Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

Nossos agradecimentos a M. rodapé, R. Lamason, M. Rengaranjan e membros do laboratório de Mais_que_lindo para suas discussões e suporte experimental. Este trabalho foi financiado pelo NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), a Irmandade de Gilliam HHMI para estudo avançado (F.E.O.), o Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) e a associação americana do coração (E.E.B.). Citometria de fluxo foi realizada na instalação de FACS compartilhado de Stanford.

Os autores não têm nada para divulgar.

As células podem sentir uma variedade de pistas ambientais físicas, o que pode afetar não só a morfologia das células, mas também a sua expressão e proteína atividade de gene, afectando assim a célula crítica funções e comportamentos45,46. A rigidez de ECM de células é cada vez mais apreciada como um modulador importante da motilidade celular, diferenciação, proliferação e, finalmente, célula destino47,,48,49. Embora tenha havido muitos avanços recentes na compreensão da complexa interação biomecânica entre células e seu ECM, pouco é conhecido sobre a rigidez como ambiental afeta a susceptibilidade das células à infecção bacteriana. Para facilitar tais estudos, desenvolvemos este ensaio multi bem romance baseado na fabricação de hidrogel de poliacrilamida de rigidez ajustável que é compatível com infecção ensaios50bem estabelecida. Tradicionalmente, uma infecção bacteriana das células em cultura de tecidos tem sido estudada em vidro ou superfícies de poliestireno que são aproximadamente 1-3 ordens de magnitude mais duras que o ECM natural de mais aderente células8,51. O ensaio descrito aqui abre novas estradas, permitindo o estudo das interações de bactérias-host em um regime de rigidez ambiental fisiologicamente relevantes.
Para a prova de conceito do ensaio apresentado, células HMEC-1 foram escolhidas como células aderentes modelo e Lm como um patógeno bacteriano do modelo. No entanto, o ensaio pode ser estendido para mais estudos se modificado da maneira apropriada. Tais estudos podem envolver a infecção dos tipos de células diferentes mamíferos anfitrião aderentes por patógenos adicionais, incluindo bactérias e vírus. Para este teste específico, géis foram proteína-revestidas com colágeno eu, mas dependendo do tipo de célula do hospedeiro, é possível usar um revestimento-proteína de ECM diferente, tais como laminina ou fibronectina, para facilitar a fixação de células hospedeiras de juros sobre o hidrogel 52. uma consideração adicional que depende do tipo de célula do hospedeiro é a escala de rigidez de hidrogel para ser estudado. A gama de rigidez deve depender do que é fisiologicamente relevante para o tipo de célula de host específico e como bem que hospedam anexa formando uma monocamada em um hidrogel de determinada rigidez. Da mesma forma, dependendo do patógeno modelo desejado a ser examinado, pequenas modificações talvez precise ser implementado sobre o ensaio de infecção aqui descrito.
A inovação do ensaio em comparação com os métodos anteriores para fabricação de poliacrilamida hidrogel24,50,53 encontra-se em certas características únicas integrados o ensaio proposto infecção. Primeiro, o hidrogel é construídas sobre placas de vidro multi bem fundo, que permite a seleção de várias condições simultaneamente, bem como a automatização de determinados procedimentos. Monitoramento de várias condições no mesmo momento ou examinando várias repetições é crucial, pois o resultado dessa abordagem pode ser influenciado por fatores como a passagem de células do hospedeiro e o número exacto de bactérias adicionadas para infectar os hosts, que mudam frequentemente entre experimentos independentes. Uma característica adicional exclusiva deste teste é que o hidrogel tem uma altura de aproximadamente 40 µm, que é fina o suficiente para a imagem usando microscopia convencional. Mostramos que podemos com sucesso realizar microscopia célula viva e a fixação da pilha e imunocoloração seguido por imagens, sem a introdução de fluorescência de fundo elevado. Por último, o hidrogel é feitos de duas camadas, com o superior tendo incorporado microbeads fluorescente, confinado em um único plano focal. Este atributo garante que não haverá nenhuma luz fora de foco, interferindo durante a imagem latente. A presença dos grânulos permite que tanto o exame da topografia superficial dos geles para garantir que eles são uniformes e melhora o desempenho do TFM e MSM de32,24,41. Com TFM e MSM, é possível calcular as forças ECM-célula e célula-célula, respectivamente das células que residem em variáveis de matrizes de rigidez. Usando este ensaio de romance, é possível fazer tais medições de forças físicas, comparando a contribuição de rigidez ambiental e de infecção simultaneamente. Seguindo esta abordagem, a infecção de efeito tem na célula hospedeira mecânica ao longo de seu curso pode ser determinada. Além disso, a evolução das tensões intracelulares de células pode ser calculada usando MSM e pode ser usada como uma medida da integridade da barreira da monocamada. Finalmente, dada a natureza multi bem do ensaio, é possível simultaneamente introduzir perturbações genéticas e farmacológicas com uma infecção bacteriana, para investigar mais a fundo a complexa interação entre a mecânica de células do hospedeiro e infecção.
Uma limitação inerente da técnica reside na rigidez de substrato efeito teria sobre a taxa de proliferação de células. Normalmente, em ensaios de infecção, precisamos garantir que a densidade de pilha de anfitrião em diferentes condições é o mesmo. Isso é porque a densidade celular por si só pode ter um efeito sobre a susceptibilidade de hospedeiros a infecção. As células do HMEC-1 que foram usadas como células hospedeiras não mostram uma diferença significativa no seu número quando semeado durante 24 h sobre o hidrogel. No entanto, diferentes tipos de células podem apresentar proliferação diferencial, dependendo da rigidez de hidrogel, que pode influenciar a estudos de infecção. Da mesma forma, o viés de infecção podem surgir quando as células não formam monocamadas ou não fixe bem sobre o hidrogel, como ocorre quando certos tipos de células são semeados em matrizes muito macias (por exemplo, células endoteliais humanas de cordão umbilical ou rim canino Madin-Darby células epiteliais semearam em 0.6 kPa hidrogel54,55). Que respeita aos agentes patogénicos, certas bactérias (por exemplo, Borrelia burdgorferi) podem anexar para hospedar as células e invadi-los, mas também podem transmigrar através deles56. Nós ainda não testei se este ensaio trabalharia para estudos de transmigração do patógeno, mas parece possível, já que estudos anteriores sobre os neutrófilos reencarnando células endoteliais semeadas em hidrogel de PA foram documentados para trabalhar, com êxito,57. Tem havido muitos estudos realizados mostrando como produzir hidrogel de poliacrilamida de um determinado módulo de Young, misturando as concentrações adequadas de acrilamida e bis-acrilamida24,25,26 ,,27. No entanto, especialmente quando um deseja realizar TFM experiências em células que residem em hidrogel de rigidez variável, é essencial para confirmar a rigidez esperada o hidrogel através de AFM ou outras técnicas de recuo58. Ligeiros desvios em relação ao valor esperado podem ocorrer devido um solvente diferente usado ou uma solução de acrilamida envelhecido, ou das formas AFM as medições são realizadas (por exemplo, a forma da ponta do AFM). Finalmente, a abordagem apresentada neste documento baseia-se na semeadura de células hospedeiras em matrizes 2D, que podem diferir de um cenário 3D mais realista e fisiologicamente relevante. No entanto, fabricação 3D géis com rigidez sintonizável, semeando-os com células hospedeiras e em seguida, infectando-os com patógenos, ainda abrange certas dificuldades técnicas. Não obstante, prevemos que num futuro próximo seremos capazes de estender o atual ensaio para estudar a infecção em um ambiente 3D.
Para resumir, o protocolo descrito em conjunto com os resultados preliminares fornecem evidências de que este romance ensaio pode tornar-se uma ferramenta extremamente útil para estudar a infecção de células aderentes com bactérias patogênicas de forma quantitativa e de uma forma muito mais ambiente fisiologicamente relevante do que o anteriormente examinadas. O poder de fabricar poliacrilamida hidrogel na configuração da proposta reside em que o ensaio é compatível com o desempenho de várias técnicas como citometria de fluxo, immunostaining seguido por microscopia de luz e força de tração microscopia. O ensaio pode ser usado para estudos que envolvem a infecção dos tipos de células aderentes de host diferente por patógenos, que prevemos que terá um impacto significativo em ambos desvendar as estratégias pelas quais patógenos infectam hospedeiros e facilitar o desenvolvimento de intervenções terapêuticas contra infecções.

Células em tecidos mais animais são tipicamente aderentes, anexar às células vizinhas e a sua matriz extracelular (ECM). A ancoragem das células para o ECM é essencial para muitos processos celulares, variando de motilidade de célula para célula de proliferação e sobrevivência1,2. Celular ancoragem para o ECM depende da composição de ECM e a rigidez. As células respondem às mudanças no último, dinamicamente, re-organizando seu citoesqueleto, aderências célula-ECM e célula-célula, que por sua vez criticamente alteram a célula biomecânica e funções3,4,5,6 . Rigidez de ECM pode variar no espaço (ou seja, local anatómico), tempo (ou seja, envelhecimento), em processos fisiopatológicos (por exemplo, arteriosclerose, câncer, infecções, etc.). Por exemplo, é amplamente aceito que endoteliais células que residem na mais rígida-em comparação com o mais suave-matrizes exercer forças aumentada para seu ECM e uns aos outros e apresentam aumento da mobilidade e proliferação de7,8. Da mesma forma, fibroblastos que residem em matrizes mais aguerridas dar altas forças contráteis para seu ECM e mostram maior proliferação, motilidade e produção de ECM a9,10,11. Embora a célula mecânica e resposta à rigidez do ECM têm sido estudados extensivamente por vários tipos de células, a relação entre células aderentes, a rigidez de seus ECM e infecções bacterianas ainda é desconhecida.
Para estudar o papel da rigidez de ECM em interações de células de bactérias-host, L. monocytogenes (Lm) foi escolhido como o patógeno de modelo. LM é uma bactéria de origem alimentar onipresente que pode causar infecção sistêmica em uma ampla variedade de hospedeiros mamíferos. Este patógeno intracelular facultativo pode mover do epitélio intestinal para órgãos distantes, atravessando diferentes tipos de endothelia vascular. Se rompe a barreira sangue - cérebro, Lm pode causar meningite, e quando atravessa a placenta, pode causar aborto espontâneo12,13. LM pode infectar tipos de células de host diferente e pode fazê-lo por meio de estratégias distintas de patogenicidade. Infecção de LM tem sido estudada principalmente no contexto de células epiteliais, enquanto muito menos se sabe sobre como a Lm pode infectar e desvio células endoteliais que revestem o lúmen dos vasos sanguíneos14,15,16. Além disso, ainda é desconhecida como a rigidez do ECM onde residem as células endoteliais modula a capacidade do Lm para invadir estas células hospedeiras e depois se espalhou. LM e várias espécies bacterianas adicionais (ou seja, Rickettsia parkeri) aproveitar o citoesqueleto de actina do host células que infectam a ambos invadem em seu citoplasma e facilitam a difusão de célula para célula17 , 18 , 19. eles realizam isso através da expressão de proteínas que possam interferir com vias de polimerização de actina de acolhimento e para produzir as caudas dos cometas actina que facilitam a sua propulsão para a frente de16,20. Como resultado de infecção, o citoesqueleto de actina da célula hospedeira precisa reorganizar dinamicamente de forma ainda não totalmente caracterizada, potencialmente afetando a biomecânica de células hospedeiras incluindo as forças físicas exercem no seu ECM e em cada outros. Para examinar esses processos, células endoteliais microvasculares humanas (HMEC-1) foram escolhidas como células hospedeiras de modelo por três razões: 1. células endoteliais são conhecidas por serem altamente mechanosensitive como eles estão constantemente expostos a diferentes pistas físicas21; 2. as estratégias que LM emprega para infectar as células endoteliais ainda são em grande parte desconhecido22; e 3. HMEC-1 são uma linhagem celular imortalizado e pode, portanto, ser facilmente cultivadas e submetido a manipulação genética.
Infecção bacteriana das células do hospedeiro principalmente tem sido estudada em vitro por semeadura de células no vidro ou poliestireno substratos que são significativamente mais duros que o ECM fisiológica da maioria das células12,14,23. Para examinar a infecção de células semeado em uma matriz cuja rigidez é fisiologicamente relevante e elucidar o papel da rigidez de ECM na infecção de células por patógenos bacterianos, seguimos uma abordagem inovadora, baseada na fabricação de fina hidrogel de poliacrilamida Microconta embutida de rigidez sintonizável em placas multi bem. A novidade da abordagem proposta reside em que permite monitorar condições múltiplas simultaneamente devido ao seu formato multi bem e em que é compatível com várias técnicas devido à forma particular como os substratos são construídos. HMEC-1 células foram semeadas sobre estes hidrogel de proteína-revestido e então infectadas com diferentes cepas de Lm que tornam-se fluorescentes em cima de internalização ou são constitutivamente fluorescente. O papel da rigidez de ECM na susceptibilidade de infecção HMEC-1 das células do hospedeiro foi avaliado por citometria de fluxo. Além disso, microscopia imunocoloração e fluorescência foram usados para diferenciar entre bactérias aderindo e interiorizadas. Finalmente, microscopia de força de tração (TFM) realizou com êxito para caracterizar o efeito da infecção Lm sobre as tensões de tração que as células endoteliais do hospedeiro exercem sobre suas matrizes durante a infecção. O ensaio apresentado pode ser facilmente modificado para habilitar mais estudos sobre o efeito da rigidez do ECM na susceptibilidade de infecção das células aderentes, usando linhas celulares diferentes ou patógenos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

Rigidez da matriz extracelular é composto por um dos vários estímulos mecânicos ambientais que são bem conhecidos para influenciar o comportamento celular, função e destino em geral. Embora respostas dos cada vez mais tipos de células aderentes à rigidez da matriz foram caracterizadas, como aderente a susceptibilidade das células à infecção bacteriana depende da rigidez da matriz é desconhecida, como é o efeito de infecção bacteriana sobre o biomecânica das células do hospedeiro. Nós hypothesize que a susceptibilidade das células endoteliais do hospedeiro a uma infecção bacteriana depende da rigidez da matriz em que estas células residem, e que a infecção do hospedeiro células com bactérias mudará sua biomecânica. Para testar estas duas hipóteses, células endoteliais foram usadas como modelo hosts e Listeria monocytogenes como um patógeno de modelo. Através do desenvolvimento de um ensaio de romance formato multi bem, mostramos que o efeito da rigidez da matriz na infecção de células endoteliais por L. monocytogenes pode ser avaliado quantitativamente através de citometria de fluxo e imunocoloração seguido por microscopia. Além disso, utilizando microscopia de força de tração, o efeito da infecção por L. monocytogenes em biomecânica endothelial da pilha de anfitrião pode ser estudado. O método proposto permite a análise do efeito da mecânica de tecido-relevantes na infecção bacteriana das células aderentes, que é um passo crítico para a compreensão das interações biomecânicas entre células, sua matriz extracelular, e bactérias patogênicas. Este método também é aplicável a uma grande variedade de outros tipos de estudos sobre a biomecânica do celular e resposta à rigidez do substrato onde é importante ser capaz de realizar muitas repetições em paralelo em cada experimento.

Susceptibilidade de rigidez dependente de ECM do HMEC-1 células à infecção de Lm: PA hidrogel de rigidez diferentes, todos revestidos na superfície com colágeno eu, foram construídos em placas de vidro multi bem fundo, conforme descrito na etapa 1 do protocolo (ver Figura 1). Foram realizadas medidas de AFM para confirmar a rigidez exata do hidrogel, conforme descrito anteriormente,26,27 (ver Figura 2). Estudos anteriores mostraram que a conformidade local da membrana basal das células endoteliais pode variar de 1 kPa (por exemplo, tecido cerebral) a 70 kPa (por exemplo, aorta)36,37,38, 39 , 40. portanto, optamos por testar a infecção de células HMEC-1 residentes em matrizes com rigidez a seguir: 0.6 kPa, 3-kPa, 20 kPa e 70 kPa. Para cada rigidez de hidrogel, seis hidrogel foram fabricados para avaliar a reprodutibilidade dos resultados.
Citometria de fluxo foi usada para avaliar a susceptibilidade de rigidez dependente de ECM do HMEC-1 células à infecção Lm (ver Figura 3). HMEC-1 células foram infectadas com uma cepa de Lm (JAT985) que expressa um marcador fluorescente após internalização (actAp::mTagRFP), permitindo a detecção de bactérias intracelulares única (ver figuras 1 L - 1N). JAT985 também carece de ActA, desabilitando as bactérias de se espalhar de uma célula para outra, desde que a ActA é necessário para a formação de caudas dos cometas actina e posterior disseminação bacteriana. 7 - pós-infecção de 8 h, infecção das células HMEC-1 foi avaliada utilizando citometria de fluxo. Para garantir a análise de células únicas, a maior parte da distribuição da contagem de células foi fechada usando o avançado contra a dispersão de lado, e em seguida realizou-se uma segunda etapa associada para excluir as células que exibem autofluorescência (ver Figs. 3A - 3C ). Os resultados preliminares, representados na Figura 3 mostram que a infecção HMEC-1 com Lm é aproximadamente duas vezes maior para o HMEC-1 células que residem sobre a dura 70 kPa hidrogel em comparação com células residentes no macio 0,6 kPa hidrogel (ver figuras 3B - 3D). A maior suscetibilidade de infecção Lm do HMEC-1 células que residem na rígida em comparação com as matrizes macias pode ser devido a: 1. aumento da aderência de Lm para HMEC-1; 2. maior invasão Lm HMEC-1; ou 3. ambos o co ocorrendo acima. Para testar quais hipótese porões, células HMEC-1 foram semeadas na suave (3 kPa) e dura hidrogel (70 kPa) e infectadas com constitutivamente GFP expressando Lm (ver figuras 4A - 4C). As amostras foram fixadas logo após a infecção e as bactérias externas (aderente) foram coradas com anticorpos. Usando microscopia quantitativa, achamos que são significativamente mais bactérias aderindo ao HMEC-1, quando as células hospedeiras residem na rígida em comparação com os geles macios (ver Figura 4D). Consistentes com os dados de citometria de fluxo, são significativamente mais bactérias internalizadas pelo HMEC-1, quando as células hospedeiras residem na rígida em comparação com os geles macios (ver Figura 4E). No entanto, a eficiência de invasão (bactérias internalizadas/número total de bactérias) de Lm em células HMEC-1 é semelhante, independentemente da rigidez de substrato (ver Figura 4F).
Microscopia de força de tração de células infectadas Lm HMEC-1: Infecção de LM de células HMEC-1 poderia alterar a biomecânica de células hospedeiras infectadas, incluindo a força de fixação para seu ECM ou para o outro, afetando sua integridade da barreira. Procuramos avaliar se isso poderia ser o caso, por meio de microscopia de força de tração32 para calcular as forças de tração de célula-ECM e monocamada Stress microscopia41 para calcular as forças tensionais intracelulares. A Figura 5 mostra mapas do campo de deformação, campo de tensões de tração e campo de tensão intracelular do HMEC-1 células residentes em hidrogel de 20 kPa no tempo diferente pontos pós infecção. Figuras 5A - 5D referem-se às células não infectadas controle HMEC-1 enquanto figuras 5E - 5h referir HMEC-1 células infectadas com Lm em uma multiplicidade de infecção igual a 300 bactérias/célula. Este trabalho preliminar sugere que células infectadas do HMEC-1 reduzem a magnitude de sua célula-ECM e salienta intracelular no decurso de uma infecção com Lm, Considerando que não é observada por células controle não infectados.
Divulgação Lm rigidez dependente ECM, em monocamadas HMEC-1: Microscopia de lapso de tempo foi usada para investigar o efeito de rigidez da matriz tem na divulgação de Lm através de monocamadas HMEC-1. Como Lm se espalha através da monocamada, as bactérias criam um foco de infecção que cresce em função do tempo (ver Figura 6A e vídeo figuras 1 e 2). A área de foco da infecção foi medida pelo desenho de uma superfície convexa, o menor polígono convexo que engloba um conjunto de pontos, em torno das bactérias42. Não há nenhum padrão métrico no campo para medir a eficiência da L. monocytogenes propagação de célula para célula através de uma monocamada de células hospedeiras. Para avaliar a eficiência de propagação, alguns têm contado o número de células hospedeiras em um foco de infecção41, e outros têm limites desenhados manualmente em torno do grupo de células de hospedeiro infecção43. Nós escolhemos desenhar um polígono convexo ao redor as bactérias, porque é um processo automatizado, consistente e computacionalmente barato para medir a eficiência da propagação de L. monocytogenes . Ao fazer isso, encontramos um ligeiro decréscimo na área de foco de infecção nas células HMEC-1 semeadas em 70 kPa hidrogel quando comparados àqueles semeado em 3 matrizes de kPa (ver Figura 6B e a figuras 1 e 2). Para determinar a taxa de crescimento do foco de infecção, a distância radial foi plotada como uma função do tempo tomando a raiz quadrada da área do foco da infecção e dividindo isso por pi. Essa transformação matemática pressupõe que a forma do foco de infecção é aproximadamente circular44. Para medir a velocidade do crescimento do foco, foi medida a taxa de variação (ou seja, a inclinação) da distância radial para ambas as matrizes 3 e 70 kPa. Esta abordagem elucidado que o foco de infecção cresceu mais rapidamente e monotônico nas células HMEC-1 semeadas em matrizes 3-kPa. No entanto, o foco cresceu significativamente mais lento (min 200 primeiro) e um pouco mais lento (200 a 600 min) nas células semeadas em matrizes de 70 kPa (consulte a Figura 6C). Com efeito, a análise de dados mais confirmado que o foco de infecção cresceu, em média, duas vezes mais lento nas matrizes de 70 kPa, especialmente durante o primeiro 200 min (ver Figura 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> Figura 3 : Susceptibilidade de rigidez dependente de ECM do HMEC-1 células à invasão de Lm medido usando citometria de fluxo .  HMEC-1 células foram infectadas com Lm (JAT985) e a infecção foi analisada por citometria de fluxo. A. este painel mostra um lado contra o avanço de dispersão para representante HMEC-1 células provenientes de um único poço. A distribuição em massa de células foi selecionada através do canal para excluir os restos (à esquerda) e célula parelhas ou trigêmeos (à direita). B. este gráfico mostra um histograma do logaritmo da intensidade da fluorescência Lm por célula de HMEC-1 chapeado na macio 0,6 kPa. C. este gráfico mostra um histograma do logaritmo da intensidade da fluorescência Lm por célula de HMEC-1 chapeado na dura 70 kPa hidrogel. Os histogramas para N = 4-6 repetições são mostradas em cores diferentes. Histograma das células controle não infectado é roxa. O portão usado para definir o que está infectado é mostrado em vermelho. O MOI é 100 e a infecção foi avaliada 8h pós infecção. D. os dados mostram a percentagem de células infectadas do HMEC-1 contra a rigidez de hidrogel (N = 5). As barras horizontais retratam a média dos dados. O P-valor foi calculado com o teste não-paramétrico de Wilcoxon Rank Sum. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> Video Figura 1: divulgação de Lm intracelular (canal vermelho) através de uma monocamada de células HMEC-1 (fase) semeadas em um substrato de 3-kPa. As células foram fotografadas em mídia de L-15 do Leibovitz (10% FBS, 20 µ g/mL de gentamicina) dentro de uma câmara ambiental incubada a 37 ˚ c. As imagens foram coletadas a cada 5 min. A velocidade do filme é 15 frames/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">, por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> Vídeo Figura 2: divulgação de Lm intracelular (canal vermelho) através de uma monocamada de células HMEC-1 (fase) semeadas em um substrato de 70 kPa. As células foram fotografadas em mídia de L-15 do Leibovitz (10% FBS, 20 µ g/mL de gentamicina) dentro de uma câmara ambiental incubada a 37 ° C. As imagens foram coletadas a cada 5 min. A velocidade do filme é 15 frames/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">, por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Módulo de Young (E, kPa)</td>
			<td>Acrilamida % (a partir de 40% das ações)</td>
			<td>Bisacrylamide % (a partir de 2% das ações)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.6</td>
			<td>3</td>
			<td>0,045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0,195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
</tbody></table> Tabela 1. Composição de hidrogel de poliacrilamida (PA) de rigidez diferentes. Nesta tabela, a percentagem da solução estoque do acrilamido 40% e a percentagem de estoque 2% bis-acrilamida solução para atingir uma determinada rigidez (módulo de Young, E) são indicados em colunas diferentes.
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> Material suplementar 1. Cálculo de tensão intracelular de tensões de tração calculada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells (Video) | JoVE

Nós desenvolvemos um ensaio de poliacrilamida-baseado multi bem formato para sondar o efeito da rigidez da matriz extracelular em infecção bacteriana das células aderentes. Este ensaio é compatível com citometria de fluxo, imunocoloração e microscopia de força de tração, permitindo medições quantitativas das interações biomecânicas entre células, matriz extracelular e bactérias patogênicas.

Um ensaio de poliacrilamida-baseado formato multi bem para estudar o efeito da rigidez da matriz extracelular sobre a infecção bacteriana das células aderentes

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

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