Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

Vår takk til M. bunntekst, R. Lamason, M. Rengaranjan og medlemmer av det Theriot for diskusjoner og eksperimentell støtte. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam fellesskap for avanserte studier (F.E.O.), Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) og American Heart Association (E.E.B.). Flowcytometri ble utført ved Stanford deles FACS anlegget.

Forfatterne ikke avsløre.

Cellene kan forstand en rekke fysiske miljømessige signaler, som kan påvirke ikke bare cellenes morfologi, men også deres genet uttrykk og protein aktivitet, noe som påvirker kritiske celle funksjoner og atferd45,46. Stivhet av ECM celler er stadig mer verdsatt som en viktig modulator mobilnettet motilitet, differensiering, spredning, og til slutt cellen skjebne47,48,49. Selv om det har vært mange nylige fremskritt i å forstå komplekse biomekaniske samspillet mellom celler og deres ECM, er lite kjent om hvordan de miljømessige stivheten påvirker mottakelighet av celler til bakteriell infeksjon. For å lette slike studier, utviklet vi denne romanen flere godt analysen basert på veletablerte fabrikasjon av polyakrylamid hydrogels av tunable stivhet som er kompatibel med infeksjon analyser50. Tradisjonelt, har en bakteriell infeksjon i celler i vev kultur vært studert på glass eller polystyren overflater som er ca 1-3 størrelsesordener stivere enn naturlig ECM av mest tilhenger celler8,51. Analysen beskrevet her åpner nye motorveier av muliggjør studiet av bakterier vert interaksjoner i en fysiologisk relevante miljømessige stivhet regime.
Konseptbeviskode til presentert analysen, ble HMEC-1 celler valgt som modell tilhenger vertsceller og Lm som en modell bakteriell patogen. Imidlertid kan analysen forlenges for ytterligere studier hvis hensiktsmessig endret. Slike studier kan innebære infeksjon av ulike pattedyr tilhenger vert celletyper av flere patogener, som bakterier og virus. For denne spesielle analysen, gels ble protein-belagt med kollagen jeg, men avhengig verten celle, er det mulig å bruke en annen ECM protein-belegg, som laminin eller fibronectin, for å forenkle feste verten cellene rundt på hydrogel 52. tas som avhenger verten celle er hydrogel stivhet området studier. Utvalget av stivhet bør avhenge av hva er fysiologisk relevant for den bestemte verten celle og hvor godt den verten festes danner en monolayer til en gitt stivhet hydrogel. Tilsvarende avhengig av modell patogen ønsket undersøkes, må liten modifikasjoner implementeres på infeksjon analysen beskrevet her.
Innovasjonen av analysen i forhold til forrige metoder for produksjon polyakrylamid hydrogels24,50,53 ligger i visse unike funksjoner integrert i foreslåtte infeksjon analysen. Først, hydrogels er bygd på flere godt glass bunnplater, som gjør screening av flere vilkår samtidig, samt automatisering av bestemte prosedyrer. Overvåke flere betingelser på samme tid eller undersøke flere gjentak er avgjørende siden utfallet av en slik tilnærming kan påvirkes av faktorer som verten celle passering og hvor mange bakterier lagt til infisere vertene, som ofte endres mellom uavhengige eksperimenter. En unik tilleggsfunksjon for denne analysen er at hydrogels har en høyde på ca 40 µm, som er tynne nok til å bilde ved hjelp av konvensjonelle mikroskopi. Vi viste at vi kan utføre både levende celle mikroskopi og celle fiksering og immunostai-etterfulgt av bildebehandling, uten introdusere høye fluorescens. Til slutt, hydrogels er laget av to lag, med den øvre har innebygd fluorescerende microbeads, i en enkelt fokalplanet. Attributten sikrer at det blir ingen ut-av-fokusere lys konflikt under bildebehandling. Tilstedeværelsen av perlene kan både undersøkelse av overflaten topografien geléer å sikre at de ensartet og forbedrer TFM og MSM24,32,41. Med TFM og MSM er det mulig å beregne celle-ECM og celle-celle styrkene av cellene er bosatt på varierende stivhet matriser. Bruker denne romanen analysen, er det mulig å foreta slike målinger av fysiske krefter ved å sammenligne begge bidrag av miljømessige stivhet og infeksjon samtidig. Etter en slik tilnærming har effekten infeksjonen på verten celle mekanikk gjennom kurs kan bestemmes. Dessuten utviklingen av intracellulær stresset celler kan beregnes ved hjelp av MSM og kan brukes som et mål på barriere integriteten til monolayer. Til slutt er gitt flere godt natur analysen, det mulig å samtidig innføre farmakologiske og genetiske forstyrrelser med en bakteriell infeksjon, å undersøke grundigere det komplekse samspillet mellom verten celle mekanikk og infeksjon.
En iboende begrensning av teknikken ligger i effekt substrat stivhet kan ha på spredningen rate av celler. Vanligvis i infeksjon analyser må vi sikre at verten celle tetthet under ulike forhold er den samme. Det er fordi cellen tetthet av seg selv kan ha en effekt på mottakelighet av verter til infeksjon. HMEC-1 cellene som ble brukt som verten cellene viser ikke en betydelig forskjell i deres tall når seeded 24 h på hydrogels. Imidlertid kan forskjellige celletyper utstilling differensial spredning, avhengig av hydrogel stivhet, som kan lede infeksjon studier. Tilsvarende kan infeksjon skjevhet oppstå når celler utgjør ikke monolayers eller ikke feste på hydrogels, som oppstår når visse celletyper er seeded på myke matriser (f.eks, menneskelige navlestreng endotelceller eller Madin-Darby hjørnetann nyre epitelceller seeding på 0,6-kPa hydrogels54,55). Såvidt patogener er bekymret, visse bakterier (f.eks Borrelia burdgorferi) kan koble til verten cellene og invadere dem, men kan også transmigrate gjennom dem56. Vi har ennå ikke testet Hvis denne analysen vil arbeide for patogen transmigration studier, men det synes mulig siden tidligere studier på nøytrofile transmigrating endotelceller seeded på PA hydrogels er dokumentert for å lykkes57. Det har vært mange studier viser hvordan produksjon polyakrylamid hydrogels av en gitt ung modulus ved å blande de aktuelle konsentrasjonene av akrylamid og bis-akrylamid24,25,26 ,27. Imidlertid, spesielt når man ønsker å utføre TFM eksperimenter på bor på hydrogels av varierende stivhet, er det viktig å bekrefte forventede stivhet av hydrogels enten gjennom AFM eller andre innrykk teknikker58. Avvik fra forventet verdi kan forekomme et annet løsemiddel brukes eller en alderen akrylamid lager løsning, eller måtene AFM målinger er utført (f.eksform av AFM spissen). Til slutt er tilnærmingen som presenteres her basert på seeding verten cellene i 2D matriser, som kan variere fra en mer realistisk og fysiologisk relevante 3D. Men omfatter produksjon 3D gels med tunable stivhet, såing dem med verten cellene og deretter infiserer dem med patogener, fortsatt visse tekniske problemer. Likevel forventer vi at i nær framtid vi vil være i stand til å utvide gjeldende analysen for å studere infeksjon i 3D omgivelser.
For å oppsummere, beskrevet protokollen sammen med de foreløpige resultatene gir bevis for at denne romanen analysen kan bli et svært nyttig verktøy for å studere infeksjon tilhenger vert celler med patogene bakterier i en kvantitativ mote og mye mer fysiologisk relevante miljøet enn tidligere undersøkt. Kraften i fabrikere polyakrylamid hydrogels i foreslåtte oppsettet ligger i at analysen er kompatibel med resultatene av flere teknikker som flowcytometri, immunostai-etterfulgt av * lys, og trekkraft tvinge mikroskopi. Analysen kan brukes for studier som involverer infeksjon av annen tilhenger vert celletyper av patogener, som vi forventer vil ha en betydelig innvirkning både unraveling strategier som patogener infisere verter og tilrettelegge for utvikling av terapeutiske tiltak mot infeksjoner.

Cellene i de fleste dyr vev er vanligvis tilhenger, feste både til nabokommunene cellene og deres ekstracellulær matrix (EFM). Celleområdet til deres ECM er avgjørende for mange mobilnettet prosesser fra cellen motilitet til celle spredning og overlevelse1,2. Mobilnettet anchorage til ECM avhenger både ECM komposisjon og stivhet. Celler reagere på endringer i sistnevnte av dynamisk re-arrangere deres cytoskjelett, celle-ECM og celle-celle adhesjon, som i sin tur kritisk endre cellen biomekanikk og funksjoner3,4,5,6 . ECM stivhet kan variere i rommet (dvs., anatomisk plassering) gang (dvs., aldring) og patofysiologiske prosesser (f.eks, arteriosklerose, kreft, infeksjoner, etc.). For eksempel, det er allment akseptert at endothelial bor på stivere-sammenlignet med mykere-matriser utøve økt styrker deres ECM og hverandre og viser økt motilitet og spredning7,8. Likeledes fibroblaster bosatt på stivere matriser formidle høy kontraktile styrker til deres ECM og Vis økt spredning, motilitet og ECM produksjon9,10,11. Selv om cellen mekanikk og respons på ECM stivhet har vært studert i ulike celletyper, forholdet mellom tilhenger vertsceller, er stivhet ECM og bakterielle infeksjoner fortsatt hovedsakelig ubekjent.
For å studere rollen til ECM stivhet i bakterier-verten celle interaksjoner, ble L. monocytogenes (Lm) valgt som modell patogen. Lm er en allestedsnærværende matbårne bakterie som kan føre til systemisk infeksjon i en rekke pattedyr verter. Denne facultative intracellulær patogen kan flytte fra intestinal epitel å fjerne organer av traversering ulike typer vaskulær endothelia. Hvis det bryter blod - hjerne barrieren, Lm kan forårsake hjernehinnebetennelse, og når den krysser placenta, kan det forårsake spontan abort12,13. Lm kan infisere andre celletyper, og kan gjøre det ved hjelp av forskjellige patogene strategier. Lm infeksjon har vært studert mest i sammenheng med epitelceller, mens vi vet mye mindre om hvordan Lm kan infisere og omkjøringsvei endotelceller fôr lumen blodkar14,15,16. Videre er det fortsatt stort sett ukjent hvordan stivhet av ECM hvor endotelceller bor modulerer Månelandingsfartøyets muligheten til å invadere disse verten cellene og deretter spredt. Lm og flere ekstra bakteriell arter (dvs. Rickettsia parkeri) dra nytte av utgangen cytoskeleton på verten cellene de infisere både invadere i deres cytoplasma og lette celle til celle spredning17 , 18 , 19. de oppnå gjennom uttrykket av proteiner at forstyrre vert begrepsordbok polymerisasjon veier og produsere begrepsordbok kometen hale som letter deres videresende fremdrift16,20. Som følge av infeksjon trenger vert cellenes begrepsordbok cytoskjelett å dynamisk endre på en måte som er fortsatt ikke helt preget, potensielt påvirke biomekanikk du verten cellene de fysiske kreftene de utøve sine ECM og hver andre. For å undersøke disse prosessene, menneskelige mikrovaskulær endotelceller (HMEC-1) ble valgt som modell vertsceller for tre grunner: 1. endotelceller er kjent for å være svært mechanosensitive som de er stadig utsatt for ulike fysiske signaler21; 2. strategier Lm sysselsetter for å infisere endotelceller er fortsatt hovedsakelig ukjent22; og 3. HMEC-1 kan, er en udødeliggjort cellen og derfor lett kultivert og utsatt for genetisk manipulasjon.
Bakteriell infeksjon i verten cellene vært meste studert i vitro av seeding celler i glass eller polystyren underlag som er betydelig stivere enn fysiologiske ECM de fleste celler12,14,23. Undersøke infeksjon av celler seeded på en matrise som stivhet er fysiologisk relevant og belyse rollen ECM stivhet på infeksjon av celler av bakteriell patogener, fulgte vi en innovativ tilnærming basert på fabrikere tynn microbead-innebygd polyakrylamid hydrogels av tunable stivhet på flere bra plater. Nyheten av den foreslåtte tilnærmingen ligger ved at den tillater overvåking flere vilkår samtidig på grunn av sitt multi vel format og at den er kompatibel med flere teknikker på grunn av bestemt måten substrater er bygget. HMEC-1 celler ble sådd på disse protein-belagt hydrogels og deretter infisert med ulike Lm stammer som blir fluorescerende på internalisering eller er constitutively fluorescerende. Rollen av ECM stivhet på infeksjon mottakelighet celleområde vert HMEC-1 ble evaluert av flowcytometri. I tillegg immunostai- og fluorescens mikroskopi ble brukt til å skille mellom overholde og internalisert. Til slutt, trekkraft Force mikroskopi (TFM) ble utført betegner effekten av Lm infisert trekkraft stress som verten endotelceller øve på deres matriser under infeksjon. Presentert analysen kan enkelt endres for å aktivere videre studier av effekten av ECM stivhet på infeksjon mottakelighet av tilhenger celler ved hjelp av forskjellige linjer eller patogener.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

Ekstracellulær matrix stivhet består av ett av flere miljømessige mekanisk stimuli som er kjent for å påvirke mobilnettet atferd, funksjon og skjebne generelt. Selv om stadig mer tilhenger celletyper Svar å matrix stivhet har vært preget, hvordan tilhenger cellenes mottakelighet for bakteriell infeksjon er avhengig av matrix stivhet er stort sett ukjent, som er effekten av bakteriell infeksjon på den Biomekanikk av verten cellene. Vi hypothesize at mottakelighet av verten endotelceller til en bakteriell infeksjon, avhenger av stivhet av matrisen som disse cellene bor, og at infeksjon av verten cellene med bakterier vil endre deres biomekanikk. For å teste disse to hypoteser, ble endotelceller brukt som modell verter og Listeria monocytogenes som en modell patogen. Ved å utvikle en roman flere godt format analysen, viser vi at effekten av matrix stivhet på infeksjon av endotelceller av L. monocytogenes kan vurderes kvantitativt gjennom flowcytometri og immunostai-etterfulgt av mikroskopi. I tillegg kan bruker trekkraft force mikroskopi, effekten av L. monocytogenes infeksjon på verten endothelial celle biomekanikk studeres. Den foreslåtte tillater for analyse av effekten av vev-relevante mekanikere på bakteriell infeksjon av tilhenger celler, som er et viktig skritt mot å forstå biomekaniske samspillet mellom celler, deres ekstracellulær matrix, og patogene bakterier. Denne metoden gjelder også en rekke andre typer studier på cellen biomekanikk og respons på underlaget stivhet hvor det er viktig å kunne utføre mange gjentak parallelt i hvert eksperiment.

ECM stivhet-avhengige mottakelighet av HMEC-1 celler for Lm infeksjon: PA hydrogels av varierende stivhet, alle overflaten-belagt med kollagen jeg, ble bygget på flere godt glass bunnplater som beskrevet i trinn 1 av protokollen (se figur 1). AFM målinger ble utført for å bekrefte nøyaktig stivhet av hydrogels, som beskrevet tidligere26,27 (se figur 2). Tidligere studier har vist at lokale etterlevelse av kjelleren membranen av endotelceller kan variere fra 1 kPa (f.eks, hjernevev) til 70 kPa (f.eks, aorta)36,37,38, 39 , 40. Derfor valgte vi å teste infeksjon av HMEC-1-celler som er bosatt på matriser med følgende stivhet: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa og 70 kPa. For hver hydrogel stivhet, ble seks hydrogels laget for å vurdere reproduserbarhet resultatene.
Flowcytometri ble brukt til å vurdere ECM stivhet-avhengige mottakelighet celleområde HMEC-1 Lm infeksjon (se fig. 3). HMEC-1 celler var infisert med en Lm stamme (JAT985) som uttrykker fluorescerende merketråd etter internalisering (actAp::mTagRFP), slik at påvisning av intracellulære bakterier bare (se figur 1 L - 1N). JAT985 mangler også ActA, deaktivere bakteriene sprer seg fra celle til celle, siden ActA er nødvendig for dannelsen av utgangen kometen hale og påfølgende bakteriell formidling. 7 - 8 timer etter infeksjon, HMEC-1 cellene infeksjon ble vurdert ved hjelp av flowcytometri. Slik analyse av enkeltceller, var mesteparten av fordelingen av celletall gated bruker fremover mot siden spredningsdiagram, og deretter andre gating trinnet ble utført for å utelate celler som viser autofluorescence (se tallene 3A - 3 C ). De foreløpige resultatene avbildet i Figur 3 viser at HMEC-1-infeksjon med Lm er omtrent to ganger større for HMEC-1-celler som er bosatt på de stive 70 kPa hydrogels i forhold til celler som er bosatt på de myke 0,6 kPa hydrogels (se tallene 3B - 3D). økt Lm infeksjon mottakelighet av HMEC-1 cellene er bosatt på stiv i forhold til myke matriser kan være grunn: 1. økt Lm vedheft på HMEC-1; 2. økt Lm invasjonen i HMEC-1; eller 3. begge de ovennevnte co-oppstår. For å teste hypotesen som holder, var HMEC-1 celler seeded myk (3 kPa) og stiv (70 kPa) hydrogels og infisert med constitutively GFP uttrykke Lm (se tallene 4A - 4 C). Prøvene ble fast etter infeksjon og eksterne (overholde) bakterier var farget med antistoffer. Bruker kvantitative mikroskopi, fant vi at det er betydelig mer bakterier overholder HMEC-1 når verten cellene ligger på stiv sammenlignet med myk gelé (se Figur 4D). Samsvar med flyt cytometri dataene, det er betydelig mer bakterier internalisert HMEC-1 når verten cellene ligger på stiv sammenlignet med myk gelé (se Figur 4E). Imidlertid invasjonen effektiviteten (bakterier internalisert/totalt antall bakterier) av Lm i HMEC-1 celler er tilsvarende, uansett substrat stivhet (se Figur 4F).
Trekkraft tvinge mikroskopi Lm-infiserte HMEC-1 celler: Lm infeksjon av HMEC-1 celler kan endre biomekanikk av infiserte verten cellene, inkludert styrken av vedlegg til deres ECM eller hverandre, påvirker deres barriere integritet. Vi søkte å vurdere om det kan være tilfelle ved hjelp av trekkraft Force mikroskopi32 å beregne celle-ECM trekkraft styrker og Monolayer Stress mikroskopi41 beregne intracellulær tensional krefter. Figur 5 viser kart av deformasjon feltet, trekkraft stress feltet og intracellulær spenning feltet av HMEC-1 cellene er bosatt på 20-kPa hydrogels på ulike tidspunkt poeng etter infeksjon. Tallene 5A - 5 D refererer til uninfected kontroll HMEC-1 celler mens tallene 5E - 5 H refererer til HMEC-1 celler infisert med Lm på et mangfold av smitte til 300 bakterier/mobiltelefon. Dette forarbeidet antyder at infiserte HMEC-1 celler redusere omfanget av sin celle-ECM og intracellulær påkjenninger i løpet av en infeksjon med Lm, mens det ikke blir observert for infisert kontroll celler.
ECM stivhet-avhengige Lm formidling på tvers av HMEC-1 monolayers: Time-lapse mikroskopi ble brukt til å undersøke effekten matrix stivhet har på Lm spredning gjennom HMEC-1 monolayers. Som Lm sprer seg gjennom monolayer, opprette bakterier fokus for infeksjon som vokser som en funksjon av tid (se figur 6A og Video tall 1 og 2). Området infeksjon fokus ble målt ved å tegne en konveks skrog, den minste konvekse polygonen som omfatter en rekke steder, rundt bakterier42. Det er ingen standard metriske i feltet for å måle effektiviteten av L. monocytogenes celle til celle spredning gjennom en monolayer på verten cellene. For å vurdere spredning effektivitet, noen har talt antall vertsceller i en infeksjon fokus41, og andre har trukket grenser manuelt rundt gruppen med infeksjon verten cellene43. Vi valgte å trekke en konveks polygon rundt bakterier, fordi det er en automatisert, konsekvent og beregningsmessig rimelig prosess å måle effektiviteten av L. monocytogenes spredning. Dermed fant vi en liten nedgang i fokusområdet infeksjon i HMEC-1 cellene seeded på 70 kPa hydrogels i forhold til de seeded på 3 kPa matriser (se figur 6B og Video tall 1 og 2). For å bestemme hastigheten av vekst av infeksjon fokus, den radielle avstanden var skal tegnes som en funksjon av tid ved å ta kvadratroten av infeksjon fokus og dele dette med pi. Denne matematiske transformasjonen forutsetter at formen på infeksjon fokus er omtrentlig sirkulær44. For å måle hastigheten på veksten fokus, ble graden av endring (dvs., skråningen) av den radielle avstanden for begge 3 - og 70-kPa matriser målt. Denne tilnærmingen belyst at infeksjon fokus vokste raskere og monotonically i HMEC-1 celler seeded på 3-kPa matriser. Men vokste fokus betydelig lavere (første 200 min) og litt tregere (200 til 600 min) i cellene seeded på 70-kPa matriser (se figur 6C). Faktisk analyse av ytterligere data bekreftet at infeksjon fokus vokste, i gjennomsnitt to ganger tregere i 70-kPa matriser, spesielt i de første 200 min (se figur 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> Figur 3 : ECM stivhet-avhengige mottakelighet celleområde HMEC-1 Lm invasjon målt ved hjelp av flowcytometri .  HMEC-1 celler var infisert med Lm (JAT985) og infeksjon ble analysert av flowcytometri. A. dette panelet viser en side kontra frem spredningsdiagram for representant HMEC-1 cellene kommer fra en enkelt brønn. Hovedtyngden distribusjon av celler ble valgt via gating for å utelukke rusk (venstre) og celle doublets eller trillinger (høyre). B. denne grafen viser et histogram for logaritmen til Lm fluorescens intensiteten per celle for HMEC-1 belagt på myke 0,6 kPa. C. denne grafen viser et histogram for logaritmen til Lm fluorescens intensiteten per celle for HMEC-1 belagt på stiv 70 kPa hydrogels. Histogrammer for N = 4-6 gjentak vises i forskjellige farger. Kontroll infisert cellene histogrammet er lilla. Porten brukes til å definere hva er infisert vises i rødt. MOI er 100 infeksjonen var vurdert 8 timer etter infeksjon. D. Data viser prosentandelen av infiserte HMEC-1 celler mot hydrogel stivhet (N = 5). De horisontale barene skildrer dataenes betyr. P-verdi ble beregnet med ikke-parametriske Diversified rang Sum test. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> Video figur 1: spredning av intracellulær Lm (rød kanal) gjennom en HMEC-1 celle monolayer (fase) seeded på et 3-kPa substrat. Cellene ble avbildet i Leibovitz's L-15 media (10% FBS, 20 µg/mL gentamicin) inne en miljømessig kammer equilibrated å 37 grader. Bildene ble samlet hver 5 min. Filmen hastigheten er 15 rammer/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> Video figur 2: formidling av intracellulær Lm (rød kanal) gjennom en HMEC-1 celle monolayer (fase) seeded på en 70-kPa substrat. Cellene ble avbildet i Leibovitz's L-15 media (10% FBS, 20 µg/mL gentamicin) inne en miljømessig kammer equilibrated til 37 ° C. Bildene ble samlet hver 5 min. Filmen hastigheten er 15 rammer/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Youngs modul (E, kPa)</td>
			<td>Akrylamid % (fra 40% aksjer)</td>
			<td>Bisacrylamide % (fra 2% aksjer)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,6</td>
			<td>3</td>
			<td>0,045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0.195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
</tbody></table> Tabell 1. Sammensetningen av polyakrylamid (PA) hydrogels av varierende stivhet. i denne tabellen andelen lager 40% akrylamid løsning og andelen av lager 2% bis-akrylamid løsning å oppnå en gitt stivhet (Youngs modul, E) angis i forskjellige kolonner.
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> Supplerende materiale 1. Beregning av intracellulær spenningen fra beregnet trekkraft påkjenninger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Vi har utviklet en multi godt format polyakrylamid-baserte analysen for utprøvende effekten av ekstracellulær matrix stivhet på bakteriell infeksjon tilhenger celler. Denne analysen er kompatibel med flowcytometri og immunostai-trekkraft force mikroskopi, tillater for kvantitative mål biomekaniske interaksjonene mellom celler, ekstracellulær matrix og patogene bakterier.

En multi godt Format polyakrylamid-baserte analysen for å studere effekten av ekstracellulær Matrix stivhet på bakteriell infeksjon av tilhenger celler

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

A Visual analysen til Monitor T6SS-mediert bakteriell konkurranse

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Ved hjelp Klikk kjemi å måle effekten av virusinfeksjon på Host-Cell RNA syntese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Gransker effekten av Probiotika på Pneumokokk Colonization Bruke en<em&gt; In Vitro</em&gt; Overholdelse analysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysere effekten av stromalceller på rekruttering av leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementering av en gjennomtrengelig membran Insert-baserte infeksjon System for å studere effekter av utskilt toksiner på Pattedyrvertsceller

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Analyser for å studere rollen til Vitronectin i bakteriell vedheft og Serum motstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilatasjon av isolerte kar og isolering av den ekstracellulære matrise av Tight-hud Mus

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Protokoller for Gransker Host-vev distribusjon, overføring-modus, og innvirkning på vertsmaskinen Fitness av en Densovirus i Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...