Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

एम पाद लेख, आर Lamason, एम Rengaranjan, और उनके विचार विमर्श और प्रयोगात्मक समर्थन के लिए Theriot लैब के सदस्यों के लिए हमारी धंयवाद । इस काम को NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), द HHMI Gilliam फेलोशिप फॉर एडवांस्ड स्टडी (F.E.O.), स्टैनफोर्ड ग्रेजुएट फेलोशिप (F.E.O.), और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (E.E.B.) द्वारा सपोर्ट किया गया । फ्लो cytometry स्टैनफोर्ड साझा FACS सुविधा में प्रदर्शन किया गया था ।

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

कोशिकाओं को भौतिक पर्यावरण cues की एक किस्म है, जो न केवल कोशिकाओं ' आकृति विज्ञान पर भी उनके जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन गतिविधि, इस प्रकार महत्वपूर्ण कोशिका कार्यों और व्यवहार को प्रभावित४५,४६प्रभावित कर सकते है भावना कर सकते हैं । कोशिकाओं के ECM की कठोरता तेजी से सेलुलर गतिशीलता, भेदभाव, प्रसार, और अंत में सेल भाग्य४७,४८,४९का एक महत्वपूर्ण मॉडुलन के रूप में सराहना की है । यद्यपि वहां कोशिकाओं और उनके ECM के बीच जटिल यांत्रिक बातचीत को समझने में कई हाल ही में अग्रिम किया गया है, थोड़ा कैसे पर्यावरण कठोरता जीवाणु संक्रमण के लिए कोशिकाओं की संवेदनशीलता को प्रभावित करता है के बारे में जाना जाता है । इस तरह के अध्ययनों की सुविधा के लिए, हम इस उपंयास बहु अच्छी तरह से स्वरित्र कठोरता जो संक्रमण परख५०के साथ संगत है की polyacrylamide hydrogels की स्थापना की निर्माण के आधार पर परख विकसित की है । परंपरागत रूप से, ऊतक संस्कृति में कोशिकाओं के एक जीवाणु संक्रमण कांच या polystyrene सतहों कि लगभग 1-3 के आदेश सबसे अनुयाई कोशिकाओं8,५१की प्राकृतिक ECM से परिमाण कठोरता के है पर अध्ययन किया गया है । परख यहां वर्णित बैक्टीरिया के अध्ययन को सक्षम करने से नए राजमार्गों खोलता है एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक पर्यावरण कठोरता शासन में मेजबान बातचीत ।
प्रस्तुत परख की अवधारणा के सबूत के लिए, HMEC-1 कोशिकाओं मॉडल अनुयाई मेजबान कोशिकाओं और एक मॉडल जीवाणु रोगज़नक़ के रूप में एल एम के रूप में चुना गया था । हालांकि, परख आगे की पढ़ाई के लिए बढ़ाया जा सकता है अगर उचित संशोधित । इस तरह के अध्ययनों में बैक्टीरिया और वायरस सहित अतिरिक्त रोगजनकों द्वारा विभिन्न स्तनधारी अनुयाई होस्ट सेल प्रकारों के संक्रमण को शामिल किया जा सकता है । इस विशेष परख के लिए, जैल प्रोटीन-कोलेजन मैं के साथ लेपित थे, लेकिन मेजबान सेल प्रकार पर निर्भर करता है, यह एक अलग ECM प्रोटीन का उपयोग करने के लिए संभव है-कोटिंग, जैसे laminin या fibronectin, hydrogel पर ब्याज की मेजबान कोशिकाओं के लगाव की सुविधा के लिए ५२. एक अतिरिक्त विचार जो होस्ट कक्ष प्रकार पर निर्भर करता है hydrogel कठोरता श्रेणी का अध्ययन किया जाना है । कठोरता की सीमा क्या शारीरिक विशिष्ट मेजबान सेल प्रकार के लिए प्रासंगिक है और कितनी अच्छी तरह है कि मेजबान एक दिया कठोरता hydrogel पर एक monolayer बनाने देता है पर निर्भर होना चाहिए। इसी प्रकार, मॉडल रोगज़नक़ के आधार पर जांच की जानी चाहिए, मामूली संशोधनों को संक्रमण परख पर लागू करने की आवश्यकता हो सकती है यहां वर्णित है ।
परख के नवाचार के रूप में polyacrylamide hydrogels24,५०,५३ के निर्माण के लिए पिछले तरीकों की तुलना में कुछ अद्वितीय प्रस्तावित संक्रमण परख में एकीकृत सुविधाओं में निहित है । सबसे पहले, hydrogels बहु पर निर्मित कर रहे है अच्छी तरह से गिलास नीचे प्लेटें, जो कई शर्तों की स्क्रीनिंग के साथ ही कुछ प्रक्रियाओं के स्वचालन सक्षम बनाता है । एक ही समय में एकाधिक शर्तों की निगरानी या कई दोहराने की जांच महत्वपूर्ण है के बाद से इस तरह के एक दृष्टिकोण के परिणाम ऐसे मेजबान सेल बीतने के रूप में कारकों से प्रभावित किया जा सकता है और बैक्टीरिया की सटीक संख्या के लिए मेजबान है, जो अक्सर बदल संक्रमित जोड़ा स्वतंत्र प्रयोगों के बीच. इस परख की एक अतिरिक्त अनूठी विशेषता यह है कि hydrogels लगभग ४० µm की ऊंचाई है, जो काफी पतली पारंपरिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि है । हमें पता चला है कि हम सफलतापूर्वक दोनों लाइव सेल माइक्रोस्कोपी और सेल निर्धारण प्रदर्शन कर सकते हैं, और immunostaining इमेजिंग द्वारा पीछा किया, उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति शुरू करने के बिना । अंत में, hydrogels दो परतों से बना रहे हैं, ऊपरी एक फ्लोरोसेंट microbeads एंबेडेड होने के साथ, एक ही फोकल विमान में सीमित । इस विशेषता यह सुनिश्चित करता है कि कोई आउट-की-फोकस इमेजिंग के दौरान हस्तक्षेप प्रकाश होगा । मोतियों की उपस्थिति यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे समान हैं और TFM और एमएसएम24,३२,४१के प्रदर्शन में सुधार करने के लिए जैल की सतह स्थलाकृति की दोनों परीक्षा में सक्षम बनाता है । TFM और एमएसएम के साथ, यह कोशिका-ECM और सेल-सेल बलों क्रमशः कठोरता मैट्रिक्स पर रहने वाले कोशिकाओं की गणना करने के लिए संभव है. इस उपंयास परख का प्रयोग, यह संभव है कि पर्यावरण कठोरता के दोनों योगदान और एक साथ संक्रमण की तुलना करके शारीरिक बलों के इस तरह के माप करना । इस तरह के एक दृष्टिकोण के बाद, प्रभाव संक्रमण अपने पाठ्यक्रम में मेजबान सेल यांत्रिकी पर है निर्धारित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं के intracellular तनाव का विकास एमएसएम का उपयोग कर की गणना की जा सकती है और monolayer की बाधा अखंडता के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । अंत में, परख के बहु अच्छी तरह से प्रकृति को देखते हुए, यह एक साथ एक जीवाणु संक्रमण के साथ औषधीय और आनुवंशिक perturbations परिचय संभव है, और अधिक गहराई में मेजबान सेल यांत्रिकी और संक्रमण के बीच जटिल पुनरावृत्ति की जांच ।
तकनीक की एक अंतर्निहित सीमा प्रभाव सब्सट्रेट कठोरता कोशिकाओं की प्रसार दर पर हो सकता है में निहित है । आमतौर पर, संक्रमण की परख में, हम यह सुनिश्चित करने की जरूरत है कि विभिंन परिस्थितियों में मेजबान सेल घनत्व एक ही है । ऐसा इसलिए है क्योंकि खुद के द्वारा कोशिका घनत्व को संक्रमण के लिए मेजबान की संवेदनशीलता पर एक प्रभाव हो सकता है । HMEC-1 कक्ष होस्ट कक्षों के रूप में उपयोग किए गए थे जब hydrogels पर 24 h के लिए वरीयता प्राप्त उनकी संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाता है । हालांकि, विभिंन प्रकार के सेल विभेदक प्रसार प्रदर्शित हो सकता है, hydrogel कठोरता पर निर्भर करता है, कि संक्रमण अध्ययन पूर्वाग्रह कर सकते हैं । इसी तरह, संक्रमण पूर्वाग्रह पैदा कर सकते हैं जब कोशिकाओं monolayers फार्म नहीं है या hydrogels पर अच्छी तरह से संलग्न नहीं है, के रूप में तब होता है जब कुछ कोशिका प्रकार बहुत नरम मैट्रिक्स पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं (जैसे, मानव गर्भनाल endothelial कोशिकाओं या मडि़हान-डार्बी कुत्ते गुर्दे उपकला कोशिकाओं ०.६ पर वरीयता प्राप्त-केपीए hydrogels५४,५५). जहां तक रोगजनकों का संबंध है, कुछ बैक्टीरिया (जैसे, अरै burdgorferi) मेजबान कोशिकाओं पर संलग्न और उन पर आक्रमण कर सकते हैं, लेकिन उंहें५६के माध्यम से भी transmigrate कर सकते हैं । हम अभी तक अगर इस परख रोगज़नक़ स्थानांतरगमन अध्ययन के लिए काम करेंगे परीक्षण नहीं किया है, लेकिन यह न्यूट्रोफिल transmigrating endothelial कोशिकाओं पर फिलीस्तीनी अथॉरिटी hydrogels पर वरीयता प्राप्त पिछले अध्ययन के बाद से संभव है५७सफलतापूर्वक काम प्रलेखित किया गया है । वहां कैसे acrylamide और बीआईएस के उपयुक्त सांद्रता-acrylamide24,25,26 के मिश्रण से एक दिया युवा मापांक के polyacrylamide hydrogels निर्माण करने के लिए दिखा संचालित अध्ययन के एक बहुत कुछ किया गया है ,27. हालांकि, विशेष रूप से जब एक इच्छाओं को अलग कठोरता के hydrogels पर रहने वाले कोशिकाओं पर TFM प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए, यह hydrogels की कठोरता की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है या तो AFM या अंय इंडेंट५८तकनीक के माध्यम से । अपेक्षित मूल्य से मामूली विचलन इस्तेमाल एक अलग विलायक या एक वृद्ध acrylamide स्टॉक समाधान, या तरीके AFM माप प्रदर्शन कर रहे है के कारण उत्पंन कर सकते है (जैसे, AFM टिप के आकार) । अंत में, इस के साथ साथ प्रस्तुत दृष्टिकोण 2d मैट्रिक्स पर मेजबान कोशिकाओं बोने, जो एक और अधिक यथार्थवादी और शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी परिदृश्य से अलग कर सकते है पर आधारित है । हालांकि, स्वरित्र कठोरता के साथ 3 डी जैल विनिर्माण, उंहें मेजबान कोशिकाओं के साथ बोने और फिर उंहें रोगजनकों के साथ संक्रमित, अभी भी कुछ तकनीकी कठिनाइयों शामिल हैं । फिर भी, हम आशा है कि निकट भविष्य में हम एक 3 डी सेटिंग में संक्रमण का अध्ययन करने के लिए वर्तमान परख का विस्तार करने में सक्षम हो जाएगा ।
योग करने के लिए, प्रारंभिक परिणामों के साथ एक साथ वर्णित प्रोटोकॉल सबूत है कि यह उपंयास परख एक मात्रात्मक फैशन में रोगजनक बैक्टीरिया के साथ अनुयाई मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी उपकरण बन सकता है और एक बहुत अधिक उपलब्ध कराने शारीरिक रूप से प्रासंगिक पर्यावरण से पहले की जांच की । प्रस्तावित सेटअप में polyacrylamide hydrogels के निर्माण की शक्ति में निहित है कि परख ऐसे प्रवाह cytometry के रूप में कई तकनीकों के प्रदर्शन के साथ संगत है, immunostaining प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया, और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी । परख रोगजनकों, जो हम दोनों रणनीतियों जो रोगजनकों संक्रमित मेजबान और के विकास को सुविधाजनक बनाने में एक महत्वपूर्ण प्रभाव होगा आशा द्वारा विभिंन अनुयाई मेजबान सेल प्रकार के संक्रमण को शामिल अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है संक्रमण के खिलाफ चिकित्सीय हस्तक्षेप ।

अधिकांश पशु ऊतकों में कोशिकाओं को आम तौर पर अनुयाई हैं, दोनों पड़ोसी कोशिकाओं और उनके extracellular मैट्रिक्स (ECM) के लिए संलग्न । सेल गतिशीलता से सेल प्रसार और अस्तित्व1,2को लेकर कई सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए उनके ECM करने के लिए कोशिकाओं की anchorage महत्वपूर्ण है । सेलुलर anchorage ECM ECM संरचना और जकड़न दोनों पर निर्भर करता है । कोशिकाओं को गतिशील रूप से फिर से उनके cytoskeleton, सेल-ECM और सेल-सेल आसंजन, जो बारी में गंभीर रूप से बदल कोशिका यांत्रिक और कार्यों3,4,5,6 की व्यवस्था द्वारा उत्तरार्द्ध में परिवर्तन का जवाब . ECM कठोरता अंतरिक्ष में भिंन हो सकते है (यानी, शारीरिक स्थान), समय में (यानी, उंर बढ़ने), और pathophysiological प्रक्रियाओं में (जैसे, धमनीकाठिंय, कैंसर, संक्रमण, आदि) । उदाहरण के लिए, यह व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते है कि endothelial कठोर पर रहने वाले कोशिकाओं-के रूप में नरम-मैट्रिक्स की तुलना में उनके ECM और एक दूसरे को और प्रदर्शन वृद्धि हुई बलों में वृद्धि हुई गतिशीलता और प्रसार7,8। इसी तरह, fibroblasts पर रहने वाले अपने ECM के लिए उच्च सिकुड़ा बलों प्रदान मैट्रिक्स और वृद्धि प्रसार, गतिशीलता, और ECM उत्पादन9,10,11दिखाने के लिए । हालांकि सेल यांत्रिकी और ECM कठोरता के जवाब बड़े पैमाने पर विभिंन प्रकार के सेल के लिए अध्ययन किया गया है, अनुयाई मेजबान कोशिकाओं के बीच संबंध, उनके ECM की कठोरता, और जीवाणु संक्रमण अभी भी काफी हद तक अज्ञात है ।
के लिए बैक्टीरिया में ECM कठोरता की भूमिका का अध्ययन-मेजबान सेल बातचीत, एल monocytogenes (Lm) मॉडल रोगज़नक़ के रूप में चुना गया था । Lm एक सर्वव्यापी भोजन जनित जीवाणु कि स्तनधारी मेजबान की एक विस्तृत विविधता में प्रणालीगत संक्रमण पैदा कर सकता है । यह facultative intracellular रोगज़नक़ आंतों उपकला से संवहनी endothelia के विभिन्न प्रकार के पार से दूर अंगों के लिए स्थानांतरित कर सकते हैं । यदि यह रक्त मस्तिष्क बाधा उल्लंघन, एल एम सी दिमागी बुखार का कारण बन सकता है, और जब यह अपरा पार, यह सहज गर्भपात12,13पैदा कर सकता है । Lm अलग होस्ट सेल प्रकार को संक्रमित कर सकते है और ऐसा अलग रोगजनक रणनीतियों का उपयोग करके कर सकते हैं । lm संक्रमण ज्यादातर उपकला कोशिकाओं के संदर्भ में अध्ययन किया गया है, जबकि बहुत कम कैसे Lm संक्रमित कर सकते हैं के बारे में जाना जाता है और बाईपास endothelial कोशिकाओं रक्त वाहिकाओं के लुमेन अस्तर14,15,16. इसके अलावा, यह अभी भी काफी हद तक अज्ञात है कैसे ECM की जकड़न जहां endothelial कोशिकाओं रहते है Lm इन मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण और फिर प्रसार करने की क्षमता संग्राहक । एल एम और कई अतिरिक्त बैक्टीरियल प्रजातियों (यानी, Rickettsia parkeri) मेजबान कोशिकाओं वे दोनों अपने कोशिका द्रव्य में आक्रमण करने के लिए संक्रमित की actin cytoskeleton का लाभ लेने के लिए और सेल के लिए सेल प्रसार17 की सुविधा , 18 , 19. वे प्राप्त है कि प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से उंहें मेजबान actin बहुलकीकरण रास्ते के साथ हस्तक्षेप करने के लिए और actin धूमकेतु पूंछ कि उनके आगे लैबोरेटरी16,20की सुविधा का उत्पादन करने में सक्षम । संक्रमण का एक परिणाम के रूप में, मेजबान सेल के actin cytoskeleton गतिशील रूप से पुनर्व्यवस्थित करने की जरूरत है एक तरीके से है कि अभी भी पूरी तरह से विशेषता नहीं है, संभावित शारीरिक बलों वे अपने ECM पर और प्रत्येक पर लागू सहित मेजबान कोशिकाओं के यांत्रिक को प्रभावित कर अन्य. इन प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए, मानव microvascular endothelial कोशिकाओं (HMEC-1) तीन कारणों के लिए मॉडल मेजबान कोशिकाओं के रूप में चुना गया: 1. endothelial कोशिकाओं को उच्च mechanosensitive के रूप में वे लगातार शारीरिक संकेतों को अलग करने के लिए संपर्क कर रहे है21जाना जाता है; 2. रणनीतियां Lm संक्रमित endothelial कोशिकाओं को रोजगार अभी भी मोटे तौर पर22अज्ञात; और 3. HMEC-1 एक अमर सेल लाइन कर रहे है और कर सकते हैं, इसलिए, आसानी से और संस्कृति हो आनुवंशिक हेरफेर के अधीन ।
मेजबान कोशिकाओं के जीवाणु संक्रमण ज्यादातर कोशिकाओं12,14,23के शारीरिक ECM से काफी कड़ा कर रहे हैं कि कांच या polystyrene सब्सट्रेट पर कोशिकाओं बोने के द्वारा इन विट्रो में अध्ययन किया गया है. कोशिकाओं के संक्रमण की जांच करने के लिए एक मैट्रिक्स जिसका कठोरता शारीरिक रूप से प्रासंगिक है और जीवाणु रोगजनकों द्वारा कोशिकाओं के संक्रमण पर ECM कठोरता की भूमिका स्पष्ट करने के लिए, हम एक अभिनव निर्माण पतली पर आधारित दृष्टिकोण का पालन मल्टी वेल प्लेट्स पर स्वरित्र कठोरता के microbead-एंबेडेड polyacrylamide hydrogels । प्रस्तावित दृष्टिकोण की नवीनता में निहित है कि यह कई शर्तों की निगरानी की अनुमति देता है एक साथ अपनी बहु के कारण अच्छी तरह से प्रारूप और में है कि यह कई विशेष रूप से रास्ते सब्सट्रेट निर्माण कर रहे है के कारण तकनीकों के साथ संगत है । HMEC-1 कोशिकाओं को इन प्रोटीन लेपित hydrogels पर वरीयता प्राप्त थे और फिर अलग Lm उपभेदों कि या तो internalization पर फ्लोरोसेंट हो या constitutively फ्लोरोसेंट से संक्रमित । मेजबान HMEC-1 कोशिकाओं के संक्रमण संवेदनशीलता पर ECM कठोरता की भूमिका प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया था । इसके अलावा, immunostaining और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का पालन और आंतरिक बैक्टीरिया के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया गया । अंत में, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (TFM) सफलतापूर्वक कर्षण तनाव पर Lm संक्रमण के प्रभाव की विशेषता है कि मेजबान endothelial कोशिकाओं संक्रमण के दौरान उनके मैट्रिक्स पर लागू करने के लिए प्रदर्शन किया गया था । प्रस्तुत परख आसानी से अनुयाई कोशिकाओं के संक्रमण संवेदनशीलता पर ECM कठोरता के प्रभाव पर आगे की पढ़ाई सक्षम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है अलग सेल लाइनों या रोगजनकों का उपयोग कर ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

Extracellular मैट्रिक्स कठोरता कई पर्यावरणीय यांत्रिक उत्तेजनाओं कि अच्छी तरह से सेलुलर व्यवहार, समारोह, और सामांय रूप से भाग्य को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है में से एक शामिल हैं । हालांकि तेजी से अधिक अनुयाई सेल प्रकार ' प्रतिक्रियाओं मैट्रिक्स कठोरता को विशेषता है, कैसे अनुयाई ' कोशिकाओं जीवाणु संक्रमण के लिए संवेदनशीलता पर निर्भर करता है मैट्रिक्स कठोरता मोटे तौर पर अज्ञात है, के रूप में है पर जीवाणु संक्रमण का प्रभाव मेजबान कोशिकाओं के यांत्रिक । हम परिकल्पना है कि एक जीवाणु संक्रमण के लिए मेजबान endothelial कोशिकाओं की संवेदनशीलता मैट्रिक्स की कठोरता पर निर्भर करता है जिस पर इन कोशिकाओं रहते हैं, और है कि बैक्टीरिया के साथ मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण उनके यांत्रिक बदल जाएगा । इन दो परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए, endothelial कोशिकाओं मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया मेजबान और लिस्टिरिया monocytogenes एक मॉडल रोगज़नक़ के रूप में । एक उपंयास बहु अच्छी तरह से प्रारूप परख विकसित करके, हम बताते है कि एल monocytogenes द्वारा endothelial कोशिकाओं के संक्रमण पर मैट्रिक्स कठोरता का प्रभाव मात्रात्मक प्रवाह cytometry और माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा immunostaining के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, मेजबान endothelial सेल के यांत्रिक पर एल monocytogenes संक्रमण के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है । प्रस्तावित विधि ऊतक के प्रभाव के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है-अनुयाई कोशिकाओं के जीवाणु संक्रमण पर प्रासंगिक यांत्रिकी, जो कोशिकाओं के बीच यांत्रिक बातचीत को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है, उनके extracellular मैट्रिक्स, और रोगजनक बैक्टीरिया । इस विधि भी सेल यांत्रिक और सब्सट्रेट कठोरता की प्रतिक्रिया पर अध्ययन के अंय प्रकार की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है, जहां यह महत्वपूर्ण है करने के लिए एक प्रयोग में समानांतर में कई दोहराने प्रदर्शन कर सकता है ।

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

हम एक बहु अच्छी तरह से प्रारूप polyacrylamide-अनुयाई कोशिकाओं के जीवाणु संक्रमण पर extracellular मैट्रिक्स कठोरता के प्रभाव की जांच के लिए परख आधारित विकसित की है । इस परख प्रवाह cytometry, immunostaining, और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के साथ संगत है, कोशिकाओं के बीच यांत्रिक बातचीत के मात्रात्मक माप के लिए अनुमति, उनके extracellular मैट्रिक्स, और रोगजनक बैक्टीरिया ।

एक बहु अच्छी तरह से प्रारूप Polyacrylamide-अनुयाई कोशिकाओं के जीवाणु संक्रमण पर Extracellular मैट्रिक्स कठोरता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए परख आधारित

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

बैक्टीरियल आसंजन के अध्ययन में कतरें तनाव का परिचय

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

सेल भाग्य का पालन<em&gt; ई. कोलाई</em&gt; फेज Lambda द्वारा संक्रमण के बाद

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

एक दृश्य मॉनिटर T6SS मध्यस्थता बैक्टीरियल प्रतियोगिता परख

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

मेजबान सेल शाही सेना संश्लेषण पर वायरल संक्रमण के प्रभाव को मापने के लिए क्लिक करें रसायन विज्ञान का प्रयोग

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

एक का प्रयोग न्यूमोकोकल औपनिवेशीकरण पर प्रोबायोटिक्स के प्रभाव की जांच<em&gt; इन विट्रो</em&gt; पालन परख

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

प्रवाह से leukocytes की भर्ती पर stromal कोशिकाओं के प्रभाव का विश्लेषण

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

एक पारगम्य झिल्ली सम्मिलित आधारित संक्रमण प्रणाली के कार्यान्वयन के स्तनधारी मेजबान कोशिकाओं पर स्रावित बैक्टीरियल विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

बैक्टीरियल आसंजन और सीरम प्रतिरोध में Vitronectin की भूमिका का अध्ययन करने के लिए परख

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

पृथक वेसल्स के वैसोडायलेटेशन और चुस्त-त्वचा चूहे के बाह्य मैट्रिक्स का अलगाव

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

कपास bollworm में होस्ट-ऊतक वितरण, पारेषण मोड, और एक Densovirus की होस्ट स्वास्थ्य पर प्रभाव की जांच के लिए प्रोटोकॉल

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...