Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

I nostri ringraziamenti a M. piè di pagina, R. Lamasón, M. Rengaranjan e membri del Theriot Lab per le loro discussioni e supporto sperimentale. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), la compagnia di Gilliam HHMI per Advanced Studio (PoE), la Stanford Graduate Fellowship (PoE) e l'American Heart Association (E.E.B.). Citometria a flusso è stata eseguita presso la Stanford Shared FACS Facility.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Le cellule possono percepire una varietà di stimoli ambientali fisici, che possono influenzare non solo la morfologia delle cellule, ma anche la loro attività di espressione e proteina gene, influenzando così critico cella funzioni e comportamenti45,46. La rigidità della ECM delle cellule è sempre più apprezzata come un importante modulatore della motilità cellulare, differenziamento, proliferazione e in definitiva delle cellule destino47,48,49. Anche se ci sono stati molti gli avanzamenti recenti nella comprensione la complessa interazione biomeccanica tra cellule e loro ECM, piccolo è conosciuto circa come ambientale rigidità colpisce la suscettibilità delle cellule all'infezione batterica. Per facilitare tali studi, abbiamo sviluppato questa analisi multi-pozzetto Novella basata sulla fabbricazione consolidata di idrogel di poliacrilamide di rigidità sintonizzabile che è compatibile con infezione saggi50. Tradizionalmente, un'infezione batterica delle cellule nella coltura del tessuto è stata studiata su vetro o polistirolo superfici che sono circa 1-3 ordini di grandezza più rigidi di ECM naturale di più aderente celle8,51. Il test descritto qui apre nuove autostrade, consentendo lo studio delle interazioni batterio-ospite in un regime di rigidità ambientale fisiologicamente rilevanti.
Per la prova di concetto del saggio presentato, cellule HMEC-1 sono stati scelti come modello cellule dell'ospite aderente e Lm come un agente patogeno batterico di modello. Tuttavia, il dosaggio può essere esteso per ulteriori studi, se modificate in modo appropriato. Tali studi possono coinvolgere l'infezione di tipi cellulari diversi mammifero ospite aderente da ulteriori agenti patogeni, come batteri e virus. Per questo particolare test, gel erano proteine rivestite con collagene I, ma a seconda del tipo di cella di host, è possibile utilizzare un rivestimento-diverso ECM della proteina, come laminina o fibronectina, per facilitare l'attaccamento di cellule dell'ospite di interesse sull'idrogel 52. un'ulteriore considerazione che dipende dal tipo di cellula ospite è la gamma di rigidità di idrogel per essere studiato. La gamma di rigidità dovrebbe dipendere da ciò che è fisiologicamente rilevante per il tipo di cella di host specifico e quanto bene che ospitano si attacca formando uno strato monomolecolare ad un rigidità dato idrogel. Allo stesso modo, a seconda del patogeno di modello desiderato per essere esaminato, lievi modifiche potrebbe essere necessario essere implementato su infezione dosaggio descritto nel presente documento.
L'innovazione del dosaggio rispetto ai metodi precedenti per produzione poliacrilammide idrogeli24,50,53 si trova in determinate caratteristiche uniche integrato con il test proposto l'infezione. In primo luogo, nel caso degli idrogeli è costruite su piastre inferiori di vetro multi-pozzetto, che permette la proiezione di più condizioni contemporaneamente, nonché l'automazione di alcune procedure. Monitoraggio condizioni multiple allo stesso tempo o esaminando più repliche è cruciale poiché il risultato di tale approccio può essere influenzato da fattori quali il passaggio di cella di host e il numero preciso di batteri aggiunta per infettare i padroni di casa, che spesso cambiano tra esperimenti indipendenti. Un'ulteriore caratteristica unica di questo test è che nel caso degli idrogeli hanno un'altezza di circa 40 µm, che è abbastanza sottile per l'immagine utilizza la microscopia convenzionale. Abbiamo mostrato che possiamo eseguire con successo cellule vive microscopia e fissazione delle cellule sia immunostaining seguita da formazione immagine, senza introdurre la fluorescenza di fondo alto. Infine, nel caso degli idrogeli è costituiti da due strati, con quella superiore, avendo incorporato microsfere fluorescenti, confinati in un unico piano focale. Questo attributo assicura che non ci sarà nessuna luce di out-of-focus interferire durante l'imaging. La presenza delle perline consente sia l'esame della topografia superficiale dei gel per garantire che essi siano uniformi e migliora le prestazioni del TFM e MSM24,32,41. Con TFM e MSM, è possibile calcolare le forze cella-ECM e cellula-cellula rispettivamente delle cellule che si trovano in diverse matrici di rigidezza. Utilizzando questa analisi Novella, è possibile fare tali misurazioni di forze fisiche confrontando simultaneamente sia il contributo di rigidità dell'ambiente e dell'infezione. Seguendo tale approccio, l'infezione di effetto ha sulla cellula ospite meccanica durante tutto il corso può essere determinato. Inoltre, l'evoluzione delle sollecitazioni intracellulare delle cellule può essere calcolata usando MSM e può essere utilizzato come una misura dell'integrità barriera dello strato monomolecolare. Infine, data la natura multi-pozzetto del test, è possibile contemporaneamente introdurre perturbazioni farmacologiche e genetiche con un'infezione batterica, di indagare in modo più approfondito la complessa interazione tra host cella meccanica ed infezione.
Una limitazione intrinseca della tecnica si trova nella rigidità del substrato di effetto potrebbe avere il tasso di proliferazione delle cellule. In genere, nelle analisi di infezione, dobbiamo far sì che la densità delle cellule ospite in condizioni diverse è lo stesso. Ecco perché la densità delle cellule di per sé può avere un effetto sulla suscettibilità dei padroni di casa all'infezione. Le cellule HMEC-1 che sono state usate come cellule dell'ospite non mostrano una differenza significativa nel loro numero quando seminato per 24 h nel caso degli idrogeli. Tuttavia, diversi tipi di cellule potrebbero esibire proliferazione differenziale, in base alla rigidità di idrogel, che può influenzare gli studi di infezione. Allo stesso modo, bias di infezione possono sorgere quando le cellule non formano monostrati o non fissare bene su idrogeli, come si verifica quando alcuni tipi di cellule sono seminati su matrici molto morbidi (ad esempio, le cellule endoteliali del cordone ombelicale umano o rene canino Madin-Darby cellule epiteliali seminate su 0.6 kPa idrogeli54,55). Per quanto riguardano i patogeni, alcuni batteri (ad es., Borrelia burdgorferi) possono attaccarsi a ospitare le cellule e li invade, ma può anche trasmigrano attraverso di loro56. Non abbiamo ancora testato se questo test avrebbe funzionato per gli studi di trasmigrazione di agente patogeno, ma sembra possibile, poiché gli studi precedenti sui neutrofili trasmigra seminate su PA idrogeli le cellule endoteliali sono stati documentati per lavorare con successo57. Ci sono stati un sacco di studi condotti che Mostra come per la fabbricazione di idrogel di poliacrilamide di un determinato modulo di Young mescolando le concentrazioni adeguate di acrilammide e bis-acrilammide24,25,26 ,27. Tuttavia, soprattutto quando si desideri eseguire TFM esperimenti sulle cellule che risiedono su idrogeli di rigidità variabile, è fondamentale per confermare la rigidità prevista di idrogeli mediante AFM o altre tecniche di rientro58. Lievi scostamenti dal valore atteso possono verificarsi a causa di un diverso solvente utilizzato o una soluzione stock di acrilammide invecchiato, o dai modi AFM misure sono eseguite (ad esempio, la forma della punta dell'AFM). Infine, l'approccio presentato qui è basato sulla semina di cellule dell'ospite su matrici 2D, che possono differire da uno scenario 3D più realistico e fisiologicamente rilevante. Tuttavia, produzione gel 3D con rigidità sintonizzabile, li semina con cellule dell'ospite e quindi infettandoli con agenti patogeni, ancora comprende talune difficoltà tecniche. Tuttavia, prevediamo che nel prossimo futuro saremo in grado di estendere l'analisi corrente per lo studio di infezione in un ambiente 3D.
Per riassumere, il protocollo descritto unitamente ai risultati preliminari forniscono la prova che questa analisi novella può diventare uno strumento estremamente utile per studiare l'infezione della cellula ospite aderente con batteri patogeni in modo quantitativo e in modo molto più ambiente fisiologicamente rilevanti rispetto precedentemente esaminati. Il potere di fabbricare poliacrilammide idrogeli nell'impostazione proposta sta nel fatto che il dosaggio è compatibile con le prestazioni di più tecniche quali la citometria a flusso, immunostaining seguita da microscopia chiara e la microscopia di forza di trazione. Il dosaggio può essere utilizzato per gli studi che coinvolgono l'infezione di tipi cellulari diversi host aderente da agenti patogeni, che prevediamo avrà un impatto significativo in entrambi dipanando le strategie con cui gli agenti patogeni infettano padroni di casa e nel facilitare lo sviluppo di interventi terapeutici contro le infezioni.

Cellule in tessuti più animali sono in genere aderente, allegare sia di cellule vicine e alla loro matrice extracellulare (ECM). L'ancoraggio delle cellule alla loro ECM è fondamentale per molti processi cellulari che vanno da motilità cellulare a cellule di proliferazione e sopravvivenza1,2. Cellulare ancoraggio alla ECM dipende la composizione di ECM e la rigidità. Le cellule rispondono ai cambiamenti in quest'ultimo di riorganizzare in modo dinamico la loro citoscheletro, adesioni cellula-ECM e cellula-cellula, che a sua volta criticamente alterano cella biomeccanica e funzioni3,4,5,6 . Rigidità di ECM può variare nello spazio (cioè, posizione anatomica), nel tempo (cioè, invecchiamento) e in processi patofisiologici (ad es., arteriosclerosi, cancro, infezioni, ecc.). Per esempio, è ampiamente accettato che endoteliali cellule che risiedono su più rigido-rispetto al più morbido-matrici esercitano forze aumentate a loro ECM e a vicenda ed esibiscono aumentata motilità e proliferazione di7,8. Allo stesso modo, fibroblasti che risiedono su matrici più rigidi conferiscono elevata forza contrattile per loro ECM e visualizza aumentata proliferazione, motilità ed ECM produzione9,10,11. Anche se cella meccanica e risposta alla rigidità di ECM sono stati studiati estesamente per vari tipi di cellule, il rapporto tra cellule aderenti, la rigidità delle loro ECM e infezioni batteriche è ancora in gran parte sconosciuta.
Per studiare il ruolo della rigidità di ECM in interazioni delle cellule batteri-ospite, L. monocytogenes (Lm) è stato scelto come l'agente patogeno del modello. LM è un batterio ubiquista di tossinfezione alimentare che possa causare infezioni sistemiche in un'ampia varietà di mammiferi padroni di casa. Questo agente patogeno intracellulare facoltativo può spostare dall'epitelio intestinale in organi distanti passando attraverso diversi tipi di endotelio vascolare. Se si apre un varco la barriera emato - encefalica, Lm può causare la meningite, e quando attraversa la placenta, può causare aborto spontaneo12,13. LM può infettare tipi cellulari diversi host e può farlo utilizzando strategie patogene distinte. Infezione di LM è stato studiato principalmente nel contesto delle cellule epiteliali, mentre molto meno è conosciuto circa come Lm può infettare e bypass cellule endoteliali che allineano il lume dei vasi sanguigni14,15,16. Inoltre, è ancora in gran parte sconosciute come la rigidità del ECM dove risiedono le cellule endoteliali modula capacità di Lm di invadere queste cellule dell'ospite e per poi diffondersi. LM e diverse altre specie batteriche (cioè, Rickettsia parkeri) approfitta del citoscheletro dell'host cellule che infettano a entrambi invadono nel loro citoplasma e facilitano la diffusione della cellula--cellula17 , 18 , 19. che raggiungono attraverso l'espressione di proteine che permettono loro di interferire con le vie di polimerizzazione dell'actina host e di produrre code di cometa di actina che facilitano la loro propulsione16,20. Come conseguenza dell'infezione, il citoscheletro della cellula ospite ha bisogno di riorganizzare in modo dinamico in un modo che è ancora non completamente caratterizzato, potenzialmente influenzare la biomeccanica delle cellule dell'ospite, tra cui le forze fisiche che esercitano sul loro ECM e su ciascuna altri. Per esaminare questi processi, cellule endoteliali microvascolari umane (HMEC-1) sono stati scelti come cellule dell'ospite modello per tre motivi: 1. le cellule endoteliali sono noti per essere altamente mechanosensitive poiché sono sempre esposte a vari spunti fisici21; 2. le strategie che LM impiega per infettare le cellule endoteliali sono ancora in gran parte sconosciuto22; e 3. HMEC-1 sono una linea di cellule immortalizzate e possono, pertanto, essere facilmente coltivate e sottoposti a manipolazione genetica.
Infezione batterica delle cellule dell'ospite è stato studiato in vitro seminando cellule su vetro o polistirolo substrati che sono significativamente più rigidi di ECM fisiologico della maggior parte delle cellule12,14,23. Per esaminare l'infezione delle cellule seminate su una matrice la cui rigidità è fisiologicamente rilevanti e per delucidare il ruolo di rigidezza di ECM sull'infezione delle cellule di batteri patogeni, abbiamo seguito un approccio innovativo basato sulla fabbricazione di sottile poliacrilammide incorporato della microperla idrogeli di rigidezza sintonizzabile su piastre multi-pozzetto. La novità dell'approccio proposto risiede in quanto esso consente il monitoraggio più condizioni contemporaneamente grazie al suo formato multi-pozzetto e in quanto è compatibile con le tecniche multiple a causa di quella particolare che i substrati sono costruiti. Cellule HMEC-1 sono state seminate su questi idrogeli rivestite con proteine e poi infettate da diversi ceppi di Lm che diventano fluorescenti all'interiorizzazione o sono costitutivamente fluorescenti. Il ruolo della rigidità di ECM sulla suscettibilità di infezione delle cellule HMEC-1 ospite è stato valutato da citometria a flusso. Inoltre, microscopia di fluorescenza e di immunostaining sono stati utilizzati per distinguere tra batteri aderenti e interiorizzati. Infine, microscopia di forza di trazione (TFM) è stato effettuato con successo per caratterizzare l'effetto dell'infezione di Lm sulle sollecitazioni di trazione che cellule endoteliali dell'ospite esercitano il loro matrici durante l'infezione. Il saggio presentato può essere facilmente modificato per abilitare ulteriori studi sull'effetto di rigidità ECM sulla suscettibilità di infezione delle cellule aderenti utilizzando linee cellulari differenti o agenti patogeni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

Rigidità di matrice extracellulare comprende uno degli stimoli meccanici ambientali multipli che sono ben noti per influenzare il comportamento cellulare, funzione e destino in generale. Anche se le risposte dei sempre più più tipi di cellule aderenti alla rigidità di matrice sono state caratterizzate, come aderente suscettibilità delle cellule all'infezione batterica dipende dalla rigidità della matrice è in gran parte sconosciuta, come è l'effetto dell'infezione batterica sul biomeccanica della cellula ospite. Supponiamo che la suscettibilità delle cellule endoteliali dell'ospite ad un'infezione batterica dipende dalla rigidità della matrice in cui queste cellule risiedono, e che l'infezione dell'ospite le cellule con i batteri cambierà loro biomeccanica. Per verificare queste due ipotesi, le cellule endoteliali sono state utilizzate come modello host e Listeria monocytogenes come agente patogeno di modello. Lo sviluppo di un'analisi del romanzo formato multi-pozzetto, indichiamo che l'effetto di rigidità di matrice sull'infezione di cellule endoteliali da L. monocytogenes può essere valutata quantitativamente mediante citometria a flusso e immunostaining seguita da microscopia. Inoltre, utilizzando la microscopia a forza della trazione, l'effetto dell'infezione di L. monocytogenes biomeccanica delle cellule endoteliali host possa essere studiato. Il metodo proposto permette l'analisi dell'effetto della meccanica del tessuto-rilevanti sull'infezione batterica delle cellule aderenti, che è un passo fondamentale verso la comprensione delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare, e batteri patogeni. Questo metodo è anche applicabile a una vasta gamma di altri tipi di studi sulla biomeccanica di cella e la risposta alla rigidità del substrato dove è importante essere in grado di eseguire molte repliche in parallelo in ogni esperimento.

Sensibilità di rigidità-dipendente di ECM delle cellule HMEC-1 all'infezione di Lm: PA idrogeli di rigidità variabile, tutti superficie-rivestito con collagene I, sono stati costruiti sulle piastre di vetro multi-pozzetto inferiore come descritto nella fase 1 del protocollo (Vedi Figura 1). AFM sono state effettuate per confermare la rigidezza esatta degli idrogeli, come descritto in precedenza26,27 (Vedi Figura 2). Studi precedenti hanno mostrato che la conformità locale della membrana basale delle cellule endoteliali può variare da 1 kPa (ad es., tessuto cerebrale) a 70 kPa (ad es., aorta)36,37,38, 39 , 40. Pertanto, abbiamo scelto di testare l'infezione delle cellule HMEC-1 che risiedono su matrici con la rigidità seguente: 0,6 kPa, 3 kPa, kPa 20 e 70 kPa. Per ogni rigidità di idrogel, sei idrogeli furono fabbricati per valutare la riproducibilità dei risultati.
Citometria a flusso è stato utilizzato per valutare la suscettibilità di rigidità-dipendente di ECM di cellule HMEC-1 all'infezione Lm (Vedi Figura 3). Cellule HMEC-1 sono state infettate con un ceppo di Lm (JAT985) che esprime un marcatore fluorescente dopo internalizzazione (actAp::mTagRFP), che permette la rilevazione di batteri intracellulari soltanto (Vedi figure 1 L - 1N). JAT985 manca anche ActA, disabilitando i batteri da diffusione da cella a cella, poiché ActA è necessario per la formazione di code di cometa di actina e successiva diffusione batterica. 7 - post-l'infezione 8 h, l'infezione delle cellule HMEC-1 è stato valutato mediante citometria a flusso. Per garantire l'analisi delle singole cellule, la maggior parte della distribuzione dei conteggi delle cellule era stata eliminata utilizzando l'in avanti rispetto al grafico a dispersione laterale, e poi una seconda fase di gating è stata effettuata per escludere le celle che presentano autofluorescenza (Vedi figure 3A - 3C ). I risultati preliminari, raffigurati in Figura 3 dimostrano che l'infezione di HMEC-1 con Lm è circa due volte maggiore per cellule HMEC-1 che risiedono sul rigida 70 kPa idrogeli rispetto alle cellule che risiedono sui morbido idrogeli kPa 0,6 (vedere figure 3B - 3D). la suscettibilità di infezione Lm aumentata delle cellule HMEC-1 che risiedono su rigida rispetto alle matrici morbidi potrebbe essere dovuto a: 1. aumentata aderenza Lm HMEC-1; 2. maggiore invasione di Lm in HMEC-1; o 3. entrambi il co-avvenimento sopra. Per verificare quale ipotesi detiene, cellule HMEC-1 sono state seminate su soft (3 kPa) e rigida (70 kPa) idrogeli e infettate con costitutivamente GFP esprimendo Lm (Vedi figure 4A - 4C). I campioni sono stati risolti poco dopo l'infezione ed i batteri esterni (aderenti) erano macchiati con gli anticorpi. Usando la microscopia quantitativa, abbiamo scoperto che ci sono significativamente più batteri aderendo al HMEC-1 quando le cellule ospiti risiedono sul rigido rispetto al gel molli (Vedi Figura 4D). Coerenti con i dati di citometria a flusso, ci sono significativamente più batteri interiorizzate di HMEC-1 quando le cellule ospiti risiedono sul rigido rispetto al gel molli (Vedi Figura 4E). Tuttavia, l'efficienza di invasione (batteri interiorizzato/numero totale di batteri) di Lm in cellule HMEC-1 è simile, indipendentemente dalla rigidità del substrato (Vedi Figura 4F).
Microscopia di forza di trazione delle cellule HMEC-1 Lm-infettati: L'infezione delle cellule HMEC-1 LM potrebbe alterare la biomeccanica delle cellule ospiti infetti, tra cui la forza di attaccamento alla loro ECM o di ogni altro, che interessano l'integrità della barriera. Abbiamo cercato di valutare se questo potrebbe essere il caso mediante microscopia a forza trazione32 per calcolare le forze di trazione di cella-ECM e monostrato Stress microscopia41 per calcolare le forze tensionale intracellulare. Figura 5 raffigura mappe del campo di deformazione, campo di sforzo di trazione e campo di tensione intracellulare delle cellule HMEC-1 residente su 20-kPa idrogeli a tempi diversi punti post-infezione. Figure 5A - 5D fanno riferimento a celle di controllo non infetto HMEC-1 mentre figure 5E - 5h consultare HMEC-1 cellule infettate con Lm ad una molteplicità di infezione pari a 300/cellula dei batteri. Questo lavoro preliminare suggerisce che infettate cellule HMEC-1 riducono la grandezza della loro cella-ECM e sottolinea intracellulare nel corso di un'infezione con Lm, considerando che non è osservato per le cellule di controllo non infetto.
Diffusione a ECM rigidità-dipendente Lm attraverso strati monomolecolari HMEC-1: Time-lapse microscopia è stata usata per studiare l'effetto rigidità matrice ha sulla diffusione di Lm attraverso strati monomolecolari HMEC-1. Come Lm si diffonde attraverso il monostrato, i batteri creano un focus di infezione che cresce in funzione del tempo (Vedi Figura 6A e Video figure 1 e 2). L'area di messa a fuoco l'infezione è stata misurata tracciando un guscio convesso, il più piccolo poligono convesso che racchiude un insieme di punti, intorno i batteri42. Non esiste alcuna metrica standard nel settore per misurare l'efficienza della diffusione di cellula--cellula di L. monocytogenes attraverso un monostrato di cellule dell'ospite. Per valutare l'efficienza di diffusione, alcuni hanno contato il numero di cellule dell'ospite in un focus di infezione41, e altri hanno confini disegnati manualmente intorno al gruppo di infezione host cellule43. Abbiamo scelto disegnare un poligono convesso intorno i batteri, perché è un processo automatizzato, coerente e computazionalmente economico per misurare l'efficienza della diffusione di L. monocytogenes . Così facendo, abbiamo trovato una lieve diminuzione dell'area focus di infezione nelle cellule HMEC-1 seminate su 70 kPa idrogel rispetto a quelle seminate su 3 matrici di kPa (Vedi Figura 6B e Video figure 1 e 2). Per determinare il tasso di crescita del focus di infezione, la distanza radiale è stata tracciata come funzione del tempo prendendo la radice quadrata dell'area di messa a fuoco l'infezione e questo dividendo da pi. Questa trasformazione matematica presuppone che la forma della messa a fuoco infezione è approssimativamente circolare44. Per misurare la velocità della crescita messa a fuoco, è stato misurato il tasso di cambiamento (cioè, la pendenza) della distanza radiale per entrambi matrici 3 e 70 kPa. Questo approccio chiarito che il focus di infezione è cresciuto più velocemente e monotona in cellule HMEC-1 seminate su matrici 3-kPa. Tuttavia, la messa a fuoco è cresciuto significativamente più lento (primo 200 min) e leggermente più lento (200-600 min) in cellule seminate su matrici 70-kPa (Vedi Figura 6C). Infatti, l'analisi di ulteriori dati ha confermato che il focus di infezione è cresciuto, in media, due volte più lento in matrici 70-kPa, soprattutto durante il primo min 200 (Vedi Figura 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> Figura 3 : ECM rigidità-dipendente suscettibilità delle cellule HMEC-1 per invasione di Lm misurata mediante citometria a flusso .  Cellule HMEC-1 sono state infettate con Lm (JAT985) e l'infezione è stata analizzata tramite flusso cytometry. A. questo pannello mostra un lato contro dispersione avanti per rappresentante cellule HMEC-1 provenienti da un singolo pozzo. La distribuzione di massa delle cellule è stata selezionata tramite gating per escludere detriti (a sinistra) e delle cellule doppiette o triplette (a destra). B. questo grafico mostra un istogramma del logaritmo dell'intensità di fluorescenza Lm per cella per HMEC-1 ha placcato il morbido 0,6 kPa. C. questo grafico mostra un istogramma del logaritmo dell'intensità di fluorescenza Lm per cella per HMEC-1 placcato sulla rigida 70 kPa idrogeli. Gli istogrammi per N = 4-6 ripetizioni sono mostrati in diversi colori. Istogramma delle cellule controllo non infetto è viola. La porta utilizzata per definire che cosa è infetto è mostrata in rosso. Il MOI è 100 e l'infezione è stata valutata 8 h post-infezione. D. dati mostrano la percentuale delle cellule infettate HMEC-1 versus idrogel rigidità (N = 5). Le barre orizzontali raffigurano media dei dati. Il P-value è stato calcolato con il test di Wilcoxon Rank Sum non parametrica. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> Video Figura 1: diffusione intracellulare LM (canale rosso) attraverso un monostrato di cellule HMEC-1 (fase) seminate su un substrato di 3-kPa. Le cellule erano imaged in media L-15 di Leibovitz (10% FBS, 20 µ g/mL di gentamicina) dentro una camera ambientale equilibrata a 37 ˚ c. Le immagini sono stati raccolti ogni 5 min. La velocità è 15 fotogrammi/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> Video Figura 2: diffusione di Lm intracellulare (canale rosso) attraverso un monostrato di cellule HMEC-1 (fase) seminate su un substrato di 70-kPa. Le cellule erano imaged in media L-15 di Leibovitz (10% FBS, 20 µ g/mL di gentamicina) dentro una camera ambientale equilibrata a 37 ° C. Le immagini sono stati raccolti ogni 5 min. La velocità è 15 fotogrammi/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Modulo di Young (E, kPa)</td>
			<td>% Di acrilammide (dal 40% delle scorte)</td>
			<td>Bisacrylamide % (dal 2% delle scorte)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.6</td>
			<td>3</td>
			<td>0,045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0,195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
</tbody></table> Tabella 1. Composizione di idrogel di poliacrilamide (PA) di diversa rigidezza. In questa tabella, la percentuale di soluzione stock 40% di acrilammide e la percentuale di stock 2% bis-acrilammide soluzione per raggiungere un determinato rigidità (modulo di Young, E) sono indicati in colonne diverse.
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> Materiale supplementare 1. Calcolo della tensione intracellulare da sollecitazioni di trazione calcolata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Abbiamo sviluppato un test multi-pozzetto formato poliacrilammide per sondare l'effetto di rigidità di matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule aderenti. Questo test è compatibile con citometria a flusso, immunostaining e microscopia di forza di trazione, permettendo per la misurazione quantitativa delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare e batteri patogeni.

Un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

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