Name: a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

Vårt tack till M. sidfot, R. Lamason, M. Rengaranjan och medlemmar av Theriot Lab för deras diskussioner och experimentellt stöd. Detta arbete stöds av NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam stipendiet för avancerad studie (F.E.O.), den Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) och den amerikanska hjärtat Association (E.E.B.). Flödescytometri utfördes vid Stanford delade FACS anläggningen.

Författarna har något att avslöja.

Celler kan känna en mängd fysiska miljö ledtrådar, vilket kan påverka inte bara cellernas morfologi men också deras gen uttryck och protein aktivitet, vilket påverkar kritiska cell funktioner och beteenden45,46. Styvheten i ECM av celler uppskattas alltmer som en viktig modulator av cellulära motilitet, differentiering, spridning, och slutligen cell öde47,48,49. Även om det har förekommit många senaste framsteg i att förstå det komplexa biomekaniska samspelet mellan celler och deras ECM, är lite känt om hur miljön stelhet påverkar mottagligheten av celler för bakteriell infektion. För att underlätta sådana studier har utvecklat vi denna roman flera analys baserat på väletablerade tillverkning av polyakrylamid hydrogels avstämbara styvhet som är förenlig med infektion analyser50. Traditionellt har har en bakteriell infektion i celler i vävnadskultur studerats på glas eller polystyren ytor som är cirka 1-3 storleksordningar styvare än naturliga ECM mest vidhäftande celler8,51. Analysen beskrivs här öppnar nya vägar genom att aktivera studiet av bakterier-värd-interaktioner i en fysiologiskt relevanta miljömässiga stelhet regim.
För bevis på konceptet presenteras analysens valdes HMEC-1 celler som modell vidhäftande värdceller och Lm som modell bakteriella patogener. Analysen kan dock förlängas för ytterligare studier om lämpligt ändras. Sådana studier kan innebära infektion av olika däggdjur vidhäftande värd celltyper genom ytterligare patogener, inklusive bakterier och virus. För denna särskilda analys, geler protein-belades med kollagen I, men beroende på mottagande cell, är det möjligt att använda en annan ECM protein-beläggning, såsom laminin eller Fibronektin, att underlätta fastsättningen av vara värdcellerna sevärdheter på hydrogel 52. en ytterligare faktor som beror på vilken värd cell är intervallet hydrogel stelhet studeras. Spänna av stelhet bör bero på vad är fysiologiskt relevanta för den specifika värd celltypen och hur väl den värden fäster bildar en enskiktslager på en viss stelhet hydrogel. På samma sätt, beroende på modell patogener önskas att undersökas, smärre ändringar behöva genomföras på infektion analysen beskrivs häri.
Innovation av analysen jämfört med tidigare metoder för tillverkning polyakrylamid hydrogels24,50,53 ligger i vissa unika funktioner integrerade i föreslagna infektion analysen. Först, hydrogels byggs på flera glas botten pläterar, som möjliggör screening av flera villkor samtidigt samt automatisering av vissa förfaranden. Övervaka flera villkor på samma gång eller undersöka flera replikat är avgörande eftersom resultatet av en sådan strategi kan påverkas av faktorer som den mottagande cell passagen och det exakta antalet bakterier tillsätts infektera värdar, som ofta ändrar mellan oberoende experiment. En ytterligare unik funktion av denna analys är att hydrogeler har en höjd av cirka 40 µm, vilket är tunn nog att bilden med hjälp av konventionella mikroskopi. Vi visade att vi framgångsrikt kan utföra både levande cell mikroskopi cell fixering och immunfärgning följt av imaging, utan att införa hög bakgrund fluorescens. Slutligen är hydrogeler tillverkade av två lager, med den övre med inbäddade fluorescerande mikrokulor, begränsade till en enda fokalplan. Detta attribut säkerställer att det inte blir någon out-of-fokus ljus stör under imaging. Förekomsten av pärlorna gör prövning såväl av ytans topografi av gelerna så att de är enhetliga och förbättrar prestanda för TFM och MSM24,32,41. Med TFM och MSM är det möjligt att beräkna cell-ECM och cell-cell styrkor respektive celler bosatt på varierande stelhet matriser. Med denna roman analys, är det möjligt att göra sådana mätningar av fysiska krafter genom att jämföra båda bidrag av miljömässiga stelhet och infektion samtidigt. Efter ett sådant tillvägagångssätt har effekt infektionen på värdcellen mekanik under hela dess kurs kan bestämmas. Dessutom utvecklingen av intracellulära stressen i celler kan beräknas med hjälp av MSM och kan användas som ett mått på enskiktslager barriär integritet. Slutligen, flera med tanke på analysen, det är möjligt att samtidigt införa farmakologiska och genetiska störningar med en bakteriell infektion, att undersöka mer ingående det komplexa samspelet mellan mottagande cell mekanik och infektion.
En inneboende begränsning i tekniken ligger i effekt substrat styvheten kan ha på andelen spridning av celler. Vanligtvis i infektion analyser måste vi se till att mottagande cell densiteten under olika förhållanden är samma. Det beror på att cell densiteten av sig själv kan påverka känsligheten för värdar till infektion. HMEC-1 celler som användes som värdceller visar inte en signifikant skillnad i antalet när seedade för 24 h på hydrogels. Dock kan olika celltyper uppvisar differentiell spridning, beroende på hydrogel styvheten, som kan bias infektion studier. Likaså kan infektion bias uppstå när celler utgör inte enskiktslager eller inte fäster bra på hydrogels, som uppstår när vissa celltyper är seedade på mycket mjuk matriser (t.ex., mänskliga navelsträngen endotelceller eller Madin-Darby canine njure epitelceller ympats på 0,6-kPa hydrogels54,55). Vad beträffar patogener är, vissa bakterier (t.ex., Borrelia burdgorferi) kan fästa värd celler och invaderar dem men kan också transmigrate genom dem56. Vi har inte ännu testat om denna analys skulle fungera för patogen själavandring studier, men det verkar möjligt eftersom tidigare studier på neutrofiler transmigrating endothelial celler seedade på PA hydrogeler har dokumenterats för att arbeta framgångsrikt57. Det har varit en hel del studier visar hur man tillverkar polyakrylamid hydrogeler av en given Youngs modul genom att blanda lämpliga koncentrationerna av akrylamid och bis-akrylamid24,25,26 ,27. Det är dock särskilt när man önskar utföra TFM experiment på celler som bor på hydrogels varierande styvhet, kritiska att bekräfta förväntade styvheten i hydrogels antingen via AFM eller andra indrag tekniker58. Små avvikelser från det förväntade värdet kan uppstå på grund av olika lösningsmedel används eller en år akrylamid stamlösning, eller på sätt AFM är mätningar utförs (t.ex., formen på AFM spets). Slutligen är den strategi som presenteras häri baserad på sådd värdceller på 2D matriser, som kan skilja sig från en mer realistisk och fysiologiskt relevanta 3D scenario. Tillverkning 3D geler med avstämbara stelhet, omfattar sådd dem med värdceller och sedan smittar dem med patogener, fortfarande emellertid vissa tekniska svårigheter. Ändå, vi räknar med att inom en snar framtid kommer vi att kunna utöka den aktuella analysen för att studera infektion i en 3D miljö.
Sammanfattningsvis beskrivs protokollet tillsammans med de preliminära resultaten bevisa att denna roman analys kan bli ett mycket användbart verktyg för att studera infektion av vidhäftande värdceller med patogena bakterier på ett kvantitativt sätt och i en mycket mer fysiologiskt relevant miljö än tidigare undersökta. Kraften i fabricera polyakrylamid hydrogels i föreslagna setup ligger i att analysen är kompatibel med utförandet av flera tekniker såsom flödescytometri, immunfärgning följt av ljusmikroskopi och dragkraft tvinga mikroskopi. Analysen kan användas för studier med infektion av annan vidhäftande värd celltyper av patogener, som vi räknar med kommer att ha en betydande inverkan på både nysta upp strategier som patogener infektera värdar och underlätta utvecklingen av Terapeutiska interventioner mot infektioner.

Celler i mest djurvävnader är vanligtvis vidhäftande, bifoga både till angränsande celler och deras extracellulär matrix (ECM). Ankringen av celler till sin ECM är avgörande för många cellulära processer som sträcker sig från cell motilitet till cell spridning och överlevnad1,2. Cellulära förankringar till ECM beror både på ECM sammansättning och stelhet. Cellerna reagera på förändringar i den senare av dynamiskt omarrangera sin cytoskelettet, cell-ECM och cell-cell sammanväxningar, vilka i sin tur kritiskt förändrar cell biomekanik och funktioner3,4,5,6 . ECM stelhet kan variera i rymden (dvs, anatomiska läge), i tid (dvs, åldrande) och patofysiologiska processer (t.ex., åderförkalkning, cancer, infektioner, etc.). Exempelvis är det allmänt accepterat att endothelial celler bosatt på styvare-jämfört med mjukare-matriser utöva ökade krafter till sin ECM och till varandra och uppvisar ökad motilitet och spridning7,8. Jämväl, fibroblaster bosatta på styvare matriser förmedla hög kontraktila krafter till sin ECM och Visa ökad spridning, motilitet och ECM produktion9,10,11. Även om cellen mekanik och svar på ECM stelhet har studerats ingående för olika celltyper, förhållandet mellan vidhäftande värdceller, är styvheten i sin ECM, och bakteriella infektioner fortfarande till stor del okända.
För att studera rollen av ECM stelhet i bakterier-värd-cell interaktioner, valdes L. monocytogenes (Lm) som patogenen som modell. LM är en allestädes närvarande livsmedelsburna bakterie som kan orsaka systemisk infektion i en mängd olika däggdjur värdar. Detta fakultativt intracellulära patogener kan flytta från intestinala epitelet till avlägsna organ genom att gå igenom olika typer av vaskulär endothelia. Om det bryter mot den blood - brain barriären, Lm kan orsaka hjärnhinneinflammation, och när den passerar moderkakan, kan det orsaka spontan abort12,13. LM kan infektera annan värd celltyper och kan göra det genom att använda olika patogena strategier. LM-infektion har undersökts främst i samband med epitelceller, medan mycket mindre är känt om hur Lm kan infektera och bypass endothelial celler som kantar lumen blodkärl14,15,16. Dessutom är det fortfarande till stor del okänt hur styvheten i ECM där endotelceller bosatta modulerar Lm: s förmåga att invadera dessa värdceller och sedan sprida. LM och flera ytterligare bakteriearter (dvs, Rickettsia parkeri) dra nytta av aktin cytoskelettet värdens celler de infektera både invadera i cytoplasman och underlätta cell till cell spridning17 , 18 , 19. de uppnå detta genom uttrycket av proteiner som möjligt för dem att störa värd aktin polymerisation vägar och att producera aktin komet svansar som underlättar deras framåt framdrivning16,20. Till följd av infektion behöver värdcellens aktin cytoskelettet dynamiskt ordna på ett sätt som är fortfarande inte helt kännetecknas, som potentiellt påverkar biomekanik av vara värdcellerna inklusive de fysiska krafterna som de utövar på sin ECM och på varje andra. För att undersöka dessa processer, mänskliga mikrovaskulära endotelceller (HMEC-1) valdes som modell värdceller av tre skäl: 1. endotelceller är kända för att vara mycket mechanosensitive som de utsätts ständigt för olika fysiska ledtrådar21; 2. de strategier som Lm sysselsätter för att infektera endotelceller är fortfarande till stor del okända22; och 3. HMEC-1 kan är en förevigade cellinje och, därför, lätt odlade och utsatts för genetisk manipulation.
Bakteriell infektion i värdceller har mestadels varit studerade in vitro- genom sådd celler på glas eller polystyren substrat som är betydligt styvare än fysiologiska ECM av de flesta celler12,14,23. Att undersöka infektionen av celler som dirigeras till en matris vars stelhet är fysiologiskt relevanta och att klargöra rollen av ECM stelhet på infektionen av celler av bakteriella patogener, följde vi en nyskapande strategi baserad på tillverka tunna microbead-embedded polyakrylamid hydrogels avstämbara styvhet på plattor med flera. Nya i det föreslagna tillvägagångssättet ligger i att det tillåter övervakning flera villkor samtidigt på grund av dess flera format och att den är kompatibel med flera tekniker beroende på det särskilda sätt som substratesna byggs. HMEC-1 celler seedade på dessa protein-belagd hydrogels och sedan infekterade med olika Lm stammar som antingen blir fluorescerande vid internalisering eller är konstitutivt fluorescerande. Rollen av ECM stelhet på infektion känslighet av HMEC-1 värdceller utvärderades av flödescytometri. Dessutom användes immunfärgning och fluorescence mikroskopi för att skilja mellan vidhängande och internaliserad bakterier. Slutligen utfördes framgångsrikt dragkraft Force Microscopy (TFM) för att karakterisera effekten av Lm infektion på dragkraft betonar att värd endotelceller utövar på deras matriser under infektion. Presenterade analysen kan enkelt ändras för att möjliggöra ytterligare studier på effekten av ECM stelhet på infektion känslighet av vidhäftande celler med olika cellinjer eller patogener.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:831px;" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Reagents</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:151px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25% gluteraldehyde</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bis-acrylamide solution (2%w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP1404-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP17925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TEMED</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td style="width:151px;">c1111-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Collagen, Type I Solution from rat</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEPES, Free acid</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">4018-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Leibovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Medium, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:151px;">10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td>
			<td>Gemini Bio-Prod</td>
			<td>900108 500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS 1X</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>194530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cloramphenicol</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DifcoTM Agar, Granulated</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL TM Brain-heart infusion</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 16% EM grade</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab35132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 546 conjugate</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% trypsin-EDTA , phenol red</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">3810-74-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td style="width:149px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:151px;">8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:149px;">Thermofischer</td>
			<td>28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MES powder</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">3040-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td style="width:149px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:151px;">2444-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td style="width:149px;">Acros</td>
			<td style="width:151px;">40991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">12 mm circular glass coverslips</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12-545-81</td>
			<td>No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass bottom 24 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Mattek</td>
			<td style="width:151px;">P24G-1.5-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml polystyrene tubes with a 35 &#956;m cell strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">15 ml conicals tubes</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Tips (1-200 &#956;l, 101-1000 &#956;l)</td>
			<td style="width:149px;">Denville</td>
			<td style="width:151px;">P1122, P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:149px;">Microflex</td>
			<td style="width:151px;">XC-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cuvettes bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Razors</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um sterilizng bottles</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">20 ml syringes</td>
			<td style="width:149px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.2um filters</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">wooden sticks</td>
			<td style="width:149px;">Grainger</td>
			<td>42181501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Saran wrap</td>
			<td style="width:149px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:151px;">sc-3687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plates bacteria</td>
			<td style="width:149px;">Falcon</td>
			<td style="width:151px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:149px;">Baker</td>
			<td style="width:151px;">SG504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IGS180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tissue culture Incubator</td>
			<td style="width:149px;">NuAire</td>
			<td style="width:151px;">NU-8700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:149px;">Belart</td>
			<td style="width:151px;">42025</td>
			<td>37&#730;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td>
			<td style="width:149px;">Nikon</td>
			<td>NIKON-DIAPHOT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cage Incubator</td>
			<td style="width:149px;">Haison</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanford FACScan analyzer&#160;</td>
			<td>Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td style="width:151px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:149px;">Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Pipettors (10 &#956;l, 200 &#956;l, 1000ul)</td>
			<td style="width:149px;">Gilson</td>
			<td colspan="2">F144802, F123601, F123602</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pH meter</td>
			<td style="width:149px;">Mettler Toledo</td>
			<td>30019028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">forceps</td>
			<td style="width:149px;">FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1 L flask</td>
			<td style="width:149px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB5011000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Autoclave machine</td>
			<td style="width:149px;">Amsco</td>
			<td style="width:151px;">3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Stir magnet plate</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>7760-06000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Magnet stirring bars</td>
			<td style="width:149px;">Bellco</td>
			<td>1975-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:149px;">Beckman</td>
			<td style="width:151px;">DU 640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Scanford FACScan analyzer</td>
			<td style="width:149px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:151px;">Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Software</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscope Software (&#956;Manager)</td>
			<td style="width:149px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Matlab</td>
			<td style="width:149px;">Matlab Inc</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flowjo</td>
			<td style="width:149px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:355px;">Automated image analysis software, CellC</td>
			<td style="width:149px;">https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-well format polyacrylamide-based assay for studying the effect of extracellular matrix stiffness on the bacterial infection of adherent cells

Extracellulär matrix stelhet består av en av de flera mekaniska stimuli från omgivningen som är kända att påverka cellulära beteende, funktion och öde i allmänhet. Även om allt mer vidhäftande celltyper Svaren till matrix stelhet har karaktäriserats, hur cellernas känslighet för bakteriell infektion beror på matrix stelhet är till stor del okända, som är effekten av bakteriell infektion på den biomekanik av värdceller. Vi hypotes att mottagligheten för värd endothelial celler till en bakteriell infektion beror på styvheten i matrisen där dessa celler finns, och att infektionen värdens celler med bakterier kommer att förändra deras biomekanik. För att testa dessa två hypoteser, användes endotelceller som modell värdar och Listeria monocytogenes som en modell patogen. Genom att utveckla en roman flera format assay, visar vi att effekten av matrix stelhet på infektion av endothelial celler av L. monocytogenes kan bedömas kvantitativt genom flödescytometri och immunfärgning följt av mikroskopi. Dessutom kan använder dragkraft kraft mikroskopi, effekten av L. monocytogenes infektion på värd endotelceller biomekanik studeras. Den föreslagna metoden möjliggör analys av effekten av vävnad-relevanta mekanik på bakteriell infektion av vidhäftande celler, som är ett viktigt steg mot att förstå de biomekaniska interaktioner mellan celler, deras extracellular matris, och patogena bakterier. Denna metod är också tillämplig på en mängd andra typer av studier på cell biomekanik och svar på substrat stelhet där det är viktigt för att kunna utföra många replikat parallellt i varje experiment.

ECM stelhet-beroende infektionskänslighet HMEC-1 celler Lm: PA hydrogels varierande styvhet, alla bestrukna med kollagen jag, byggdes på flera glas botten pläterar som beskrivs i steg 1 i protokollet (se figur 1). AFM mätningar utfördes för att bekräfta exakta styvheten i hydrogels, som tidigare beskrivits26,27 (se figur 2). Tidigare studier har visat att de lokala efterlevnaden av basalmembranet av endothelial celler kan variera från 1 kPa (t.ex., hjärnvävnad) till 70 kPa (t.ex., aorta)36,37,38, 39 , 40. därför valde vi att testa infektion av HMEC-1 celler bosatt på matriser med följande styvheten: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa och 70 kPa. För varje hydrogel stelhet, var sex hydrogels fabricerade för att bedöma reproducerbarheten för resultaten.
Flödescytometri användes för att bedöma den ECM stelhet-beroende infektionskänslighet HMEC-1 celler Lm (se figur 3). HMEC-1 celler var infekterade med en Lm stam (JAT985) som uttrycker en fluorescerande markör efter internalisering (actAp::mTagRFP), möjliggör upptäckt av intracellulära bakterier bara (se figurerna 1 L - 1N). JAT985 saknar också ActA, inaktivera bakterier från att sprida sig från cell till cell, eftersom ActA är nödvändig för bildandet av aktin komet svansar och efterföljande bakteriell spridning. 7 - 8 h efter infektion, HMEC-1 cellernas infektion bedömdes med hjälp av flödescytometri. För att säkerställa att analysen av enstaka celler, var huvuddelen av distributionen av blodkroppar gated använder framåt kontra sida spridningsdiagram och sedan en andra Usenets steg utfördes för att utesluta celler som uppvisar autofluorescens (se figurerna 3A - 3 C ). De preliminära resultaten som avbildas i figur 3 visar att HMEC-1-infektion med Lm är cirka två gånger större för HMEC-1 celler som finns på de stela 70 kPa hydrogels jämfört med celler som finns på de mjuka 0,6 kPa hydrogels (se siffrorna 3B - 3D). ökad Lm infektion känsligheten för HMEC-1 celler bosatt på stiff jämfört med mjuk matriser kan bero på: 1. ökade Lm vidhäftning på HMEC-1; 2. ökad Lm invasion in HMEC-1; eller 3. båda de ovanstående samarbete förekommer. För att testa vilken hypotes håller, HMEC-1 celler seedade på mjuk (3 kPa) och stel (70 kPa) hydrogels och infekterade med konstitutivt GFP uttrycker Lm (se figurerna 4A - 4 C). Proverna var fast strax efter infektion och externa (självhäftande) bakterier var fläckade av antikroppar. Med kvantitativ mikroskopi, upptäckte vi att det finns betydligt fler bakterier följa HMEC-1 när värdcellerna finnas på stiff jämfört med mjuka geler (se figur 4D). Konsekvent med flöde flödescytometri data, det finns betydligt mer bakterier internaliseras av HMEC-1 när värdcellerna finnas på stiff jämfört med mjuka geler (se figur 4E). Men invasionen effektivitet (bakterier internaliserat/totalt antal bakterier) Lm i HMEC-1 celler är liknande, oavsett substrat stelhet (se figur 4F).
Dragkraft kraft mikroskopi av Lm-infekterade HMEC-1 celler: LM infektion av HMEC-1 celler kunde ändra biomekanik av infekterade värdceller, inklusive fastsättning till sin ECM eller till varje annan, som påverkar deras barriär integritet. Vi försökte utvärdera huruvida det skulle kunna vara fallet med dragkraft Force Microscopy32 att beräkna de cell-ECM dragkraft krafter och enskiktslager Stress mikroskopi41 att beräkna de intracellulära spännan krafterna. Figur 5 illustrerar kartor av deformation fältet, dragkraft stress fält och intracellulära spänningar inom HMEC-1 celler som finns på 20-kPa hydrogels vid olika tid punkter efter infektion. Siffror 5A - 5 D hänvisar till oinfekterade kontroll HMEC-1 celler medan siffrorna 5E - 5 H referera till HMEC-1 celler infekterade med Lm vid en multiplicity av infektion lika med 300 bakterier per cell. Detta förarbete antyder att infekterade HMEC-1 celler minska omfattningen av deras cell-ECM och intracellulära betonar under loppet av en infektion med Lm, medan det är inte för oinfekterade kontroll celler.
ECM stelhet-beroende Lm spridning över HMEC-1 enskiktslager: Time-lapse mikroskopi användes för att undersöka effekten matrix stelhet har på Lm spridning genom HMEC-1 enskiktslager. Eftersom Lm sprids genom enskiktslager, skapa bakterier fokus av infektion som växer som en funktion av tiden (se figur 6A och Video siffrorna 1 och 2). Den infektion fokusområdet mättes genom att rita en konvex skrov, de minsta konvexa polygon som omfattar en uppsättning punkter, runt de bakterier42. Det finns ingen standard metriska i fältet för att mäta effektiviteten av L. monocytogenes cell till cell spridning genom en enskiktslager av värdceller. För att bedöma spridning effektivitet, några har räknat antalet värdceller i en infektion fokus41, medan andra har dragit gränser manuellt runt gruppen av infektion värd celler43. Vi valde att rita en konvex polygon runt bakterier, eftersom det är en automatiserad, konsekvent och beräkningsmässigt billiga process att mäta effektiviteten av L. monocytogenes spridning. Så hittade vi en liten minskning infektion fokusområdet i HMEC-1 celler seedade på 70 kPa hydrogels jämfört med de seedade på 3 kPa matriser (se figur 6B och Video siffrorna 1 och 2). För att avgöra tillväxttakten av infektion fokus, var det radiella avståndet ritas som en funktion av tiden genom att ta kvadratroten av den infektion fokusområdet och dividera detta med pi. Denna matematiska omvandling förutsätter att formen på infektion fokus är ungefär cirkulär44. För att mäta hastigheten på fokus tillväxten, mättes förändringstakten (dvs, lutningen) av det radiella avståndet för både 3 - och 70-kPa matriser. Detta tillvägagångssätt klarlagd att infektion fokus växte snabbare och monotont i HMEC-1 celler seedade på 3-kPa matriser. I fokus ökade dock betydligt långsammare (första 200 min) och något långsammare (200 till 600 min) i celler seedade på 70-kPa matriser (se figur 6C). Faktiskt, analys av ytterligare uppgifter bekräftade att infektion fokus växte, i genomsnitt två gånger långsammare i 70-kPa matriser, särskilt under de första 200 min (se figur 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> Figur 3 : ECM stelhet-beroende känslighet HMEC-1 celler för Lm invasionen mätt med hjälp av flödescytometri .  HMEC-1 celler var infekterade med Lm (JAT985) och infektionen var analyseras med flödescytometri. A. i denna panel visas en sida kontra framåt spridningsdiagram för representativa HMEC-1 celler kommer från en enda brunn. Bulk fördelningen av celler valdes via gating för att utesluta skräp (vänster) och cell midjekort jacka eller trillingar (höger). B. Detta diagram visar ett histogram över logaritmen av Lm fluorescensintensiteten per cell för HMEC-1 förkromad på mjuk 0,6 kPa. C. denna graf visar ett histogram över logaritmen av Lm fluorescensintensiteten per cell för HMEC-1 förkromad på styvt 70 kPa hydrogels. Histogram för N = 4-6 replikat visas i olika färger. Kontroll infekterade cellernas histogram är lila. Porten används för att definiera vad är infekterad visas i rött. MOI är 100 och infektionen var bedömda 8 h efter infektion. D. Data visar andelen infekterade HMEC-1 celler kontra hydrogel stelhet (N = 5). De vågräta strecken skildra data betyder. P-värde beräknades med icke-parametriska Wilcoxon Rank Sum test. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> Video figur 1: spridning av intracellulära Lm (röd kanal) genom en HMEC-1 cell enskiktslager (fas) dirigeras till en 3-kPa substrat. Cellerna var avbildade i Leibovitzs l-15 media (10% FBS, 20 µg/mL gentamicin) inuti en klimatkammare jämviktas till 37 ˚C. Bilderna samlades varje 5 min. Filmen är 15 bildrutor/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> Video figur 2: spridning av intracellulära Lm (röd kanal) genom en HMEC-1 cell enskiktslager (fas) dirigeras till en 70-kPa substrat. Cellerna var avbildade i Leibovitzs l-15 media (10% FBS, 20 µg/mL gentamicin) inuti en klimatkammare jämviktas till 37 ° C. Bilderna samlades varje 5 min. Filmen är 15 bildrutor/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Youngs modul (E, kPa)</td>
			<td>Akrylamid % (från 40% lager)</td>
			<td>Bisacrylamide % (från 2% lager)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,6</td>
			<td>3</td>
			<td>0,045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0.195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
</tbody></table> Tabell 1. Sammansättningen av polyakrylamid (PA) hydrogels varierande styvhet. i den här tabellen andelen lager 40% akrylamid lösning och andelen stamlösning 2% bis-akrylamid att uppnå en viss stelhet (Youngs modul, E) anges i olika kolumner.
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> Kompletterande Material 1. Uträkningen av intracellulära spänning från Beräknad dragkraft påfrestningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells at JoVE.

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Vi har utvecklat en flera format polyakrylamid-baserad analys för avsökning av effekten av extracellulärmatrix stelhet på bakteriell infektion av vidhäftande celler. Denna analys är kompatibel med flödescytometri, immunfärgning och dragkraft kraft mikroskopi, möjliggör kvantitativa mätningar av biomekaniska interaktioner mellan celler, deras extracellular matris och patogena bakterier.

En flera Format polyakrylamid-baserad analys för att studera effekten av extracellulärmatrix stelhet på bakteriell infektion av vidhäftande celler

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Efter Cell-öde i<em&gt; E. E. coli</em&gt; Efter infektion av fag lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

En visuell analys för att övervaka T6SS-medierad bakteriell konkurrens

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Använda klicka kemi för att mäta effekten av virusinfektion på Host-cell RNA-syntes

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersöka effekterna av probiotika på Pneumococcal Colonization Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adherensanalysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysera effekterna av stromaceller celler på rekrytering av leukocyter från Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Genomförande av ett permeabelt membran Insert-baserade Infection System för att studera effekterna av utsöndrade bakteriella toxiner på däggdjursvärdceller

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Analyser för studerar roll för Aktiebolaget Trav &amp; galopp i bakteriell vidhäftning och Serum motstånd

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilatation av isolerade fartyg och isolering av den extracellulära matrisen av Tight-skin Möss

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Protokoll för att undersöka värdvävnads Distribution, Transmission-mode, och påverkan på värd Fitness av ett Densovirus i Cotton bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...