Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

Nuestro agradecimiento a M. pie, R. Lamason, M. Rengaranjan y miembros del laboratorio de Theriot para sus discusiones y soporte experimental. Este trabajo fue apoyado por NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), las becas Gilliam de HHMI para estudio avanzado (F.E.O.), la beca postgrado de Stanford (F.E.O.) y la Asociación Americana de corazón (E.E.B.). Citometría de flujo se realizó en las instalaciones de FACS compartido de Stanford.

Los autores no tienen nada que revelar.

Las células pueden sentir una variedad de señales ambientales físicos, que puede afectar no sólo la morfología de las células, sino también su actividad de expresión y proteína los genes, afectando células críticas funciones y comportamientos de45,46. La rigidez de la ECM de células es cada vez más apreciada como un importante modulador de la motilidad celular, diferenciación, proliferación y en última instancia celular destino47,48,49. Aunque ha habido muchos avances recientes en la comprensión de la interacción biomecánica compleja entre las células y su ECM, poco se sabe sobre cómo ambiental rigidez afecta la susceptibilidad de las células a la infección bacteriana. Para facilitar este tipo de estudios, hemos desarrollado este análisis múltiples bien nuevo basado en la fabricación bien establecida de hidrogeles de poliacrilamida de rigidez ajustable compatible con infección ensayos50. Tradicionalmente, una infección bacteriana de las células en cultivo de tejidos ha sido estudiada en cristal o poliestireno que son aproximadamente 1-3 órdenes de magnitud más rígidas que el ECM natural más adherente células8,51. El ensayo descrito aquí abre nuevas carreteras al permitir el estudio de las interacciones bacterias-host en un régimen de rigidez ambiental fisiológicamente relevantes.
Para prueba de concepto del ensayo presentado, juego-1 células fueron elegidas como las células del huésped adherente modelo y Lm como un patógeno bacteriano de modelo. Sin embargo, el análisis puede ampliarse para continuar sus estudios si apropiadamente modificada. Este tipo de estudios puede implicar infección host adherente mamíferos diferentes tipos de células por más patógeno, incluyendo bacterias y virus. Para este análisis particular, geles fueron proteína-recubierta de colágeno I, pero dependiendo del tipo de la célula huésped, es posible utilizar una proteína diferente ECM-capa, como fibronectina, laminina, para facilitar la fijación de las células hospedadoras de interés sobre el hidrogel 52. una consideración adicional que depende del tipo de la célula huésped es el rango de rigidez de hidrogel a estudiar. La gama de rigidez debe depender de lo que es fisiológicamente relevante para el tipo de la célula huésped específica y cómo ese host une formando una monocapa en un hidrogel rigidez determinada. Del mismo modo, dependiendo del patógeno modelo desea examinarse, ligeras modificaciones deba aplicarse en el ensayo de infección descrito.
La innovación del ensayo en comparación con los métodos anteriores para la fabricación de poliacrilamida hidrogel24,50,53 radica en ciertas características integradas en el análisis propuesto de la infección. En primer lugar, los hidrogeles están construidos en placas de varios pocillos de vidrio inferior, que permite la proyección de varias condiciones simultáneamente, así como la automatización de algunos procedimientos. Monitoreo varias condiciones al mismo tiempo o examinar múltiples repeticiones es fundamental ya que el resultado de este enfoque puede ser influenciado por factores como el paso de célula de host y el número exacto de bacterias añadido para infectar a los anfitriones, que a menudo cambian entre experimentos independientes. Una característica única adicional de este ensayo es que los hidrogeles tienen una altura de aproximadamente 40 μm, que es lo suficientemente delgada como para obtener imágenes mediante microscopía convencional. Hemos demostrado que podemos realizar con éxito tanto microscopía de células vivas y fijación de células y el immunostaining seguido de proyección de imagen, sin la introducción de la fluorescencia de fondo alta. Por último, los hidrogeles están hechos de dos capas, con el superior habiendo integrado microesferas fluorescentes, confinados en un solo plano focal. Este atributo se asegura que no habrá ninguna luz fuera de enfoque interferir durante proyección de imagen. La presencia de los granos permite tanto el examen de la topografía superficial de los geles que son uniformes y mejora el rendimiento de TFM y MSM24,32,41. Con TFM y MSM, es posible calcular las fuerzas ECM de célula y célula de las células que residen en diferentes matrices de rigidez respectivamente. Usando este nuevo análisis, es posible hacer estas mediciones de fuerzas físicas comparando simultáneamente tanto la contribución de rigidez ambiental y de la infección. Siguiendo este enfoque, la infección del efecto tiene en la célula huésped puede determinarse mecánica a lo largo de su curso. Además, la evolución de las tensiones intracelulares de las células puede ser calculada utilizando MSM y puede ser utilizada como una medida de la integridad de la barrera de la monocapa. Finalmente, dada la naturaleza multi-bien el ensayo, es posible simultáneamente introducir perturbaciones genéticas y farmacológicas con una infección bacteriana, para investigar más a fondo la compleja interacción entre el anfitrión célula mecánica y la infección.
Una limitación inherente de la técnica radica en la rigidez de sustrato de efecto puede tener sobre la tasa de proliferación de las células. Por lo general, en ensayos de infección, necesitamos asegurar que la densidad celular de host bajo diferentes condiciones es el mismo. Eso es porque la densidad de la célula por sí mismo puede tener un efecto sobre la susceptibilidad de los ejércitos a la infección. Las células de juego-1 que fueron utilizadas como las células del huésped no muestran una diferencia significativa en su número cuando sembradas durante 24 h en los hidrogeles. Sin embargo, diferentes tipos de células pudieron exhibir la proliferación diferencial, dependiendo de la rigidez de hidrogel, que puede sesgar los estudios de la infección. Del mismo modo, sesgo de infección puede presentarse cuando las células no forman monocapas o no se fije bien en los hidrogeles, como ocurre cuando ciertos tipos de células se siembran en matrices muy suaves(por ejemplo, las células endoteliales de cordón umbilical humano o riñón canino Madin-Darby las células epiteliales sembradas en 0,6 kPa hidrogeles54,55). En cuanto a los agentes patógenos, pueden adjuntar ciertas bacterias (por ejemplo, Borrelia burdgorferi) en sede de las células e invaden pero también puede transmigrada a través de ellos56. Todavía no hemos probado si este ensayo funcionaría para estudios de la transmigración de los patógenos, pero parece posible ya que los estudios anteriores en neutrófilos células endoteliales sembradas en hidrogeles de PA de transmigrating han sido documentados para trabajar con éxito57. Ha habido muchos estudios que muestran cómo fabricar hidrogeles de poliacrilamida de módulo de Young de un determinado mediante la mezcla de las adecuadas concentraciones de acrilamida y bis-acrilamida24,25,26 ,27. Sin embargo, especialmente cuando se quiere realizar experimentos TFM en las células que residen en hidrogeles de rigidez variable, es fundamental para confirmar la rigidez esperada de los hidrogeles ya sea a través de AFM u otras técnicas de indentación58. Leve desviación del valor esperado puede presentarse debido a un diferente solvente utilizado o una solución stock de acrilamida, o por las maneras AFM mediciones son realizadas (por ejemplo, la forma de la punta AFM). Finalmente, el enfoque aquí presentado se basa en la siembra de las células del huésped en las matrices 2D, que pueden diferir de un escenario 3D más realista y fisiológicamente relevante. Sin embargo, fabricación de geles 3D con rigidez sintonizable, siembra con las células del huésped y entonces infectándolos con patógenos, todavía abarca ciertas dificultades técnicas. Sin embargo, prevemos que en un futuro cercano seremos capaces de extender el ensayo actual para el estudio de infección en un entorno 3D.
En definitiva, el protocolo descrito junto con los resultados preliminares evidencian que este ensayo novela puede convertirse en una herramienta extremadamente útil para el estudio de la infección de las células del huésped adherente con bacterias patógenas de forma cuantitativa y de una manera mucho más ambiente fisiológico relevante que anteriormente examinados. El poder de fabricar poliacrilamida hidrogel en la configuración de la propuesta radica en que el ensayo es compatible con el desempeño de varias técnicas como la citometría de flujo, immunostaining seguido por microscopía óptica y microscopia de la fuerza de tracción. El ensayo puede ser utilizado para estudios que incluyeron la infección de los tipos de células diferentes host adherente por patógenos, que prevemos tendrá un impacto significativo en ambas desentrañar las estrategias por los cuales patógenos infectan a anfitriones y en facilitar el desarrollo de intervenciones terapéuticas contra las infecciones.

Las células en los tejidos más animales son típicamente adherentes, fijación a células vecinas y a su matriz extracelular (ECM). El anclaje de las células para su ECM es crítico para muchos procesos celulares que van desde la movilidad de la célula a la célula de la proliferación y supervivencia de1,2. Celular anclaje al ECM depende de la composición del ECM y la rigidez. Las células responden a los cambios en el último por reordenación dinámicamente su citoesqueleto, adherencias de ECM de la célula y célula, que a su vez críticamente alteran celulares funciones y biomecánica3,4,5,6 . Rigidez del ECM puede variar en el espacio (es decir, localización anatómica) en tiempo (es decir, envejecimiento) y en procesos fisiopatológicos (p. ej., arteriosclerosis, cáncer, infecciones, etc.). Por ejemplo, está ampliamente aceptado que endothelial las células que residen en más rígido-en comparación con matrices más suave ejercen fuerzas mayores a la ECM y uno al otro y exhiben mayor motilidad y proliferación7,8. Asimismo, fibroblastos residentes en matrices más imparten altas fuerzas contráctiles a lo ECM y aumento de la proliferación, movilidad y ECM producción9,10,11. Aunque mecánica celular y respuesta a la rigidez de la ECM han sido estudiados ampliamente para diversos tipos de células, la relación entre las células del huésped adherente, la rigidez de su ECM y las infecciones bacterianas es aún desconocida.
Para estudiar el papel de la rigidez de la ECM en las interacciones de célula de bacterias-host, L. monocytogenes (Lm) fue elegido como el patógeno de la modelo. LM es una bacteria ubicua transmitidas por los alimentos que puede causar infección sistémica en una amplia variedad de hospedadores mamíferos. Este patógeno intracelular facultativo puede mover desde el epitelio intestinal a órganos distantes por atravesar diferentes tipos de endothelia vascular. Si se practica una abertura la barrera blood - brain, Lm puede causar meningitis, y cuando cruza la placenta, puede causar aborto espontáneo12,13. LM puede infectar a tipos diferentes host de la célula y puede hacerlo mediante el uso de estrategias diferentes de patógenos. Infección de la LM se ha estudiado sobre todo en el contexto de las células epiteliales, mientras que mucho menos se sabe acerca de cómo puede infectar a Lm y derivación de células endoteliales recubren el lumen de los vasos sanguíneos14,15,16. Por otra parte, se desconoce todavía en gran parte cómo la rigidez de la ECM donde residen las células endoteliales modula la capacidad de Lm para invadir las células del huésped y luego se extendió. LM y varias otras especies bacterianas (es decir, Rickettsia parkeri) tomar ventaja del citoesqueleto de actina del huésped que infectan tanto células invaden en su citoplasma y facilitan la diseminación de célula a célula17 , 18 , 19. que alcanzan a través de la expresión de proteínas que puedan interferir con vías de polimerización de actina host y producir colas de cometa de actina que facilitan su propulsión16,20. Como resultado de infección, el citoesqueleto de actina de la célula huésped necesita cambiar dinámicamente de manera que no se caracteriza, podrían afectar la biomecánica de las células del anfitrión como las fuerzas físicas que ejercen en su ECM y en cada uno otros. Para examinar estos procesos, las células endoteliales microvasculares humanas (juego 1) fueron elegidas como las células del huésped modelo por tres razones: 1. las células endoteliales son conocidas por ser altamente mechanosensitive como están constantemente expuestos a las diversas señales físicas21; 2. las estrategias que emplea a Lm para infectar las células endoteliales son todavía en gran parte desconocido22; y 3. JUEGO-1 son una línea celular inmortalizada y puede, por lo tanto, ser fácilmente cultivados y sometidos a manipulación genética.
Infección bacteriana de las células del huésped ha sido sobre todo estudiado en vitro por la siembra de células en vidrio o poliestireno sustratos que son significativamente más rígidos que el ECM fisiológico de la mayoría células12,14,23. Examinar la infección de las células sembradas en una matriz cuya rigidez es fisiológicamente relevante y aclarar el papel de la rigidez de la ECM en la infección de células por bacterias patógenas, seguimos un enfoque innovador basado en la fabricación de finas hidrogeles de poliacrilamida del microbead incrustado de rigidez ajustable en placas de varios pocillos. La novedad de la propuesta radica en que permite un monitoreo varias condiciones simultáneamente debido a su formato y bien y que es compatible con múltiples técnicas debido a la forma particular que los sustratos se construyen. JUEGO-1 células fueron sembradas en estos hidrogeles recubierto de proteína y luego infectadas con diferentes cepas de Lm que son constitutivamente fluorescentes o ser fluorescente sobre internalización. El papel de la rigidez de la ECM en la susceptibilidad de la infección de las células del huésped puede-1 se evaluó por citometría de flujo. Además, inmunotinción y fluorescencia microscopía fueron utilizados para distinguir entre bacterias adherentes e internalizadas. Por último, microscopia de fuerza de tracción (TFM) fue realizada con éxito para caracterizar el efecto de la infección de la Lm en las tensiones de tracción que ejercen las células endoteliales del huésped en sus matrices durante la infección. El ensayo presentado puede modificarse fácilmente para permitir más estudios sobre el efecto de la rigidez de la ECM en la susceptibilidad de la infección de células adherentes utilizando diferentes líneas celulares o patógenos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

Rigidez de la matriz extracelular constituye uno de los múltiples estímulos ambientales mecánicos que son bien conocidos para influir en comportamiento celular, la función y el destino en general. Aunque las respuestas cada vez más tipos de células adherentes a tiesura de la matriz se han caracterizado, como adherente de susceptibilidad de las células a la infección bacteriana depende de la rigidez de la matriz es en gran medida desconocido, como es el efecto de la infección bacteriana en el Biomecánica de las células del huésped. Presumimos que la susceptibilidad de las células endoteliales del huésped a una infección bacteriana depende de la rigidez de la matriz en la que estas células residen, y que la infección del huésped células con bacterias que cambiará su biomecánica. Para poner a prueba estas dos hipótesis, las células endoteliales fueron utilizadas como modelo hosts y Listeria monocytogenes como un patógeno de modelo. Mediante el desarrollo de un ensayo de novela formato multi-bien, nos muestran que el efecto de la rigidez de la matriz sobre la infección de células endoteliales por L. monocytogenes puede evaluarse cuantitativamente a través de citometría de flujo y el immunostaining seguido por microscopia. Además, utilizando microscopía de fuerza de tracción, el efecto de la infección por L. monocytogenes en la biomecánica de la célula endotelial de host puede estudiarse. El método propuesto permite el análisis del efecto de la mecánica de tejido relevante sobre infección bacteriana de las células adherentes, que es un paso decisivo hacia la comprensión de las interacciones biomecánicas entre las células, la matriz extracelular, y bacterias patógenas. Este método también es aplicable a una amplia variedad de otros tipos de estudios en biomecánica celular y respuesta a la rigidez del sustrato donde es importante ser capaz de realizar muchas repeticiones en paralelo en cada experimento.

Susceptibilidad del dependiente de la rigidez de ECM de juego-1 células a la infección de la Lm: PA los hidrogeles de rigidez diferente, todos recubrir en su superficie con colágeno I, fueron construidos en placas de varios pocillos de vidrio inferior como se describe en el paso 1 del Protocolo (ver figura 1). Se realizaron mediciones de AFM para confirmar la rigidez exacta de los hidrogeles, como se describió anteriormente26,27 (ver figura 2). Estudios anteriores han demostrado que el cumplimiento local de la membrana basal de las células endoteliales puede fluctuar de 1 kPa (p. ej., tejido fino del cerebro) a 70 kPa (p. ej., aorta)36,37,38, 39 , 40. por lo tanto, decidimos probar la infección de las células de juego-1 que residen en las matrices con la siguiente rigidez: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa y 70 kPa. Para cada rigidez de hidrogel, seis hidrogel fueron fabricados para evaluar la reproducibilidad de los resultados.
Citometría de flujo se utilizó para evaluar la susceptibilidad de dependiente de la rigidez de ECM de juego-1 células a la infección de la Lm (ver figura 3). JUEGO 1 las células fueron infectadas con una cepa de Lm (JAT985) que expresa un marcador fluorescente después de internalización (actAp::mTagRFP), permitiendo la detección de bacterias intracelulares solamente (véase figuras 1 L - 1N). JAT985 también carece de ActA, desactivar las bacterias que se separa de célula a célula, ya que ActA es necesario para la formación de colas de cometa de la actinia y posterior difusión bacteriana. 7 - infección después de 8 h, infección de las células de juego-1 se evaluó mediante citometría de flujo. Para garantizar el análisis de las células, la mayor parte de la distribución de los recuentos de células fue cerrada usando el delantero frente a diagrama de dispersión lateral, y luego un segundo paso bloquea fue realizado para excluir las células que presentan Autofluorescencia (ver figuras 3A - 3C ). Los resultados preliminares, representados en la figura 3 muestran que la infección de 1 juego con Lm es aproximadamente dos veces mayor para juego-1 células residentes en los hidrogeles de kPa 70 rígida en comparación con las células que residen en los hidrogeles de kPa 0,6 suave (ver figuras 3B - 3D). la mayor susceptibilidad de infección de Lm de juego-1 células residentes en rigidez en comparación con matrices suaves podría ser debido a: 1. mayor adherencia de la Lm en juego-1; 2. creciente invasión de Lm en juego-1; o 3. tanto de la anterior colaboración que ocurre. Para probar que hipótesis sostiene, juego-1 células fueron sembradas en suave (3 kPa) y rígido (kPa 70) hidrogeles e infectadas con GFP constitutivamente expresan Lm (ver figuras 4A - 4C). Las muestras se fijaban poco después de la infección y las bacterias (adherentes) externas fueron teñidas con anticuerpos. Usando microscopia cuantitativa, encontramos que hay significativamente más bacterias adhiriéndose al juego 1 cuando las células hospedadoras residen en rigidez en comparación con los geles suaves (véase la figura 4D). De acuerdo con los datos de la citometría de flujo, hay bacterias más internalizados por el juego 1 cuando las células hospedadoras residen en rigidez en comparación con los geles suaves (ver figura 4E). Sin embargo, la eficiencia de la invasión (bacterias internalizadas/número total de bacterias) de Lm en las células puede-1 es similar, independientemente de su rigidez de substrato (ver figura 4F).
Microscopia de fuerza de tracción de las células infectadas por Lm juego-1: Infección de LM de las células puede-1 podría alterar la biomecánica de las células del huésped infectadas, incluyendo la fuerza del apego a su ECM o entre sí, afectando la integridad de la barrera. Se intentó evaluar si podría ser el caso mediante el uso de microscopia de fuerza de tracción32 para calcular las fuerzas de tracción celular ECM y monocapa estrés microscopia41 para calcular las fuerzas tensionales intracelulares. Figura 5 muestra los mapas del campo de deformación, campo de tensión de tracción y tensión intracelular campo de juego-1 células residentes en hidrogeles de 20 kPa en tiempo diferentes puntos post infección. Figuras 5A - 5D se refieren a las células control no infectado puede-1 mientras que de figuras 5E - 5 H consulte juego-1 células infectadas con Lm en una multiplicidad de infección igual al celular 300 bacterias. Este trabajo preliminar sugiere que células infectadas 1 puede reducen la magnitud de su célula ECM y estrés intracelulares durante el curso de una infección con Lm, mientras no se observa para las células control no infectado.
Difusión a través de monocapas de 1 juego en ECM dependiente de la rigidez Lm: Microscopía de lapso de tiempo fue utilizado para investigar el efecto de rigidez de la matriz tiene en la difusión de Lm a través de monocapas de juego-1. Como Lm se propaga a través de la monocapa, las bacterias crean un foco de infección que crece como una función del tiempo (ver figura 6A y Video las figuras 1 y 2). La zona del foco de infección se midió mediante la elaboración de un casco convexo, el polígono convexo más pequeño que abarca un conjunto de puntos, alrededor de las bacterias42. Hay no hay métricas estándar en el campo para medir la eficiencia de la diseminación de célula a célula de L. monocytogenes a través de una monocapa de células hospedadoras. Evaluar la eficiencia de la propagación, algunos han contado el número de las células del huésped en un foco de infección41, y otros tienen límites dibujados manualmente alrededor del grupo de infección host células43. Elegimos dibujar un polígono convexo alrededor de las bacterias, porque es un proceso automatizado consistente y cómputo barato para medir la eficiencia de la diseminación de L. monocytogenes . Al hacerlo, encontramos un leve descenso en el área de foco de infección en las células de juego-1 sembradas a 70 kPa hidrogeles en comparación con las sembradas en 3 matrices kPa (ver figura 6B y Video las figuras 1 y 2). Para determinar la tasa de crecimiento de los focos de infección, la distancia radial fue trazada como una función del tiempo tomando la raíz cuadrada del área del foco de infección y dividiendo esto por pi. Esta transformación matemática se supone que la forma del foco de infección es áspero circular44. Para medir la velocidad de crecimiento de la atención, se midió la tasa de cambio (es decir, la pendiente) de la distancia radial de dos matrices 3 y 70 kPa. Este enfoque esclareció que el foco de infección creció más rápido y monótonamente en juego-1 células sembradas sobre matrices de 3 kPa. Sin embargo, el enfoque creció significativamente más lento (primeros 200 min) y un poco más lento (200 a 600 min) en las células sembradas sobre matrices de 70 kPa (ver figura 6C). De hecho, el análisis de datos más confirmó que el foco de infección creció en promedio, dos veces más lento en matrices de 70 kPa, especialmente durante los primeros 200 minutos (ver figura 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> Figura 3 : Susceptibilidad dependiente de la rigidez de ECM de juego-1 células invasión Lm medida usando citometría de flujo .  JUEGO 1 las células fueron infectadas con Lm (JAT985) y la infección fue analizada por citometría de flujo. A. este panel muestra un lado frente a parcela de dispersión hacia adelante para células de juego-1 representante procedente de un solo pozo. La distribución a granel de células fue seleccionada a través de compuerta para excluir residuos (izquierda) y la célula dobletes o tripletes (derecha). B. este gráfico muestra un histograma del logaritmo de la intensidad de fluorescencia de Lm por la célula para juego-1 plateado en suave 0,6 kPa. C. este gráfico muestra un histograma del logaritmo de la intensidad de fluorescencia de Lm por la célula para juego-1 plateado en rígido 70 kPa hidrogeles. Los histogramas para N = 4-6 repeticiones se presentan en diferentes colores. Histograma de las células control no infectado es de color púrpura. En rojo se muestra la puerta utilizada para definir lo que está infectado. El MOI es 100 y la infección se evaluaron 8 h post-infección. D. los datos muestran el porcentaje de células infectadas puede-1 versus rigidez de hidrogel (N = 5). Las barras horizontales representan la media de los datos. El P-valor se calculó con la prueba no paramétrica de Wilcoxon Rank Sum. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> Video figura 1: difusión de Lm intracelular (canal rojo) a través de una monocapa de células de juego-1 (fase) sembradas en un sustrato 3 kPa. Las células se reflejada en los medios de comunicación L-15 de Leibovitz (10% FBS, 20 μg/mL de gentamicina) dentro de una cámara ambiental equilibrada a 37 ° c. Las imágenes fueron recogidas cada 5 min. La velocidad de película es de 15 fotogramas/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> Video figura 2: difusión de Lm intracelular (canal rojo) a través de una monocapa de células de juego-1 (fase) sembradas en un sustrato de 70 kPa. Las células se reflejada en los medios de comunicación L-15 de Leibovitz (10% FBS, 20 μg/mL de gentamicina) dentro de una cámara ambiental equilibrada a 37 ° C. Las imágenes fueron recogidas cada 5 min. La velocidad de película es de 15 fotogramas/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Módulo de Young (E, kPa)</td>
			<td>% De acrilamida (de 40% de acciones)</td>
			<td>% Bisacrilamida (de 2% de acciones)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.6</td>
			<td>3</td>
			<td>0.045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0.075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0.195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
</tbody></table> Tabla 1. Composición de hidrogeles de poliacrilamida (PA) de rigidez diferente. En esta tabla, el porcentaje de solución stock acrilamida del 40% y el porcentaje de stock bis-acrilamida solución al 2% para alcanzar una determinada rigidez (módulo de Young, E) se indican en columnas diferentes.
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> Material suplementario de 1. Cálculo de tensión intracelular de tensiones de tracción calculada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells (Video) | JoVE

Hemos desarrollado un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para sondear el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes. Este análisis es compatible con citometría de flujo, inmunotinción y microscopía de fuerza de tracción, lo que permite mediciones cuantitativas de las interacciones biomecánicas entre las células y su matriz extracelular, las bacterias patógenas.

Un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para estudiar el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion (Video) | JoVE

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda (Video) | JoVE

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition (Video) | JoVE

Un ensayo visual para monitorear T6SS mediada por la competencia bacteriana

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis (Video) | JoVE

Usando Click Química para medir el efecto de la infección viral en el Host-Cell ARN Síntesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay (Video) | JoVE

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo de adherencia

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow (Video) | JoVE

El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells (Video) | JoVE

Implementación de un Sistema de infección basada en la inserción de membrana permeable para estudiar los efectos de toxinas secretadas bacterianas en células huésped de mamífero

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance (Video) | JoVE

Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice (Video) | JoVE

Vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm (Video) | JoVE

Los protocolos para la investigación de la distribución original de los tejidos, modo de transmisión, y el efecto sobre la aptitud de un anfitrión Densovirus en el gusano de la cápsula del algodón

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...