrogels היו מפוברק כדי להעריך את הפארמצבטית של התוצאות.
Cytometry זרימה שימש כדי להעריך את הרגישות תלויי-נוקשות ECM של תאים HMEC-1 לזיהום Lm (ראה איור 3). תאים HMEC-1 נדבקו בנגיף זן Lm (JAT985) המבטאת סמן פלורסנט לאחר הפנמה (actAp::mTagRFP), המאפשר זיהוי חיידקים תאיים היחידה (ראה דמויות 1 L - 1N). JAT985 חסרה גם ActA, הפיכת החיידק להתפשט מתא לתא, מאז ActA הכרחי להיווצרות זנב השביט אקטין והפצה חיידקי עוקבות. 7 - 8 שעות לאחר הפגיעה, זיהום התאים HMEC-1 הוערכה באמצעות cytometry זרימה. כדי להבטיח הניתוח של תאים בודדים, היה עיקר חלוקת תא ספירת מגודרת באמצעות פארווערטס לעומת הצד פיזור מגרש, ולאחר מכן צעד המגביל השני היה ביצע כדי לא לכלול תאים כי התערוכה autofluorescence (ראה דמויות 3A - 3 C ). תוצאות ראשוניות מתואר באיור 3 מראים כי זיהום HMEC-1 עם Lm הוא כ כפולה גדולה יותר עבור תאים HMEC-1 המתגוררים על נוקשות hydrogels kPa 70 לעומת התאים השוכנים במחשב hydrogels kPa 0.6 רך (ראה דמויות 3B - תלת-ממד). הרגישות לזיהום Lm מוגברת של תאים HMEC-1 המתגוררים על נוקשות לעומת מטריצות רך יכול להיות בשל: 1. גדל Lm אדהזיה על גבי HMEC-1; 2. Lm מוגבר, פלישת HMEC-1; או 3. שני הנ ל שיתוף המתרחשים. כדי לבדוק חסימות איזה השערה, היו תאים HMEC-1 נזרע על רך (3 kPa) ו hydrogels (70 kPa) נוקשות, נגוע צורונים GFP לבטא Lm (ראה דמויות 4A - 4 C). הדגימות תוקנו זמן קצר לאחר זיהום, החיידקים (adhering) חיצוני היו מוכתמים נוגדנים. באמצעות מיקרוסקופ כמותית, מצאנו כי ישנם חיידקים באופן משמעותי יותר הקפדה על HMEC-1 כאשר התאים מארח שוכנים על נוקשות לעומת ג'ל רך (ראה איור 4D). בקנה אחד עם הנתונים cytometry זרימה, יש חיידקים באופן משמעותי לנחלתו של HMEC-1 כאשר התאים מארח שוכנים על נוקשות לעומת ג'ל רך (ראה איור 4E). אולם, הפלישה היעילות (חיידקים הפנימו/סה כ מספר חיידקים) של Lm לתוך תאים HMEC-1 הוא דומה, ללא התחשבות קשיחות המצע (ראה איור 4F).
מיקרוסקופ כוח המתיחה של תאים הנגועים Lm HMEC-1: Lm זיהום של תאים HMEC-1 יכול לשנות את ביומכניקה של תאים נגועים המארח, כולל הכוח המצורף ECM שלהם או אחד לשני, המשפיעים על תקינותם מכשול. אנחנו ביקשו להעריך זה יכול להיות המקרה באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה32 כדי לחשב את כוחות המתיחה תא-ECM ומיקרוסקופיה מתח חד שכבתי41 כדי לחשב את הכוחות tensional תאיים. איור 5 מציג מפות של דפורמציה שדה, שדה מאמץ המתיחה, המתח תאיים שדה של תאים HMEC-1 המתגורר hydrogels 20-kPa-נקודות זמן שונות לאחר הפגיעה. דמויות 5A - 5 D להפנות לתאים נגוע השליטה HMEC-1 ואילו דמויות 5E - 5 שעות יש לפנות HMEC-1 תאים נגועים Lm-ריבוי של זיהום שווה ל- 300 תא חיידקים. עבודה ראשונית זו מרמזת כי תאים נגועים HMEC-1 להפחית את סדר הגודל של התא-ECM שלהם מדגיש תאיים במהלך זיהום עם Lm, ואילו זה לא נצפית עבור תאים נגוע השליטה.
ECM תלויי-נוקשות Lm הפצתו ברחבי monolayers HMEC-1: מיקרוסקופ זמן לשגות שימש לחקור את האפקט מטריצת קשיחות יש ב- Lm הפצתו דרך monolayers HMEC-1. כמו Lm מתפשט דרך טפט, החיידקים ליצור מוקד הזיהום הגדל כפונקציה של הזמן (ראה איור 6A ואת הסרטונים דמויות 1 ו- 2). האזור של המוקד זיהום נמדד על ידי ציור של קמור, מהקטן לגדול קמורה המצולע שמקיף את ערכה של נקודות, סביב חיידקים42. יש מדד סטנדרטי אין בשדה כדי למדוד את היעילות של ל' monocytogenes התפשטות לתא דרך טפט של התאים המארחים. כדי להעריך את יעילות כפולה, כמה יש לספור את מספר התאים המארחים המוקד זיהום41, לאחרים יש גבולות מצוירות באופן ידני סביב הקבוצה של זיהום מארח תאים43. בחרנו לצייר מצולע קמור סביב החיידקים, כי זה תהליך אוטומטי, התמדה שהמפתחות זול כדי למדוד את היעילות של התפשטות monocytogenes ל' . בעשותם כך, מצאנו ירידה קלה באזור המיקוד זיהום בתאים HMEC-1 נזרע על 70 hydrogels kPa בהשוואה לאלה נזרע על מטריצות kPa 3 (ראה איור 6B ואת הסרטונים דמויות 1 ו- 2). כדי לקבוע את קצב הצמיחה של המוקד זיהום, המרחק רדיאלי הייתה להתוות כפונקציה של הזמן על-ידי לקיחת השורש הריבועי של האזור של המוקד זיהום חילוק זה פאי. טרנספורמציה מתמטית זו מניחה כי הצורה של המוקד זיהום הוא בערך מעגלית44. כדי למדוד את המהירות של הגידול המוקד, קצב השינוי (קרי, המדרון) של המרחק רדיאלי עבור שתי מטריצות 3 - ו 70-kPa נמדדה. גישה זו מבואר כי המוקד זיהום גדל מהר יותר מונוטוני בתאים HMEC-1 נזרע על גבי 3-kPa מטריצות. עם זאת, המוקד גדל איטי באופן משמעותי (הראשון 200 דקות), מעט איטי יותר (200 עד 600 דקות) בתאים נזרע על 70-kPa מטריצות (ראה איור 6C). אכן, ניתוח של נתונים נוספים אישר כי המוקד זיהום גדל, בממוצע, כפולה לאט יותר ב- 70-kPa מטריצות, בעיקר בזמן מינימום 200 הראשונה (ראה איור 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> איור 3 : הרגישות תלויי-נוקשות ECM של תאים HMEC-1 Lm לפלישה נמדד באמצעות cytometry זרימה .  תאים HMEC-1 נדבקו בנגיף Lm (JAT985), הזיהום נותחה על ידי cytometry זרימה. א. לוח זה מראה צד לעומת פיזור קדימה מגרש עבור תאים HMEC-1 נציג מגיע לבאר בודדת. התפלגות בכמות גדולה של תאים נבחר באמצעות gating כדי לא לכלול פסולת (משמאל) ותא doublets או שלישיות (מימין). B. גרף זה מראה היסטוגרמה של הלוגריתם של עוצמת קרינה פלואורסצנטית Lm בכל תא עבור HMEC-1 מצופה ב kPa 0.6 רך. ג. גרף זה מראה היסטוגרמה של הלוגריתם של עוצמת קרינה פלואורסצנטית Lm בכל תא HMEC-1 מצופה על נוקשות hydrogels kPa 70. היסטוגרמות עבור N = 4-6 משכפל מוצגים בצבעים שונים. היסטוגרמה התאים בקרה uninfected הוא סגול. השער משמש להגדרת מה נגוע מוצגים באדום. למשרד הפנים הוא 100, הזיהום היה המוערך 8 שעות לאחר הפגיעה. ד. הנתונים מראים אחוז תאים נגועים HMEC-1 לעומת הנוקשות הידרוג (N = 5). אופקיות מתארים ממוצע של הנתונים. P-ערך מחושב עם הבדיקה Wilcoxon דרגה סכום שאינו פרמטרי. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> וידאו איור 1: ההפצה של Lm תאיים (ערוץ אדום) דרך חד שכבתי תא HMEC-1 (שלב) נזרע על מצע 3-kPa. התאים היו עם תמונה של ליבוביץ L-15 מדיה (10% FBS, µg/mL 20 של גנטמיצין) בתוך תא סביבתיים equilibrated כדי הלעפה תרוטרפמט 37. התמונות נאספו כל 5 דקות. מהירות הסרט היא 15 מסגרות/ס <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> סרטון איור 2: הפצת Lm תאיים (ערוץ אדום) דרך חד שכבתי תא HMEC-1 (שלב) נזרע על מצע 70-kPa. התאים היו עם תמונה של ליבוביץ L-15 מדיה (10% FBS, µg/mL 20 של גנטמיצין) בתוך תא סביבתיים equilibrated ל- 37 מעלות צלזיוס. התמונות נאספו כל 5 דקות. מהירות הסרט היא 15 מסגרות/ס <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>מודול האלסטיות (E, kPa)</td>
			<td>אקרילאמיד % (מ- 40% מניות)</td>
			<td>Bisacrylamide % (מ- 2% מניות)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.6</td>
			<td>3</td>
			<td>0.045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0.195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
</tbody></table> טבלה 1. ההרכב של לזיהוי (PA) hydrogels של קשיות שונות. בטבלה זו, האחוז של פתרון אקרילאמיד 40% מניות, ואת האחוז במניה 2% פתרון bis-אקרילאמיד להשגת מנדנד נתון (האלסטיות, E) הם הצביעו על עמודות שונות.
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> חומר משלים 1. חישוב של מתח תאיים מדגיש המתיחה מחושב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells (Video) | JoVE

פיתחנו assay מבוססי לזיהוי של עיצוב רב טוב עבור בודק את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד. Assay הזה הוא תואם cytometry זרימה immunostaining, מיקרוסקופ כוח המתיחה, המאפשרות מדידות כמותיים של אינטראקציות biomechanical בין תאים, מטריצה חוץ-תאית, לבין חיידקים פתוגניים.

Assay מבוססי לזיהוי עיצוב רב טוב ללמוד את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion (Video) | JoVE

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda (Video) | JoVE

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition (Video) | JoVE

Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis (Video) | JoVE

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay (Video) | JoVE

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow (Video) | JoVE

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells (Video) | JoVE

יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance (Video) | JoVE

מבחני ללמוד את התפקיד של Vitronectin הידבקות חיידקים עמידות סרום

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice (Video) | JoVE

Vasodilation של כלי מבודד והבידוד של מטריקס של עכברים צמוד עור

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm (Video) | JoVE

פרוטוקולים לחקירת הפצת Host-הרקמה, הילוכים-mode, ואת ההשפעה על כושר Host של Densovirus ב bollworm הכותנה

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...