Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

誠に感謝フッター、r. Lamason、m. Rengaranjan、議論の実験的なサポート ・ テリオ研究室のメンバー。この作品は、高度な研究 (F.E.O.)、スタンフォード大学院フェローシップ (F.E.O.) アメリカ心臓協会 (E.E.B.) に NIH R01AI036929 (J.A.T.)、ハワード ヒューズ (J.A.T.)、ハワード ヒューズ ギリアム交わりによって支えられました。フローサイトメトリーは、スタンフォード共有 FACS 施設で行われました。

著者が明らかに何もありません。

細胞はさまざまな細胞の形態だけでなく、その遺伝子発現および蛋白質活動、重要な細胞機能および動作45,46に影響を与えることができる影響を与える物理的環境手がかりを感じることができます。セルの ECM の剛性は、細胞運動、分化、増殖、および最終的に細胞の運命47,48,49の重要な変調器としてますます感謝です。細胞とその ECM の複雑な生体力学的相互作用を理解することの多くの最近の進歩をされているが、どのように環境剛性について細菌感染に対する細胞の感受性に影響を与える少し知られています。このような調査を促進する、感染症の試金50で互換性が可変剛性のポリアクリルアミド ゲルの老舗作製に基づいてこの小説ウェル アッセイを開発しました。伝統的に、ガラスや約 1 3 桁が最も付着性細胞8,51自然 ECM より硬めは、ポリスチレンの表面上の組織培養細胞の細菌感染を研究されています。ここで説明アッセイは、関連する生理学的環境剛性政権における細菌ホスト相互作用の研究を有効にする新しい高速道路を開きます。
提示されたアッセイのコンセプトの証明の HMEC 1 細胞モデル付着性宿主細胞と Lm モデルの細菌の病原体として選ばれました。ただし、適切に変更された場合は、アッセイをさらなる研究に対して拡張できます。このような研究は、細菌やウイルスなどを含むその他の病原体によって異なる哺乳類付着性宿主細胞の種類の感染症を含むことができます。この特定のアッセイ ゲル蛋白質 - でコーティングしたコラーゲンは、ホスト細胞の種類に応じてそれはヒドロゲルへの関心の宿主細胞の付着を容易にするために異なる ECM タンパク質-コーティング、フィブロネクチン、ラミニンなどを使用すること52。 ホスト セルの種類に依存する追加の考慮事項が検討するハイドロゲル剛性範囲。剛性の範囲に決まるべきである何が特定のホスト セルの型に関連する生理学的、どれだけをホストする接続与えられた剛性ハイドロゲル.に単分子層を形成同様に、検討する必要に応じて、モデル病原体によってわずかな変更は記載感染試験に実装する必要があります。
製造ポリアクリルアミド ゲル24,50,53にある特定の特徴のための以前の方法と比較して試金の技術革新は、提案された感染症法に統合。まず、マルチもガラスの底板を同時に複数の条件のスクリーニングを可能にするだけでなく、特定の手順の自動化、ゲルが構築されます。これはしばしば変更同時にまたは複数の複製は非常に重要ですのでこのようなアプローチの結果は、ホスト細胞の通路と追加のホストに感染する細菌の正確な数などの要因によって影響される可能性が調べることで複数の条件を監視、間の独立した実験。このアッセイのユニークな特徴は、ゲルがある従来の顕微鏡を使用してのイメージを十分に薄い高さ約 40 μ m のこと。我々 は、我々 は、両方の生細胞顕微鏡検査およびセル固定および高いバック グラウンド蛍光を導入することがなくイメージング、続いて免疫染色に正常に実行できますを示した。最後に、ゲルは、蛍光マイクロ ビーズ、単一の焦点平面に閉じ込められた埋込アッパーの 1 つで、2 つの層から成っています。この属性は、アウト フォーカスの光イメージング中に干渉することがないことを保証します。ビーズの存在により、制服が、TFM と MSM の24,32,41のパフォーマンスが向上を確保するためゲルの表面地形学です。TFM と MSM、それぞれ可変剛性マトリックスに存在する細胞の細胞外マトリクスと細胞の力を計算することが可能です。この小説の試金を使用して、環境の剛性と感染症の両方の貢献を同時に比較することによって物理的な力のような測定をすることが可能です。次のようなアプローチ、効果感染は、宿主細胞そのコースを通して力学を定めることができます。また、細胞の細胞内ストレスの進化は MSM を使用して計算することができます、単層の障壁の完全性の測定として使用することができます。最後に、アッセイのウェルの性質を考えると、それはより多くの深さでホスト細胞力学と感染症との間の複雑な相互作用を調査するため、細菌感染症の薬理学的および遺伝的摂動を同時に導入することが可能。
細胞の増殖速度に及ぼす基板の剛性にある技術の固有の制限の 1 つがあります。通常、感染症法では、異なる条件下でホストの細胞密度が同じであることを確認する必要があります。単独で細胞密度があります感染ホストの感受性に影響を及ぼすためにです。宿主細胞として使用された HMEC 1 セル、ゲル上の 24 h のとき自分の番号の差が表示されません。ただし、異なる種類の細胞は差分の増殖、感染症研究をバイアスすることがでくハイドロゲル剛性によってを発生可能性があります。同様に、感染のバイアスが生じるときセル単分子膜を形成しないまたはゲル、特定の細胞のタイプは非常に柔らかい行列 (例えば、ひと臍帯血管内皮細胞やマディン-ダービー犬腎臓に播かれるときに発生するにも接続しないでください。上皮細胞は 0.6 kPa ヒドロゲル54,55でシードします。)ある特定の細菌 (例えば、ボレリア burdgorferi) に接続できる病原体に関する限りでは、宿主が彼らを侵略、それらを介しても生まれ変わることができます56。この試金は病原体の輪廻の研究、仕事だろうが、57を正常に機能する好中球 PA ヒドロゲルでシード内皮細胞細胞に関する過去の研究をされているので、それは可能と思われる場合我々 はまだ未テストします。アクリルアミドと bis アクリルアミド24,25,26 の適切な濃度を混合することによって与えられたヤングのポリアクリルアミド ゲルを製造する方法を示す調査の多くがずっとあります。 ,27。しかし、1 つの様々 な剛性のヒドロゲルに存在する細胞の TFM 実験を実行する欲望、特にとき、AFM または他のインデント技術58を通じてヒドロゲルの予想の剛性を確認する重要です。使用される各種の溶媒や高齢アクリルアミド原液、期待値からのわずかな偏差が発生する可能性や方法の原子間力顕微鏡による測定が実行される (例えば、原子間力顕微鏡の先端の形状)。最後に、ここに提示されたアプローチより現実的な生理学的関連性の高い 3 D のシナリオとは異なる 2次元行列に宿主細胞を播種に基づいています。ただし、可変剛性を有する 3 D ゲルを製造、宿主細胞とそれらをシードとし、病原体に感染するにはまだ、特定の技術的な問題が包含します。それにもかかわらず、我々 は、近い将来に我々 ことができる 3 D の設定で感染症を研究するため現在のアッセイを拡張するを予測します。
要するに、予備的な結果とともに記載されている治験はこの新規アッセイが定量的方法より多くの病原性細菌の付着菌の感染を研究するための非常に有用なツールになることを証拠を提供します。以前調べたより生理学的環境。光顕、続いて提案セットアップにおけるヒドロゲルあるアッセイ フローサイトメトリー、免疫染色などの複数の手法のパフォーマンスと互換性のあるポリアクリルアミドの加工力と牽引力顕微鏡。両方、病原体は、ホストを感染させる戦略を解くのとの開発を促進する上で重要な影響を及ぼすだろうと見込んで、病原体によって異なる付着性ホスト細胞の種類の感染症を含む研究のアッセイを使用ことができます。感染症に対する治療的介入は。

ほとんどの動物の組織内の細胞が通常付着、隣接する細胞とその細胞外マトリックス (ECM) の両方を取り付けます。細胞の ECM へのアンカレッジは細胞の運動性細胞の増殖と生存の1,2に至る多くの細胞プロセスにとって重要です。ECM に細胞の定着は、ECM の組成と剛性の両方に依存します。セルは、動的に再配置することで、細胞骨格、細胞バイオメカニクスと機能3,4,5,6 を批判的に順番変更細胞外マトリクスと細胞間の癒着、後者の変化に対応します。.時間 (すなわち、高齢化)、および病態生理学的プロセス (例えば、動脈硬化、癌、感染症、等)、(すなわち、解剖学的位置)、スペース、ECM 剛性によって異なります。例えば、それは広く受け入れられているその血管内皮細胞上に存在する硬めの柔らかい行列と比較して、ecm と互いに高められた力を及ぼし、増加の運動性と増殖7、8を展示します。同様に、剛性行列上に存在する線維芽細胞は、ECM の高い収縮力を伝えるし、増殖の亢進、運動、および ECM 生産9,10,11を表示します。様々 な細胞タイプ、付着性宿主細胞との関係を細胞力学と ECM 剛性への応答が広く調査された、ECM、および細菌感染症の剛性はありませんまだ主として知られています。
ECM 剛性細菌ホスト細胞の相互作用の役割を研究するには、菌、リステリア菌(Lm) は、モデルの病原体として選ばれました。Lm は、さまざまな哺乳類を宿主の全身感染症を引き起こす可能性がユビキタス食品由来の菌です。この通性細胞内の病原体は、血管内皮細胞の種類を調べることによって腸の粘膜上皮から遠隔臓器で移動できます。Lm は、髄膜炎を引き起こす可能性が血液脳関門を違反にする場合、それは胎盤を交差させる、自然流産12,13を生じる。Lm は別のホスト細胞型に感染し、病原性の明瞭な作戦を使用してこれを行うことができます。Lm 感染はあまり Lm に感染することができる方法について知られているが、バイパス血管内皮細胞の血管14,15,16の内腔上皮細胞においてほとんど研究されています。さらに、それはまだ主として知られている内皮細胞が存在する ECM の剛性が Lm の能力これらの宿主細胞に侵入して、広めるために調節します。Lm といくつか追加の細菌種の (すなわち、リケッチア parkeri) ホストの両方に感染した細胞、細胞質に侵入して細胞間普及17を容易にするためのアクチン細胞骨格の活用,18,19. 彼らはホスト アクチン重合経路を妨害して16,20代の前方に推進力を促進するアクチン彗星の尾を生成するそれらを可能にする蛋白質の表現を通して、それを達成します。感染症の結果として宿主細胞のアクチン細胞骨格は動的にはまだ完全に特徴付けられる、出すは、ECM と各物理的な力を含む宿主細胞のバイオメカニクスに影響を与える可能性のある方法で再配置する必要があります。その他。これらのプロセスを調べるひと血管内皮細胞 (HMEC-1) モデル宿主細胞として 3 つの理由から選ばれた: 1 内皮細胞が知られている高度機械受容変動の物理的な手がかり21; 常に公開されている。2. Lm を血管内皮細胞に感染する採用戦略がまだ未知22;3。HMEC 1 不死化細胞ラインし、したがって、こと簡単に培養ができ遺伝子操作を受けます。
主に宿主細胞の細菌感染症研究生体外でガラスや、ほとんど電池12,14,23の生理学的な ECM より大幅剛性ポリスチレン基板上に細胞を播種されて。その剛性は生理学的に関連する行列に播種された細胞の感染を調べる、病原性細菌によって細胞の伝染の ECM 剛性の役割を解明するためには、我々 従って薄く加工に基づく革新的なアプローチウェル プレートの可変剛性のビーズに埋め込まれたポリアクリルアミド ゲル。提案されたアプローチの目新しさはそれがウェル フォーマットにより同時に複数の条件を監視できると基板が組み込まれている特定の方法のための複数の技術と互換性があります。HMEC 1 細胞これらタンパク質被覆ヒドロゲルでシード, 内面に蛍光になるか恒常蛍光を発する Lm の異なる株に感染し.ホスト HMEC 1 細胞の感染感受性の ECM 剛性の役割は、フローサイトメトリーで評価しました。さらに、免疫染色と蛍光顕微鏡は、付着および内面化された細菌を区別するために使用されました。最後に、牽引力顕微鏡 (TFM) は、感染時にその行列に内皮細胞を発揮牽引応力に Lm 感染の影響を特徴付けるために成功しました。提示されたアッセイは、異なる細胞や病原体を用いた付着性のセルの伝染の感受性に及ぼす ECM 剛性に関する研究を有効にするには、さらに簡単に変更できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

細胞外マトリックスの剛性には、一般的な携帯電話の動作、機能、および運命に影響を与える知られている複数の環境機械刺激の一つが装備されています。ますます付着性のセル型のレスポンス剛性行列を特徴とすると、付着細菌感染に対する細胞の感受性によって決まるマトリックス剛性なんてとして主に知られているが細菌感染の影響で、宿主細胞のバイオメカニクス。我々 は細菌感染に対する宿主の血管内皮細胞の感受性によって異なりますこれらの細胞が存在するマトリックスの剛性とのバイオメカニクスが変更されるホストの感染が細菌細胞、仮説します。これら二つの仮説をテストするため、内皮細胞はモデルの病原体としてモデル ホストとリステリア菌として使用されました。小説ウェル フォーマット アッセイを開発することによってを示す菌、リステリア菌による内皮細胞の感染に及ぼす剛性マトリックスがフローサイトメトリー ・免疫染色顕微鏡続いてによって定量的に評価できます。さらに、ホスト内皮細胞バイオメカニクスの菌、リステリア菌感染の影響は牽引力顕微鏡を使用して、検討することができます。提案手法は、組織に関連する力学の付着性細胞の細胞、彼らの細胞外マトリックスの生体力学的相互作用の理解に向けての重要なステップである細菌の感染に及ぼす影響の解析と病原性細菌。このメソッドはさまざまな細胞のバイオメカニクスと基板剛性への応答に関する研究の他のタイプに適用されますも各実験では並行して多くの複製を実行することができる必要があります。

Lm 感染細胞 HMEC の ECM 剛性に依存の感受性: さまざまな剛性の PA ヒドロゲル、すべては表面をコーティングしたコラーゲン私、プロトコルの手順 1で説明したようにマルチよくガラス底板に造られた (図 1参照)。26,27を前述のように、ゲルの正確な剛性を確認する AFM 測定を行った (図 2参照)。過去の研究は、内皮細胞の基底膜のローカル コンプライアンス 1 kPa (例えば、脳組織) から 70 kPa (例えば大動脈)36,37,38,の範囲が示されています。39,40。 したがって、次剛性行列上に存在する HMEC 1 細胞の感染をテストしました: 70 kPa 20 kPa、3 kPa 0.6 kPa。各ハイドロゲル剛性の結果の再現性を評価するために六つのゲルを作製しました。
フローサイトメトリーは、Lm 感染 HMEC 1 細胞の ECM 剛性に依存した感受性を評価するために使用された (図 3参照)。HMEC 1 細胞は細胞内細菌のみ (参照図 1 L - 1N) の検出を許可する内面化 (actAp::mTagRFP) 後、蛍光マーカーを表す Lm ひずみ (JAT985) に感染していた。JAT985 はまた、ActA、ActA はアクチン彗星の尾およびそれに続く細菌の散布の形成に必要な細胞から細胞に広がってから細菌を無効にすることを欠いています。7-8 h 後 HMEC 1 細胞の感染は、フローサイトメトリーを使用して査定されました。単一細胞を分析するように、細胞数の分布の大部分は、対側の散布、フォワードを使用ゲートだったし、蛍光を示す細胞を除外する 2 番目のゲーティング ステップを行った、(図 3 a - 3 Cを参照してください。).図3 予備的な結果を示すその Lm HMEC 1 感染が約 2 倍 HMEC 1 セル ソフト 0.6 kPa ゲル上のセルと比較すると硬い 70 kPa ゲル上の大きい (図 3B - を参照してください。3D). ソフト行列と比べて硬い上に存在する HMEC 1 セルの Lm 感染感受性の増加に起因することができる: 1; HMEC 1 に Lm 付着力が強く。2. 増加 Lm 侵入 HMEC-1;または 3。上記の共起するの両方。HMEC 1 細胞が仮説を保持をテストするソフト (3 kPa) と硬い (70 kPa) ヒドロゲル シード, Lm を表現する GFP 恒常に感染して (図 4 a - 4 C参照)。サンプルは、感染直後に修正され、外部 (付着) 細菌は抗体で染色しました。定量的な顕微鏡を使用して、宿主細胞に存在する柔らかいゲル ( 4 図D参照) と比較して硬い場合 HMEC 1 へ付着したかなり多くの細菌があることがわかった。流れの cytometry のデータと一致して、大幅により多くの細菌は宿主細胞に存在する柔らかいゲル (図 4E参照) と比較して硬い場合 HMEC 1 によって内面化します。しかし、HMEC 1 セルに Lm の侵入効率 (細菌の内面/総細菌数) は同様に、基板の剛性に関係なく (図 4F参照)。
Lm 感染 HMEC 1 細胞の牽引力顕微鏡: Lm HMEC 1 細胞の感染は、添付ファイルの ECM にまたは互いにそのバリアの整合性に影響を与えず強度を含む、感染した宿主細胞のバイオメカニクスを変えることができます。我々 は細胞 ECM 牽引力と単分子膜応力顕微鏡41細胞内張力力を計算する計算する牽引力顕微鏡32を使用してケースをできるかどうかを評価しようと思う。図 5は、変形フィールド、牽引応力場と異なる時間ポイント感染後に 20 kPa ヒドロゲル上 HMEC 1 細胞の細胞内張力場のマップを示しています。図 5 a - 5 Dは、図 5E中感染制御 HMEC 1 セルを参照 - 5 H 300 細菌/セルと同じ感染症の多様性で Lm HMEC 1 細胞を参照してください。この準備作業は、感染制御の細胞のない観察されるに対し感染 HMEC 1 細胞が lm、感染の過程で細胞外マトリクスと細胞内ストレスの大きさを減らすことを示唆します。
ECM 依存剛性 Lm 普及 HMEC 1 分子の間で: 微速度顕微鏡観察の効果を調べるために, HMEC 1 分子による Lm の剛性行列が。Lm は、単分子膜に広がる、細菌は時間 (参照してください図 6Aとビデオ図 1および2) の関数として成長感染のフォーカスを作成します。感染症フォーカス部を凸、細菌42周りのポイントのセットを含む最小の凸ポリゴンを描画することによって測定しました。菌、リステリア菌宿主細胞の単層細胞-細胞拡散の効率を測定する分野では標準的な指標はありません。拡散効率を評価するためにいくつかの感染症フォーカス41の場合は、宿主細胞の数をカウントしているし、感染ホスト細胞43のグループの周りに手動で描画境界を持って他の人。菌、リステリア菌の拡散の効率を測定するための自動化された、一貫性、および計算安価なプロセスだから、細菌の周り凸多角形を描画しました。これにより我々 は 70 kPa ヒドロゲル シード 3 kPa 行列 (図 6Bとビデオの数字 1と2を参照) のそれらと比較されたときにシード HMEC 1 セルで感染症フォーカス領域のわずかな減少を見つけた。感染症フォーカスの成長速度を決定するには、半径の距離は感染症フォーカスの面積の平方根 pi によってこれを割ることによって時間の関数としてプロットしました。この数学的な変換では、感染症フォーカスの形状はほぼ円形44と仮定します。フォーカス成長の速度を測定するには、両方 3-70 kPa 行列の半径方向の距離の変化 (すなわち斜面) の速度を測定しました。このアプローチが明らかに感染症フォーカスが HMEC 1 セル 3 kPa 行列上でより速く、単調増加しました。ただし、フォーカスでは、大幅に遅くなります (最初の 200 分) とわずかに遅い (200 に 600 分) を (参照してください図 6C) 70 kPa 行列に播種された細胞に成長しました。確かに、さらにデータの分析を確認、感染症フォーカス伸び率は、平均では、2 倍 70 kPa 行列で特に最初の 200 分間 (図 6Dを参照してください)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> 図 3: Lm 侵略 HMEC 1 細胞の ECM 剛性に依存した感受性をフローサイトメトリーを用いて測定. HMEC 1 セルが Lm (JAT985) で感染し、感染したフローサイトメトリーで分析しました。A. このパネルは単一の井戸から来る代表 HMEC 1 細胞の前方散乱プロット対側を示しています。(左) 破片を除外し細胞ダブレット、トリプレット (右) のゲートを介して細胞の一括配布が選ばれました。B. HMEC 1 ソフト 0.6 kPa にメッキのため、このグラフはセルあたり Lm の蛍光強度の対数のヒストグラムを示しています。Cします。 このグラフは、HMEC 1 硬い 70 kPa ゲル上メッキのセルごとの Lm の蛍光強度の対数ヒストグラムを示しています。N のヒストグラム = 4-6 レプリケートが異なる色で表示されます。感染制御の細胞のヒストグラムは紫です。何が感染しているを定義するために使用するゲートは、赤で表示されます。覚書は 100、感染症は感染後評価 8 h。D. データを示すハイドロゲル剛性対感染 HMEC 1 細胞の割合 (N = 5)。水平のバーは、データの意味を表しています。P-値を求めた非パラメトリック Wilcoxon ランク合計テスト。<a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> ビデオ図 1: HMEC 1 細胞膜 (フェーズ) を介して細胞内 Lm (赤のチャネル) の普及はシード 3 kPa 基板上。リーボビッツの L-15 メディアでセルをイメージしました (10 %fbs、ゲンタマイシンの 20 μ G/ml) 内部環境室が 37 ° C に平衡します。画像は 5 分ごとに収集されました。映画は 15 フレーム/秒<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">してくださいここをクリックして、このビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> ビデオ図 2: 70 kPa 基板上 HMEC 1 細胞膜 (フェーズ) を介して細胞内 Lm (赤のチャネル) の普及がシードします。リーボビッツの L-15 メディアでセルをイメージしました (10 %fbs、ゲンタマイシンの 20 μ G/ml) 内部環境チャンバー平衡を 37 ° C画像は 5 分ごとに収集されました。映画は 15 フレーム/秒<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">してくださいここをクリックして、このビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ヤング率 (E, kPa)</td>
			<td>(株式 40%) からアクリルアミド %</td>
			<td>(株式 2%) から Bisacrylamide %</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.6</td>
			<td>3</td>
			<td>0.045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0.195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 1。さまざまな剛性のポリアクリルアミド (PA) ゲル組成します。この表の株式 40% アクリルアミド溶液の割合との割合在庫 2% ビス アクリルアミド溶液与えられた剛性 (ヤング係数, E) を達成するために別の列に示されています。
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> 補足資料 1。計算された牽引ストレスから細胞内張力の計算。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性をプロービングのためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイを開発しました。この試金は牽引力顕微鏡、細胞、細胞外マトリックスおよび病原性細菌の生体力学的相互作用の定量的測定を可能にする、免疫染色、フローサイトメトリーと互換性が。

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

T6SS媒介細菌競争を監視するには、Visualアッセイ

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査<em&gt;体外</em&gt;接着アッセイ

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

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Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

哺乳動物宿主細胞に分泌された細菌毒素の影響を研究するために、透過膜を挿入ベースの感染システムの実現

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

細菌の付着と血清抵抗性ビトロネクチンの役割を研究するための試金

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

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コットンボールワームでデンソウイルスのホストフィットネス上のホスト組織分布、伝送モード、および効果を調査するためのプロトコル

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェルフォーマットポリアクリルアミドを用いたアッセイ