Name: a simple flow cytometry based assay to determine in vitro antibody dependent enhancement of dengue virus using zika virus convalescent serum
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum at JoVE.com

Das beschriebene Projekt wurde aus Mitteln der Sonstiges Services University of Health Sciences, JJM unterstützt. Meinungen oder Aussagen, die hierin enthaltenen sind die privaten, der Autoren und nicht um sein als offizielle oder reflektierenden die Aussicht auf das Department of Defense, Sonstiges Dienstleistungen University Health Sciences oder einer anderen Agentur der USA ausgelegt Regierung.
WGV alle Experimente durchgeführt und analysiert die Daten; JJM konzipiert und betreut die Studie; WGW und JJM, schrieb die Zeitung.

Die Serumproben verwendet, um die hier beschriebenen Protokoll demonstrieren wurden von Rhesus-Makaken erhalten, die untergebracht und umsorgt in Übereinstimmung mit lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Richtlinien in einem Verein für die Bewertung und Zulassung von Laboratory Animal Care International (AAALAC)-akkreditierten Einrichtung. Alle Tierversuche wurden überprüft und durch institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt und Proben wurden durch eine sharing-Protokoll übernommen.
<p class="...

<ol>
	<li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques.">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).</li><li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity,+cross-reactivity,+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection.">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li><li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes.">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).</li><li>Chiofalo, M. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity.">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li><li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans.">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li><li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive,+memory-derived+plasmablasts.">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus.">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li></ol>

Flaviviren wie DENV und ZIKV Teilen deutlichen Anzeichen Homologie in ihre strukturelle und nicht strukturelle Proteine, die Antikörper zu erzeugen, die mit einander13,14Kreuzreaktion. Diese kreuzreaktiven Antikörperantworten nachweislich zur Verbesserung der Infektion in Vivo und in Vitro mit einer heterologen Serotyp oder andere im Zusammenhang mit Flaviviren1,2. Kreuz zu verbessern,...

Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der Infektion ist ein Prozess, wobei teilweise kreuzreaktiven Antikörperantworten induziert durch einen Serotyp des Virus verbessert die Aufnahme von einem anderen Serotyp des Virus, was zu erhöhten Virusreplikation und Virämie. ADE wurde ausgiebig in Dengue-Virusinfektionen (DENV) dokumentiert, wo die vier wichtigsten Serotypen weit verbreitet sind. Bei einem Teil der Patienten ist ADE Dengue hämorrhagisches Fieber (DHF) zugeordnet. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Zika-Virus (ZIKV)-Infektion signifikant hohe DENV kreuzreaktiven Antikörperantworten induziert, die ADE DENV in Vitro verursacht und wahrscheinlich dazu beigetragen, die Verbesserung der DENV Virämie in Vivo1 , 2. Antikörper-abhängige Verstärkung-Assays sind ein wertvolles Instrument zur Bewertung der Kapazität von Antikörpern gegen Sekundärinfektion mit verwandten Viren erweitern und wertvolle Einblicke in die Pathogenese der Flavivirus Infektionen und informieren die Entwicklung von Impfstoffen.
Der Test beschrieben verwendet hier DENV RVP zusammen mit K562-Zellen, die normalerweise unzulässig für Infektionen sind. RVP sind strukturell intakt Replikation inkompetenten DENV Viruspartikel, die ein Sub-genomische grün fluoreszierendes Protein (GFP) Replicon zu kodieren, die nach einer Runde Replikation3ausgedrückt wird. Als solche Zellen, die mit RVP infiziert fluoreszieren grün und leicht detektiert werden mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie. Die RVP in diesem Assay verwendet wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen. Sie können gegen andere Viren generiert und verwendet in der Probe in diesem Manuskript beschrieben. Unterdessen sind K562 Zellen einer FcγIII Rezeptor-exprimierenden Leukämie Zelllinie, die an die Fc-Region von Antikörper binden und im Beisein von Sub-Neutralisierung Konzentrationen von Antikörpern4,5infiziert werden.
ADE-Assays wurden ausgiebig in Studien zur Untersuchung der Risikofaktoren für schwere Dengue-Fieber und die Mechanismen der in-vitro- ADE abzugrenzen verwendet6,7,8. Der hier beschriebenen ADE-Assay schnell und einfach lässt sich die Kapazität des Serum zur Verbesserung von in-vitro- Infektion mit RVP und flow Cytometry, im Vergleich zu anderen Assays verwendet derzeit, die entweder erfordern die Bestimmung der Bildung von Plaque zu bestimmen Einheiten (Pfu) in Vero-Zellen oder Antikörper Färbung der infizierten Zellen6,7,8,9,10,11, beide zeitaufwendig und arbeitsintensiv sind intensive.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="794">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">DENV 1-4 RVP</td>
			<td style="width:139px;">Integral Molecular</td>
			<td style="width:119px;">RVP-501</td>
			<td style="width:323px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">K562 cells</td>
			<td style="width:139px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">FBS</td>
			<td style="width:139px;">GE lifesceinces</td>
			<td style="width:119px;">SH 30910.03</td>
			<td>10% FBS in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">MP biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">1670049</td>
			<td>100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:139px;">Cellegro</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td>0.025M in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7145</td>
			<td>1x in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:139px;">Cellegro</td>
			<td style="width:119px;">25-000-Cl</td>
			<td>1mM in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT25005CI&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sterile V-bottom plates</td>
			<td style="width:139px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">333-8001-01V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Non-sterile U-bottom plates</td>
			<td style="width:139px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">Ref 353910</td>
			<td>A high throughput alternative to FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">5mL, sterile, serological pipette</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">200uL sterile pipette tips</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P3020 CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20uL sterile pipette tips</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50-200uL multichannel pipette</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P3975-8-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">5-50uL multichannel pipette</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P3975-9-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20% formadehyde</td>
			<td style="width:139px;">Tousimis</td>
			<td style="width:119px;">&#160;#1008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Water Bath</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">TSCOL35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">thermomixer</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">2231000387</td>
			<td>An alternative to a waterbath for heat inactivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Liquid Bleach</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9724348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Flowjo 9.8</td>
			<td style="width:139px;">TreeStar, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD FACSDiva 6.1.2</td>
			<td style="width:139px;">Becton Dikinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">BD LSR II flow cytometer</td>
			<td style="width:139px;">Becton Dikinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Liquid Bleach</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9724348</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple flow cytometry based assay to determine in vitro antibody dependent enhancement of dengue virus using zika virus convalescent serum

Antikörper abhängige Verstärkung der Infektion hat sich gezeigt, eine wichtige Rolle in Dengue-virale Pathogenese zu spielen. Traditionelle Assays, die die Kapazität von Antikörpern oder Serum Infektion in unzulässige Zelllinien zu messen haben stützte sich auf mit viralen Ausgabe in den Medien, gefolgt von Plaque-Assays, um Infektion zu quantifizieren. Diese Tests haben in jüngerer Zeit, Dengue-Virus (DENV) Infektion in die Zell-Linien mit Gewebekulturen beschriftete Antikörper untersucht. Beide Ansätze haben Einschränkungen, die den weit verbreiteten Einsatz dieser Techniken einschränken. Hier beschreiben wir einen einfachen in Vitro Assay mit Dengue-Virus Reporter Viruspartikel (RVP), die Ausdrücken grün fluoreszierendes Protein und K562-Zellen zu Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der DENV Infektion mit Serum, das Rhesus entnommen wurde Makaken 16 Wochen nach der Infektion mit Zika-Virus (ZIKV). Diese Technik ist zuverlässig, beinhaltet minimale Manipulation von Zellen, beinhaltet jedoch nicht die Verwendung von live Replikation zuständigen Virus und in einem hohen Durchsatz-Format für eine quantitative Auslesen mit Durchflusszytometrie erhalten durchgeführt werden kann. Darüber hinaus kann dieser Assay leicht angepasst werden, um Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der andere Flavivirus Infektionen wie Gelbfieber-Virus (YFV), japanische Equine Enzephalitis-Virus (JEEV), West-Nil-Virus (WNV) etc., RVP vorliegen, zu untersuchen. Die einfache Einrichtung der Assay, Datenanalyse und Interpretation der Ergebnisse macht es sehr geeignet, um die meisten Labor-Einstellungen.

Seren von 4 Rhesus Makaken und auf ihr Potenzial zur Verbesserung DENV-1 getestet wurden gesammelt 16 Wochen nach Infektion mit ZIKV, 2, 3 und 4 Infektion in K562-Zellen. Die Tiere hatten Spitze Virämie von ~ 1 x 105 Exemplare von ZIKV RNA/mL Plasma vom 3. Tag nach der Infektion, die auf ein Niveau gesunken, die unter der Nachweisgrenze von 7 Tage nach der Infektion lagen. Keine Virämie wurde im Plasma auf 16 Wochen nach der Infektion festgestellt. Dann die RVP-Assay wurde du...

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A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Wir beschreiben eine einfache und leichte Protokoll zur Messung der Antikörper abhängige Verstärkung der Infektion durch Zika Virus genesenden Serum mit Dengue-Virus Reporter Viruspartikel.

Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Bildbasierte Durchflusszytometrie Technik zur Veränderung der Granulozyten-Funktion auswerten<em&gt; In-vitro-</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

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Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

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Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

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Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Quantifizierung der Antikörper-abhängige Verstärkung der Zika-Virus in primären humanen Zellen

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...