Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

Наша благодарность м. Нижний колонтитул, р. Lamason, м. Rengaranjan и члены Териот лаборатории для их обсуждения и экспериментальная поддержка. Эта работа была поддержана низ R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Гиллиам стипендий для передовых исследований (F.E.O.), Стэнфорд выпускников стипендий (F.E.O.) и Американской ассоциации сердца (E.E.B.). Проточной цитометрии была исполнена на объекте совместно СУИМ Стэнфорд.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Клетки могут смысле различных физических экологических подсказки, которые могут повлиять не только морфологии клеток, но также их деятельности выражение и белка гена, влияя таким образом на критических клеток функций и поведения45,46. Жесткость ECM клеток все больше ценится как важный модулятором клеточной подвижности, дифференциация, распространения, и в конечном итоге клеток судьба47,,4849. Несмотря на многие последние достижения в понимании комплекс биомеханических взаимодействие между клеток и их ECM, мало что известно о как экологические жесткость влияет на восприимчивость клеток к бактериальной инфекции. Для облегчения таких исследований, мы разработали этот роман несколькими хорошо assay основанный на устоявшихся изготовление Полиакриламидные гидрогели перестраиваемый жесткости, который совместим с инфекцией assays50. Традиционно бактериальной инфекции клеток в культуре ткани была изучена на стекло или полистирол поверхности, которые приблизительно 1-3 порядков жестче, чем естественный ECM наиболее адэрентных клеток8,51. Assay, описанные здесь открывает новые дороги, позволяя изучение взаимодействия бактерий хост в физиологически соответствующих экологических жесткости режима.
Для доказательства концепции представлены assay HMEC-1 клетки были выбраны в качестве модель адэрентных принимающей ячейки и Lm как модель бактериальных патогенов. Однако assay могут быть расширены для дальнейшего исследования, если соответствующим образом изменены. Такие исследования могут включать инфекции типов клеток различных млекопитающих адэрентных принимающей дополнительные патогенных микроорганизмов, включая бактерии и вирусы. Для этого конкретного assay гели были белка покрытием с коллагеном я, но в зависимости от типа принимающей ячейки, можно использовать различные ECM белка покрытия, например, Ламинин или фибронектин, для облегчения вложение клеток хозяина интерес на Гидрогель 52. дополнительного рассмотрения, который зависит от типа принимающей ячейки — это диапазон жесткости гидрогеля быть изучены. Диапазон жесткости должно зависеть от физиологически то, что актуально для конкретного узла типа клеток и как хорошо что хост придает формирование монослоя на данной жесткости Гидрогель. Аналогичным образом в зависимости от модели возбудителя желательно быть расмотренным, незначительные изменения может потребоваться осуществляться на инфекции assay, описанные здесь.
Инновации assay по сравнению с предыдущими методами для изготовления Полиакриламидные гидрогели24,50,53 лежит в некоторых уникальных особенностей интегрированы в assay предлагаемого инфекции. Во-первых гидрогели строятся на нескольких хорошо стекла нижней пластины, которые одновременно позволяет проверки нескольких условий, а также автоматизации определенных процедур. Мониторинг нескольких условий в то же время или изучения нескольких реплицирует имеет решающее значение, поскольку результаты такого подхода может быть под влиянием таких факторов, как принимающей ячейки прохода и точное количество бактерий, добавил заразить хозяева, которые часто меняют между независимыми экспериментов. Дополнительные уникальной особенностью этот assay является, что гидрогели имеют высоту около 40 мкм, который является достаточно тонким, чтобы изображение с помощью обычных микроскопии. Мы показали, что мы можем успешно выполнить микроскопия живой клетки и клетки фиксацию и иммуноокрашивания, следуют изображений, без введения высоких фон флуоресценции. И наконец гидрогели изготовлены из двух слоев, с верхней 1, встроенные люминесцентные микрошарики, замкнутые в одной фокальной плоскости. Этот атрибут обеспечивает, что там будет не из из фокус света вмешательства во время визуализации. Присутствие бисер позволяет изучение топографии поверхности гели для обеспечения единообразной и улучшает производительность TFM и МСМ32,24,41. TFM и МСМ можно вычислить ячейки ECM и ячеек сил соответственно клеток, находящихся на разной жесткости матрицы. Используя этот роман assay, это можно сделать путем сравнения одновременно как вклад окружающей среды жесткости и инфекции такие измерения физических сил. После такого подхода эффект инфекции имеет на клетки-хозяина, механика всей его курс может быть определено. Кроме того эволюция внутриклеточных подчеркивает клеток могут быть рассчитаны с помощью МСМ и может использоваться как мера целостности барьер монослоя. Наконец учитывая несколько хорошо характер анализа, это можно одновременно ввести фармакологических и генетические возмущения с бактериальной инфекцией, чтобы исследовать более подробно сложного взаимодействия между принимающей ячейки механики и инфекции.
Один, которые свойственны ограничения метода лежит в субстрат жесткость эффект может иметь на скорость распространения клеток. Как правило в инфекции анализов, мы должны обеспечить, что хост плотность клеток при различных условиях является то же самое. Это потому, что плотность клеток само по себе может иметь влияние на подверженность хостов к инфекции. HMEC-1 клетки, которые были использованы в качестве клеток хозяина не показывают значительную разницу в их число, когда семенами для 24 h на гидрогели. Однако различных типов клеток могут демонстрировать дифференциального распространения, в зависимости от жесткости гидрогеля, что может исказить инфекции исследования. Аналогичным образом предвзятости инфекции могут возникнуть, когда клетки не образуют монослои или не придают хорошо на гидрогели, как происходит, когда определенные типы клеток посеян на очень мягкий матрицы (например, эндотелиальных клеток человека пуповины или Мадин-Дарби собак почек эпителиальные клетки посеян на 0,6 кПа гидрогели54,-55). Что касается патогенов, некоторые бактерии (например, Borrelia burdgorferi) можно прикрепить на принимающей ячейки и вторгнуться в их, но может также высыпками через них56. Мы еще не проверены если этот assay будет работать для исследования трансмиграции возбудителя, но это представляется возможным, поскольку предыдущие исследования на нейтрофилы пролетный эндотелиальных клеток посеян на ПА гидрогели были задокументированы, чтобы успешно работать57. Там было много исследований, проведенных показаны способы изготовления Полиакриламидные гидрогели данного Юнга, смешивая соответствующей концентрации акриламида и бис акриламид24,25,26 ,27. Однако особенно, когда один хочет выполнить TFM эксперименты на клетки, проживающих на гидрогели различной жесткости, важно для подтверждения ожидаемых жесткость гидрогели через АСМ или другие методы отступ58. Незначительные отклонения от ожидаемого значения могут возникнуть из-за различных растворителей используется или возрасте акриламида раствор, или способами AFM измерений, выполненных (например, форма кончика AFM). Наконец подход, представленные здесь основан на заполнение клеток хозяина на 2D матриц, которые могут отличаться от более реалистичным и физиологически соответствующие 3D сценария. Однако производство 3D гели с перестраиваемой жесткость, заполнения их с клетки хозяина и затем заразить их с патогенами, по-прежнему охватывает определенные технические трудности. Тем не менее мы ожидаем, что в ближайшем будущем мы сможем продлить текущий assay для изучения инфекции в 3D обстановке.
Короче говоря, описывается протокол вместе с предварительные результаты предоставляют доказательства того, что этот роман assay может стать чрезвычайно полезным инструментом для изучения инфекции клеток адэрентных хозяина с патогенных бактерий количественного моды и в гораздо более физиологически соответствующей окружающей среды, чем ранее рассмотренных. Власти фабрикуют Полиакриламидные гидрогели в предлагаемой установке лежит в том, что assay совместим с производительностью нескольких методов, таких как проточной цитометрии, иммуноокрашивания следуют светлую микроскопию и тяги силовой микроскопии. Assay может использоваться для исследований с участием инфекции типов различных принимающих адэрентных клеток патогенами, которые мы ожидаем, будет иметь значительное влияние в обоих распутывая стратегий, которыми патогенов заразить хостов и содействия развитию Терапевтические вмешательства против инфекций.

Клетки в большинства животных тканях обычно сторонником, придавая соседних клеток и их внеклеточного матрикса (ECM). Анкоридж клеток к их ECM имеет решающее значение для многих клеточных процессах, начиная от подвижности ячейки в ячейку для распространения и выживания1,2. Клеточных креплений для ECM зависит от состава ECM и жесткость. Клетки реагируют на изменения в последнем устраивая динамически повторного их цитоскелета, клетки ECM и ячеек спайки, которые в свою очередь критически изменить ячейку биомеханики и функции3,4,5,6 . ECM жесткость может варьироваться в пространстве (т.е., анатомическое расположение), время (то есть, старение) и патофизиологических процессов (например, атеросклероз, рак, инфекции, и т.п.). Например, общепризнано, что эндотелиальных клеток, расположенных на жестче-по сравнению с мягче матрицы оказывают увеличение силы их ECM и друг к другу и демонстрируют увеличение подвижности и распространения7,8. Аналогичным образом фибробласты, проживающих на жестче матрицы распространять высокие сократительной силы для их ECM и показать увеличение распространения, моторики и ECM производство9,10,11. Хотя клеток механики и ответ на ECM жесткость широко изучены для различных типов клеток, отношения между приверженцами принимающей ячейки, жесткость их ECM и бактериальных инфекций по-прежнему во многом неизвестным.
Для изучения роли ECM жесткость в взаимодействия клеток бактерий хост, моноцитогенес л (Lm) был выбран в качестве модели возбудителя. LM является вездесущий пищевого бактерия, которая может привести к системной инфекции в широкий спектр млекопитающих хостов. Эта факультативная внутриклеточных патогенов может перейти от кишечного эпителия в отдаленные органы путем обхода различных типов сосудистых endothelia. Если он нарушит blood - brain барьер, Lm может вызвать менингит, и когда он проникает через плаценту, это может вызвать самопроизвольный аборт12,13. LM могут заразить различных принимающих типы клеток и может сделать это с помощью различных патогенных стратегий. LM инфекции была изучена главным образом в контексте эпителиальных клеток, в то время как гораздо меньше известно о как Lm могут заразить и обход эндотелиальных клеток, выстилающих просвета кровеносных сосудов14,,1516. Кроме того во многом по-прежнему неизвестно, как жесткость ECM, где проживают эндотелиальных клеток модулирует Lm в способности вторгнуться в эти клетки хозяина и затем распространить. LM и несколько дополнительных видов бактериальных (т.е., риккетсии parkeri) воспользоваться Цитоскелет актина хозяина клетки, они заражают как вторгнуться в их цитоплазме и облегчить распространение к ячейке17 , 18 , 19. они достичь этого через экспрессию белков, которые позволяют им вмешиваться с принимающей актина полимеризации пути и производить хвостов кометы актина, облегчить их вперед тяги16,20. В результате инфекции клетки-хозяина Цитоскелет актина необходимо динамически изменить таким образом, который характеризуется все еще не в полной мере, потенциально затрагивающих биомеханики клеток хозяина, включая физические силы, которую они оказывают на их ECM и на каждом другие. Для изучения этих процессов, человека микрососудистой эндотелиальных клеток (HMEC-1) были выбраны в качестве модели клетки хозяина по трем причинам: 1. эндотелиальные клетки, как известно, быть очень mechanosensitive как они постоянно подвергаются воздействию различных физических сигналы21; 2 стратегии, Lm использует заразить эндотелиальные клетки все еще малоизвестная22; и 3. HMEC-1 являются увековечен клеточной линии и таким образом, легко выращиваются и подвергнуты генетической манипуляции.
Бактериальные инфекции клеток хозяина основном был учился в пробирке путем заполнения ячеек на стекло или полистирольных субстратов, которые значительно жестче, чем физиологических ECM большинства клеток12,14,23. Для изучения инфекции клеток посеян на матрицу, чьи жесткость физиологически соответствующих и прояснения роли ECM жесткость на инфекцию клеток от бактериальных патогенов, мы последовали за новаторский подход, основанный на изготовление тонких microbead встроенный Полиакриламидные гидрогели перестраиваемый жесткости на нескольких хорошо пластины. Новизна предлагаемого подхода заключается в том, что он позволяет контролировать несколько условий одновременно за несколькими хорошо формате, и в том, что он совместим с несколькими методами из-за определенным образом, строятся субстратов. HMEC-1 клетки были посеяны на этих белков покрытием гидрогелей и затем инфицированных различными Lm штаммов, которые становятся флуоресцентные по интернализации или конститутивно флуоресцентные. Роль ECM жесткость на подверженность инфекции клеток хозяина HMEC-1 был оценен проточной цитометрии. Кроме того иммуноокрашивания и флуоресцентной микроскопии были использованы для различения присоединившихся и интернализированных бактерий. Наконец тяговой силы микроскопии (TFM) была успешно проведена охарактеризовать воздействие Lm инфекции на тяговых подчеркивает, что эндотелиальных клеток хозяина оказывают на их матрицы во время инфекции. Представленные assay могут быть легко изменены для включения дальнейших исследований о влиянии ECM жесткость на инфекции, чувствительности возбудителя адэрентных клеток с использованием различных клеточных линий или патогенов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

Внеклеточные матрицы жесткости включает один из нескольких экологических механические раздражители, которые хорошо известны поведению клеток, функции и судьбу влияют в целом. Хотя все больше и больше типов адэрентных клеток ответов на матрицы жесткости характеризовались, как сторонник клеток восприимчивость к бактериальной инфекции зависит от матрицы жесткости во многом неизвестным, как действует бактериальной инфекции на Биомеханика клеток хозяина. Мы предполагаем, что подверженность эндотелиальных клеток хозяина бактериальной инфекции зависит от жесткости матрицы, на котором располагаются эти клетки, и что инфекция принимающей ячейки с бактериями изменит их биомеханики. Для тестирования этих двух гипотез, эндотелиальные клетки были использованы как модель хостов и Listeria monocytogenes как модель патогена. Развивая пробирного Роман несколькими хорошо формате, мы показываем, что эффект матрицы жесткости на инфекции эндотелиальных клеток л моноцитогенес может количественно оцениваться проточной цитометрии и иммуноокрашивания следуют микроскопии. Кроме того с помощью микроскопии силы тяги, эффект л моноцитогенес инфекции на хост биомеханики эндотелиальных клеток могут быть изучены. Предложенный метод позволяет для анализа влияния ткани соответствующих механики на бактериальной инфекции адэрентных клеток, который является важным шагом на пути к пониманию биомеханических взаимодействия между клетками, их внеклеточного матрикса, и патогенных бактерий. Этот метод также применим на широкий спектр других видов исследований клеток биомеханики и реагирования на субстрат жесткость, где важно иметь возможность выполнять многие реплицирует параллельно в каждом эксперименте.

ECM жесткость зависимых восприимчивость клеток HMEC-1 к Lm инфекции: ПА гидрогели различной жесткости, все поверхности покрытием с коллагеном я, были построены на нескольких хорошо стекла дно тарелки, как описано в Шаг 1 протокола (см. Рисунок 1). Чтобы подтвердить точное жесткость гидрогели, как описано ранее,26,27 произведены измерения AFM (см. Рисунок 2). Последние исследования показали, что местные соответствия базальной мембраны эндотелиальных клеток может варьироваться от 1 кПа (например, ткани мозга) до 70 кПа (например, аорты)36,,3738, 39 , 40. Таким образом, мы решили проверить инфекцию клеток HMEC-1, проживающих на матрицы с следующим жесткость: 0,6 кПа, 3 кПа, 20 кПа и 70 кПа. Для каждого гидрогеля жесткость шесть гидрогели были сфабрикованы для оценки воспроизводимости результатов.
Проточной цитометрии была использована для оценки подверженности ECM жесткость зависимых клеток HMEC-1 Lm инфекции (см. рис. 3). HMEC-1 клетки были инфицированы Lm штамм (JAT985), который выражает флуоресцентные маркер после интернализации (actAp::mTagRFP), позволяя обнаружения только внутриклеточных бактерий (см. рисунки 1 L - 1N). JAT985 также не хватает ActA, отключение бактерии от распространение от ячейки к ячейке, так как ActA является необходимым для формирования актина комета хвосты и последующего распространения бактерий. 7 - 8 ч после инфекция, HMEC-1 клетки была оценена с помощью проточной цитометрии. Для обеспечения анализа единичных клеток, основная часть распределения клеток был воротами с помощью вперед против стороны точечной, и затем второй шлюзовой шаг была исполнена исключить клетки, которые демонстрируют аутофлюоресценция (см. показатели 3А - 3 C ). Предварительные результаты, изображенные на рисунке 3 показывают, что HMEC-1-инфекции с Lm примерно два раза больше для клеток HMEC-1, проживающих на жесткой гидрогели 70 кПа по сравнению с клетки, проживающих на мягкой гидрогели 0,6 кПа (см. показатели 3B - 3D). Повышенная восприимчивость Lm инфекции клеток HMEC-1, проживающих на жесткой по сравнению с мягкими матрицы может быть связано с: 1. увеличение адгезии Lm на HMEC-1; 2. увеличение Lm вторжение в HMEC-1; или 3. оба наступления выше совместно. Чтобы проверить какие гипотезы трюмы, HMEC-1 клетки были посеяны на мягкие (3 кПа) и жесткой гидрогели (70 кПа) и инфицированных конститутивно GFP, выражая Lm (см. показатели 4A - 4 C). Образцы были устранены вскоре после инфекции и внешние (придерживаясь) бактерии были окрашенных с антителами. С помощью количественная микроскопия, мы обнаружили, что существует значительно больше бактерий, придерживаясь HMEC-1, когда клетки хозяина находятся на жесткой по сравнению с мягких гелей (см. рис. 4D). В соответствии с данными цитометрия потоков, существует значительно больше бактерий относить на счет HMEC-1 когда клетки хозяина находятся на жесткой по сравнению с мягких гелей (см. Рисунок 4E). Однако, аналогична эффективности вторжения (бактерии интернализации/общее количество бактерий) Lm в клетки HMEC-1, независимо от субстрата жесткость (см. Рисунок 4F).
Тяги силовой микроскопии клетки Lm инфицированных HMEC-1: LM инфекции клеток HMEC-1 может изменить биомеханику зараженных принимающей клеток, включая прочность крепления их ECM или друг к другу, затрагивающих их целостности барьер. Мы стремились оценить ли что может быть в случае с помощью тяги силовой микроскопии32 для вычисления ячейки ECM тяговой силы и41 монослоя стресс микроскопии для вычисления внутриклеточных растягивающих сил. На рисунке 5 изображена карты деформации поля, тяговые стресс поля и внутриклеточных напряженность поля клеток HMEC-1, проживающих на 20 кПа гидрогели в разное время точек послеоперационные инфекции. Фигуры 5A - 5 D обратитесь к клетки неинфицированных управления HMEC-1 во время цифры 5E - 5 H относятся к HMEC-1 клетки, инфицированные с Lm на разносторонности инфекции равным 300 бактерий на ячейку. Эта предварительная работа свидетельствует о том, что инфицированные клетки HMEC-1 сократить масштабы их клетки ECM и внутриклеточных подчеркивает в течение инфекции с Lm, то что не наблюдается для неинфицированных управления клеток.
ECM жесткость зависимых Lm распространение через монослои HMEC-1: Покадровой микроскопия была использована для исследовать эффект матрицы жесткости имеет на Lm распространение через монослои HMEC-1. Как Lm распространяется через монослоя, бактерии фокусирования инфекции, который растет как функцию времени (см. Рисунок 6A и видео рисунки 1 и 2). Область фокуса инфекции была измерена путем рисования выпуклую, наименьший выпуклый многоугольник, который включает в себя набор точек, вокруг бактерии42. Существует нет стандартной метрики в поле, чтобы измерить эффективность л моноцитогенес в ячейке распространения через монослоя клеток хозяина. Чтобы оценить эффективность распространения, некоторые подсчитали количество клеток хозяина в фокус инфекции41, и другие рисованные границ вручную вокруг группы инфекции принимающей ячейки43. Мы решили нарисовать выпуклый многоугольник вокруг бактерии, потому что это автоматизированный, последовательной и вычислительно недорогой процесс для измерения эффективности распространения моноцитогенес л . Поступая таким образом, мы нашли небольшое уменьшение в области фокуса инфекции в клетках HMEC-1 посеян на 70 кПа гидрогели, когда по сравнению с теми посеян на 3 кПа матрицы (см. Рисунок 6B и видео рисунки 1 и 2). Чтобы определить темпы роста фокуса инфекции, радиальное расстояние было изобразить как функцию от времени путем извлечения квадратного корня из области фокуса инфекции и деления это Пи. Это математическое преобразование предполагает, что форма инфекции фокус находится примерно круговой44. Чтобы измерить скорость роста внимания, была измерена скорость изменения (т.е., склон) радиальное расстояние для обоих матрицы 3 - х и 70-х кПа. Этот подход дал разъяснения в фокус инфекции росло быстрее и монотонно в клетках HMEC-1 посеян на 3-КНА матрицы. Однако фокус росли значительно медленнее (первые 200 мин) и немного медленнее (200 до 600 мин) в клетках посеян на 70 кПа матрицы (см. рис. 6C). Действительно, анализ дополнительных данных подтвердил, что фокус инфекции росло, в среднем два раза медленнее в матрицах 70 кПа, особенно во время первых 200 мин (см. рис. 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> Рисунок 3 : ECM жесткость зависимых восприимчивость клеток HMEC-1 для Lm вторжения измеряется с помощью проточной цитометрии .  HMEC-1 клетки были заражены лм (JAT985), и инфекции был проанализирован проточной цитометрии. А. Эта группа показывает сторона против вперед точечный график для представительных клеток HMEC-1, из одной скважины. Массового распространения клеток был выбран через стробирования исключить мусора (слева) и клетки Дуплеты или тройня (справа). Б. Этот график показывает гистограмму логарифма Lm интенсивности флуоресценции в клетку для HMEC-1 покрытие на мягкой 0,6 кПа. C. Этот график показывает гистограмму логарифма интенсивности флуоресценции Lm на ячейку для HMEC-1 покрытием на жесткой гидрогели 70 кПа. Гистограммы для N = 4-6 реплицирует отображаются разными цветами. Гистограмма управления неинфицированных клеток фиолетовый. Ворота, используемый для определения, что заражен отображается красным цветом. МВД-100 и инфекция была начисленных 8 h послеоперационные инфекции. Д. данные показывают процент инфицированных клеток HMEC-1 против гидрогеля жесткость (N = 5). Турники изображают данных среднее. P-значение было рассчитано с непараметрический тест Вилкоксон ранг сумма. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> Видео Рисунок 1: распространение внутриклеточных Lm (красный канал) через монослоя клеток HMEC-1 (фаза) с семенами на подложке 3-кПа. Клетки были отражаться в средствах массовой информации Лейбовиц L-15 (10% FBS, 20 мкг/мл гентамицина) внутри, климатическая камера, достижение равновесного уровня до 37 градусов. Изображения были собраны каждые 5 мин. Фильм скорость-15 кадров в секунду <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> Видео Рисунок 2: распространение внутриклеточных Lm (красный канал) через монослоя клеток HMEC-1 (фаза) с семенами на подложке 70 кПа. Клетки были отражаться в средствах массовой информации Лейбовиц L-15 (10% FBS, 20 мкг/мл гентамицина) внутри, климатическая камера, достижение равновесного уровня до 37 ° C. Изображения были собраны каждые 5 мин. Фильм скорость-15 кадров в секунду <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Модуль Юнга (E, кПа)</td>
			<td>Акриламид % (от 40% акций)</td>
			<td>Bisacrylamide % (от 2% акций)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.6</td>
			<td>3</td>
			<td>0.045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0.195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
</tbody></table> В таблице 1. Состав гидрогели полиакриламид (PA) различной жесткости. В этой таблице, процент акций 40% акриламида раствор и процент фондовых бис акриламида раствор 2% для достижения заданной жесткость (Юнга, E) указаны в разных столбцах.
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> Дополнительные материалы 1. Вычисление внутриклеточных напряженности от вычисляемых тяги напряжений. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Мы разработали несколько хорошо формат на основе полиакриламида assay для зондирования эффект внеклеточной матрицы жесткости на бактериальные инфекции адэрентных клеток. Этот assay совместим с проточной цитометрии, иммуноокрашивания и тяги силовой микроскопии, позволяя для количественных измерений биомеханических взаимодействия клеток, их внеклеточного матрикса и патогенных бактерий.

Несколько хорошо формат на основе полиакриламида Assay для изучения влияния внеклеточной матрицы жесткости на бактериальные инфекции адэрентных клеток

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

После Cell-судьба<em&gt; E. палочки</em&gt; После заражения фагом лямбда

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Визуальный анализов для мониторинга T6SS-опосредованной Бактериальные конкурса

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Использование химии Нажмите для оценки влияния вирусной инфекции на клетки-хозяина синтеза РНК

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Исследование действия пробиотиков на пневмококковой колонизации Использование<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Соблюдение Анализ

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Внедрение системы инфекционного проницаемой мембраны Вставка на основе для изучения влияния секретируемых бактериальными токсинами на млекопитающих клеток-хозяев

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Анализы для изучения роли Vitronectin в бактериальной адгезии и сопротивление сыворотки

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Вазодилатацию изолированных судов и Изоляция внеклеточного матрикса мышей Плотно кожи

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Протоколы для исследования распределения Хоста-ткань, Transmission-режим, и эффекта на хост приспособленности Densovirus в хлопковой совке

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...