Name: recombinant collagen i peptide microcarriers for cell expansion and their potential use as cell delivery system in a bioreactor model
Uploaded: 2018-02-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model at JoVE.com

המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מן האיחוד האירופי השביעי מסגרת תכנית האיחוד FP7/2007-2013 תחת גרנט הסכם n ° 607051 (ביו-השראה). אנו מודים וקרולין מדריכים סיורים במתחם ואן Spreuwel-גוסנס של Fujifilm ייצור Europe B.V., לקבלת סיוע טכני במהלך הייצור RCP, ורנר סטרקה ממוסד פראונהופר עבור סיליקט מחקר ISC, לקבלת סיוע בניתוח SEM.

hBMSCs הם בודדו אותנו מהמתרחש בראש עצם הירך של דלקת מפרקים ניוונית חולים שעברו ניתוח להחלפת ראש עצם הירך. ההליך בוצע תחת האישור של ועדת האתיקה המקומית של האוניברסיטה של וירצבורג, הסכמה מדעת של החולים. ראשי תאי אנדותל microvascular הם בודדו אותנו מהמתרחש העורלה ביופסיות של תורמים לנוער. Representative(s) המ?...

<ol>
	<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+present,+and+future+of+microcarrier-based+tissue+engineering.">Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering.</a> Journal of Orthopaedic. 3 (2), 51-57 (2015).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+solid+and+porous+microcarriers+for+cell+growth+and+production+of+recombinant+proteins.">Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins.</a> Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).</li><li>Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical,+Spatial,+and+Molecular+Aspects+of+Extracellular+Matrix+of+In+Vivo+Niches+and+Artificial+Scaffolds+Relevant+to+Stem+Cells+Research.">Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research.</a> Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).</li><li>Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+aggregates+of+mesenchymal+stem+cells:+cellular+mechanisms,+biological+properties,+and+applications.">Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications.</a> Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).</li><li>Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+in+3D+is+never+flat:+3D+models+to+optimise+drug+delivery.">Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).</li><li>Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+serum-free+microcarrier+expansion+of+mesenchymal+stromal+cells:+Parameters+to+be+optimized.">Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).</li><li>de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+microcarrier-based+manufacturing+of+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells.</a> J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).</li><li>Schop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+human+mesenchymal+stromal+cells+on+microcarriers:+growth+and+metabolism.">Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism.</a> J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).</li><li>Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xeno-free+microcarrier-based+stirred+culture+system+for+the+scalable+expansion+of+human+mesenchymal+stem/stromal+cells+isolated+from+bone+marrow+and+adipose+tissue.">A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue.</a> Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).</li><li>Malda, J., Frondoza, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarriers+in+the+engineering+of+cartilage+and+bone.">Microcarriers in the engineering of cartilage and bone.</a> Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).</li><li>Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy:+achievements+and+future+direction.">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction.</a> Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).</li><li>Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Injectable+Recombinant+Collagen+I+Peptide-Based+Macroporous+Microcarrier+Allows+Superior+Expansion+of+C2C12+and+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+and+Supports+Deposition+of+Mineralized+Matrix.">An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix.</a> Tissue Eng Part A. , (2017).</li><li>Davidenko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+crosslinking+for+tailoring+collagen-based+scaffolds+stability+and+mechanics.">Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics.</a> Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).</li><li>Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+culture+on+porous+biopolymer+microcarriers+in+a+spinner+flask+for+bone+tissue+engineering:+a+feasibility+study.">Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study.</a> Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).</li><li>Bae, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Vascular+Networks.">Building Vascular Networks.</a> Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).</li><li>Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+and+bone+regeneration+in+a+critical+sized+defect+using+2-N,+6-O-sulfated+chitosan+nanoparticles+incorporating+BMP-2.">Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2.</a> Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).</li><li>Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering.">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).</li><li>Cartmell, S. H., Porter, B. D., Garc&#237;a, A. J., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medium+perfusion+on+cell-seeded+three-dimensional+bone+constructs+in+vitro.">Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro.</a> Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).</li><li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularised+human+tissue+models:+a+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research.">Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research.</a> Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).</li><li>Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Sch&#252;tze, K., Walles, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+3D+human+airway+mucosa+model+based+on+a+SIS+scaffold.">An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold.</a> Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).</li><li>Moll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Engineering+of+a+Human+3D+in+vitro+Tumor+Test+System.">Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System.</a> J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).</li><li>Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioreactor+system+for+interfacial+culture+and+physiological+perfusion+of+vascularized+tissue+equivalents.">A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents.</a> Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).</li><li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+and+endothelial+cells.">Blood vessels and endothelial cells.</a> Molecular Biology of the Cells. , (2002).</li><li>Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+view+of+blood+vessel+growth+and+remodeling.">A systems biology view of blood vessel growth and remodeling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).</li><li>Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., M&#252;nst, B., Braspenning, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upcyte&#174;+Microvascular+endothelial+cells+repopulate+decellularized+scaffold.">Upcyte&#174; Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).</li><li>Nietzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+Metastases+Including+Tumor+Stroma:+A+New+Technique+to+Generate+a+Three-Dimensional+Colorectal+Cancer+Model+Based+on+a+Biological+Decellularized+Intestinal+Scaffold.">Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).</li><li>G&#246;ttlich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combined+3D+Tissue+Engineered+In+Vitro/In+Silico+Lung+Tumor+Model+for+Predicting+Drug+Effectiveness+in+Specific+Mutational+Backgrounds.">A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds.</a> J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).</li><li>Stratmann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+human+3D+lung+cancer+model+based+on+a+biological+tissue+matrix+combined+with+a+Boolean+in+silico+model.">Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model.</a> Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).</li><li>Groeber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+first+vascularized+skin+equivalent+for+as+an+alternative+to+animal+experimentation.">A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation.</a> Altex. 33 (4), 415-422 (2016).</li><li>Plunkett, N., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactors+in+tissue+engineering.">Bioreactors in tissue engineering.</a> Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).</li><li>Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potentially+scalable+method+for+the+harvesting+of+hMSCs+from+microcarriers.">A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers.</a> Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).</li></ol>

אחת המטרה העיקרית של microcarrier היא ההרחבה של תאים תוך שמירה על בידול שלהם על מנת להעביר תאים במקום הצורך. השיטה מייצגים מציגים RCP microcarriers שבו התאים היו מסוגלים לצרף להתרבות, ליישב את microcarriers עם צפיפות גבוהה התא. זה נצפתה על ידי חי/מת מכתים, שבו התגלו יותר מ 90% מכלל התאים קיימא ואילו רק כמה תאים מת?...

בעיה כללית אחת ביישומים הנדסת רקמות היא להניב מסה גבוהה תא עם פנוטיפ בידול הנכון במיקום של צריכה. היישום של microcarriers כדי לטפל בבעיה זו החלה בשנת 1967 עם הגדלת חשיבות לתאריך בתחומים כגון: הנדסת רקמות אורתופדי לייצור בקנה מידה גדול של עור, עצם, סחוס, גידים1. הם מאפשרים את הטיפול של תרבויות חסיד בדרכים דומה לזה של הבולם תרבויות2 על ידי הרחבת לתאים microscale תלת מימד (3D) סובסטרטים. ובכך התאים חווים היצע מזין הומוגנית ואינטראקציות תא מטריצה להוביל תחזוקה טובה יותר של ויוו3,בידול4 אשר לעיתים קרובות שאבדו עם הזמן בדו מימד מתקרב5. יחס גבוה יותר של השטח לבנפח - המוביל בסופו של דבר גבוה יותר תא התשואות6,7, גבוה יותר גז ושערי חליפין מזין השוואת מערכות סטטיות8, האפשרות לווסת ולהוריד נושא התרבות הפיזית גירויים9, ואת הפוטנציאל אולם שינוי קנה המידה של תהליך הרחבת7 הם עוד יתרונות. מספר תכונות כגון קוטר, צפיפות, נקבוביות, תשלום משטח הדבקה מאפיינים10,11 להבחין את שונים זמינים מסחרית מיקרו, מאקרו-מנושאות המטוסים שלו. עם זאת, אחד היתרון העיקרי הוא משלוח שלהם פוטנציאל microtissues האתר פגם או דרישה.
עבור יישומים של טכנולוגיית microcarrier בהנדסת רקמות העצם, אנחנו מאויר הדוח הקודם12 הייצור של microcarrier החדש סוג היוו של קולגן רקומביננטי אני פפטיד (RCP, זמינים מסחרית כמו Cellnest). Microcarrier חדש זה מאפשר את GMP התואם את קנה המידה של ההפקה בפיגומים ותא, כנדרש לצורך מסירה תאים תרחיש קליני. בהקשר זה, כוונון של יציבות לגרדום, השפלה קצב ומאפיינים השטח באמצעות בחירה נכונה של אסטרטגיה מתאימה crosslinking מאפשר להתאים את הטכניקה כדי היישום שנבחר, תא סוג של ריבית או היעד רקמת13. בפרט, פוטנציאל להעסקת הזה microcarrier כמערכת משלוח תא להזרקה עבור יישום טיפולי14 גורם להם מעניין במיוחד בסביבה קלינית.
בנייר זה, אנחנו ולכן להמחיש את ההליך culturing הבידוד והרחבה של מח עצם, נגזר mesenchymal סטרומה תאים אנושיים (hBMSCs) ואת עורי microvascular אנדותל תאים אנושיים (HDMECs) על קולגן-אני מבוססי רקומביננטי microcarriers מבוססת על פפטיד, והכנתן למסירה בסביבה קלינית. יתר על כן, אנו מתארים פרוטוקולים נוספים שימושי לשם קיום התא הכדאיות על ההשתלה.
תא הכדאיות לאחר ההשתלה הוא למעשה תלויה בחום vascularization15,16,17, אשר מבטיחה חילופי חמצן וחומרים מזינים ואסטמה ומקילה על פינוי פסולת. אינקובטורים-מטלטל סיבובי מהווים גישה אחת להתגבר על אתגרים vascularization בהנדסת רקמות ולשמור על יכולת הקיום של התא, דרך זלוף בינוני תרבות ובכך מתן חמצן וחומרים מזינים18. כאן, אנו ממחישים שיטה במבחנה כדי להעריך את יכולת העברה של תאים אנדותל microvascular microcarriers RCP biomatrix ואת יכולתם לתרום vascularization דה נובו ואת אנגיוגנזה. Biomatrix הזה הוא קטע מעי צם חזירי decellularized הנקרא BioVaSc (ביולוגי Vascularized לגרדום), עשיר קולגן ואלסטין, עם לשימור מבנים כלי דם, אשר כולל עורק האכלה, המנקזים את הווריד19 כי כבר להחיל עבור בעיות השרשה20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT)</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH</td>
			<td>20395.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid 100%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>533,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance Kern EG 2200-2NM</td>
			<td>Kern &#38; Sohn GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor</td>
			<td>Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope Axiovert 40C</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellnest</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R solution 0,4%</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH</td>
			<td>47254.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin 1%</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>10177.01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T171.4</td>
			<td>Denatured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Bio&#38;SELL</td>
			<td>FCS.ADD.0500</td>
			<td>not heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope BZ-9000</td>
			<td>Keyence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>10231.01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Reagent grade, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator for bioreactor</td>
			<td>Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Cell Double Staining Kit</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>04511KT-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer plate</td>
			<td>2Mag</td>
			<td>80002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0650</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader 
			Tecan Infinite M200</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 21G 16mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-5389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762</td>
			<td>lyophilized powder, &#8805; 10 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6642.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histofix 4%</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope Supra 25</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner flasks (25 mL)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>356879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2)</td>
			<td>TPP Techno Plastik Products AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF-Mv</td>
			<td>Lifeline cell technology</td>
			<td>LL-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombinant collagen i peptide microcarriers for cell expansion and their potential use as cell delivery system in a bioreactor model

הנדסת רקמות הינו תחום מבטיח, התמקדו בפיתוח פתרונות עבור הביקוש הגובר על רקמות ואיברים בנוגע למטרות השתלת. התהליך ליצירת רקמות אלה הינו מורכב, וכולל שילוב של סוגי תאים ספציפיים, פיגומים לגירויים פיזיים או ביוכימי כדי להנחות צמיחת תאים ובידול. Microcarriers מייצגים כלי מושך כדי להרחיב את התאים microenvironment תלת מימד (3D), מאז הם לספק גבוה משטח-יחסי נפח ומחקים באופן הדוק יותר המצב ויוו לעומת שיטות מסורתיות דו-ממדית. מערכת כלי הדם, הספקת חמצן וחומרים מזינים לתאי ולהבטיח פינוי פסולת, מהווה את אבן בניין חשובה בעת יצירת רקמות מהונדסים. למעשה, רוב המבנים להיכשל לאחר להיות מושתל עקב חסר תמיכה בכלי הדם. במחקר זה, אנו מציגים את פרוטוקול להרחבת תא אנדותל על microcarriers מבוססי קולגן רקומביננטי בתנאים דינמיים טווה את הבקבוק, ריאקטורים, נסביר כיצד לקבוע את הגדרת תא הכדאיות ופונקציונליות. בנוסף, אנו מציעים שיטה למסירה תא למטרות vascularization ללא ניתוק נוספים השלבים הנחוצים. יתר על כן, אנו מספקים אסטרטגיה כדי להעריך vascularization תא פוטנציאליים ב זלוף מגיב ביולוגי על מטריצה ביולוגי decellularized. אנו מאמינים כי השימוש בשיטות שהוצגו יכול להוביל לפיתוח טיפולים חדשים מבוססי תאים עבור מגוון גדול של רקמות יישומי בתרגול קליני הנדסה.

כפי שמוצג באיור 1A, השגנו מספר גבוה של התאים קיימא על microcarriers RCP לאחר 7 ימים של תרבות, נקבע על ידי צביעת חי/מת. תוצאות אלה שאושרו על-ידי ניתוח SEM, שבה נצפו microcarriers לחלוטין להפקר סביב הנקבוביות, חלקית overgrowing אותם (איור 1B). מצד שני, ניסויים שבהם התאי?...

Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model at JoVE.com

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

קולגן רקומביננטי אני Microcarriers פפטיד עבור הרחבת התא והשתמש פוטנציאלי שלהם כמערכת מסירה תאים במגיב ביולוגי מדגמן

אנו מציעים הרחבה תא פרוטוקול על macroporous microcarriers ואת השימוש בהם כמערכת משלוח ב זלוף מגיב ביולוגי כדי להפיץ מטריצה רקמות decellularized. אנו גם כוללים טכניקות שונות כדי לקבוע התפשטות תאים ואת הכדאיות של תאים תרבותי על microcarriers. יתר על כן, נדגים את הפונקציונליות של התאים לאחר ביוריאקטור תרבויות.

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

The overall goal of this procedure is to expand the cells on a high available surface area and to further deliver these cells to sites of defect or demand for clinical applications. This method can help answer key questions in the tissue engineering field, such as cell expansion, cell delivery, and vascularization. The main advantage of this technique is that we can expand the cells and deliver them, without any harvesting step, into defect sites, in a biocompatible way.Visual demonstration of this method is critical, as working microcarriers and bioreactors can be complicated, at first, due to the many steps involved. Helping with the procedure will be Jihyoung Choi, a PhD student from our laboratory. One day before the experiments, set up the spinner flasks and prepare them for sterilization by autoclave.Wrap the spinner flasks with aluminum foil around the side caps separately to avoid contamination during unwrapping. Wrap the flasks with one to two layers of aluminum foil for autoclaving to minimize contamination risks after sterilization. Leave the caps of the spinner flasks loose and when possible, sterilize them in an upright position.Next, weigh the required amount of RCP macroporous microcarriers in 20 milliliters of Dulbecco's phosphate buffered saline. Let them hydrate for at least one hour before heat sterilization by autoclave. Use the bioreactor system referenced in text protocol to produce vascularized tissue equivalents.This bioreactor consists of a vessel in which the biomatrix is placed, a medium reservoir, and a pressure bottle. Connect the vessel with the medium reservoir and the pressure bottle through silicone tubes. Leave the caps loose and place the system in an autoclave plastic bag.Close the bag well and place this in a second autoclave plastic bag before sterilizing by autoclave. Let the sterilized RCP macroporous microcarriers settle to the bottom and wash them with 10 milliliters of culture medium. Repeat this process three times.Also wash the spinner flasks with 10 milliliters of culture medium. Next, add 30 milligrams of RCP macroporous microcarriers per spinner flask in eight milliliters of culture medium. Equilibrate the spinner flasks RCP macroporous microcarriers at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for 30 minutes before seeding the cells.Then, seed half a million human bone marrow derived mesenchymal stromal cells, or human dermal microvascular endothelial cells per spinner flask in two milliliters of culture medium. Place the spinner flasks on a stirrer plate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide and start stirring at 90rpm for five minutes. Then, rest for 55 minutes for a total of one hour static dynamic incubation.Repeat this incubation cycle four times. Now, add 10 milliliters of cell culture medium per spinner flask. Then start continuous stirring at 95rpm while incubating at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.One day before starting the bioreactor cultures, cut open the biomatrix longitudinally on the antimesenteric side and fix it in a previously disinfected polycarbonate frame. After detaching and counting the cells, use a two milliliter syringe to inject 10 million HDMECs in one thousand microliters of culture medium through the preserved vasculature of the biomatrix. Inject approximately 700 microliters through the arterial inlet, and approximately 300 microliters through the vein outlet.Incubate the biomatrix with injected cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for three hours to allow cell attachment. Following incubation, the connection of the biomatrix to the bioreactor has to be done by two individuals, taking care that the arterial and the venous pedicles are connected to the medium flow correctly. Fill the bioreactor system with 350 milliliters of the vascular endothelial growth factor, 1%penicillin streptomycin, and incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.Place the frame inside the vessel of the bioreactor. Then, carefully connect the arterial and venous pedicles to the vessel. Start perfusion by connecting the bioreactor system to a peristaltic pump.Set the pressure at 10 millimeters of mercury amplitude plus minus one. Increase the pressure stepwise every hour until reaching a pressure of 100 millimeters of mercury amplitude plus minus 20. Mix 330 microliters of 0.4%Collagen R solution, 170 microliters of 0.1%acetic acid, and 50 microliters of medium M199 in a 15 milliliter Falcon tube.Keep the mixture on ice. Then, take the RCP microcarriers from the spinner flasks. Remove the culture medium completely.Next, add the volume of sodium hydroxide required to neutralize the collagen mixture. Once neutralized, immediately mix the mixture with the RCP microcarriers. It is important to allow gelation of the collagen gel before starting medium flow.Otherwise, the gel will detach and the microcarriers will be washed away from the lumen of the biomatrix. Add the collagen gel RCP microcarrier mixture on the lumen of the biomatrix. Allow gelation for 30 minutes.Then, connect the bioreactor to the peristaltic pump and set up the pressure at 100 millimeters of mercury amplitude plus minus 20. Finally, perform analysis and read outs of bioreactor cultures as described in the text protocol. Representative results of cell proliferation on microcarriers is shown by live dead staining in which many living cells can be observed on the microcarriers after seven days of dynamic cultures.These results were confirmed by scanning electron microscopy analysis showing completely colonized microcarriers after seven days of dynamic cultures. HDMECs kept their functionality after seven days of dynamic cultures on RCP microcarriers. Here, bright field microscopy reveals sprouts growing from the colonized microcarriers when cultured on a collagen gel.RFP labeled HDMECs were observed in the vascular structures of the biomatrix after 21 days of bioreactor cultures, indicating their migration from the RCP microcarriers to the biomatrix. Furthermore, after 21 days of bioreactor cultures, the scanning electron microscopy image shows that the microcarriers were in close proximity to the biomatrix. Interestingly, they are not colonized by cells anymore.After watching this video, you should have a good understanding on how to expand the cells on microcarriers to prepare them in an injectable cell delivery system for therapeutic application. Once mastered, this technique can be done in four hours. This procedure represents a promising strategy in regenerative medicine to obtain and maximize cell expansion and to deliver cells to implantation sites where they could improve vascularization for tissue engineered grafts.The implications of this technique extend toward vascularization because it can be used on any cell type for a tissue specific application in a clinical scenario. This method can also provide understanding into the potential employment of microcarriers as an injectible cell delivery system for therapeutic purposes. Don't forget that working with primary cells can be extremely hazardous, and precautions such as wearing gloves and lab coat, and working in a biosafety cabinet should always be taken when performing this procedure.After its development, this technique paved the way for researchers in the field of tissue engineering to explore cell migration in vitro which could help to understand or predict in vivo situations.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

בניית Hydrogel קולגן עבור משלוח של התא טעון גזע Chitosan microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

עור קעקוע כגישה חדשה לאספקת חיסון ה-DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

טיפוח של תאי יונקים באמצעות מערכת פניאומטיים Bioreactor יחיד שימוש

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

רקמות טחונות ב הדחוס קולגן: A Biotransplant המכיל נייד עבור תיקון Reconstructive המבוים יחיד

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...