Name: high-sensitivity detection of micrometastases generated by gfp lentivirus-transduced organoids cultured from a patient-derived colon tumor
Uploaded: 2018-06-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor at JoVE.com

Эта работа была поддержана на Juntendo университета молодой следователь премии (2013, 2014 и 2015) лет, совместный проект премию (2013 и 2014) к. м. и предоставляет в помощь для научных исследований от министерства образования, культуры, спорта, науки и Технологии, Япония (16K 15625 до Y. K. и 16K 15598 для м.г.). Мы особенно благодарны всем членам Кафедра нашего хирургии и молекулярной патологии для полезных обсуждений и технической поддержки. Мы также благодарим Доктор Хироюки конно (Хамамацу университета Schoolof медицины) и доктор Хидеки Китадзима (Международный университет здравоохранения и социального обеспечения) за щедрые техническое руководство в хирургических процедур для имплантации ортотопическая в мышах и др. Бегемот (центр рака Тиба) Yoshitaka для технических консультаций по вопросам выполнения культуры органоид опухоли.

Пациент условии письменного информированного согласия, и проект был одобрен Комитет по этике исследований факультета Juntendo университета. Мышь эксперименты были также одобрены животное Комитет по этике исследований факультета медицины Juntendo.
1. Создание CRC PDXs иммунодефици?...

<ol>
	<li>Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer+statistics,+2014.">Colorectal cancer statistics, 2014.</a> CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+the+utility+of+patient-derived+xenograft+mouse+models.">Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models.</a> Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).</li><li>Puig, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+personalized+preclinical+model+to+evaluate+the+metastatic+potential+of+patient-derived+colon+cancer+initiating+cells.">A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells.</a> Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Colorectal+tumor+organoid+library+demonstrates+progressive+loss+of+niche+factor+requirements+during+tumorigenesis.">A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).</li><li>Fumagalli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+colorectal+cancer+progression+by+orthotopic+transplantation+of+engineered+cancer+organoids.">Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).</li><li>O'Rourke, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+engineered+organoids+enables+rapid+generation+of+metastatic+mouse+models+of+colorectal+cancer.">Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer.</a> Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis.">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).</li><li>Kuo, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+colonization+competence+governs+colon+cancer+metastasis.">Liver colonization competence governs colon cancer metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).</li><li>Onuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+reconstitution+of+tumorigenesis+in+primary+intestinal+cells.">Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).</li><li>Onder, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E-cadherin+promotes+metastasis+via+multiple+downstream+transcriptional+pathways.">Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways.</a> Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).</li><li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites.">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-related+lymphoproliferative+lesions+arising+in+donor+lymphocytes+of+transplanted+human+tumor+tissues+in+the+NOG+mouse.">Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse.</a> Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).</li></ol>

Хотя модель CRC PDX широко применяются для изучения роста первичной опухоли, ли эта модель также применима к расследованию метастазов опухоли не еще не выяснен полностью. Спонтанное метастазы были также едва обнаружено в печени и легких различных сообщил Колон PDX модели4,</s...

Колоректальный рак (КПР) является второй ведущей причиной рака смертей во всем мире1. Недостаточный отклик к обычной терапии пациентов с продвинутой стадии болезни показывает неэффективность попытки радикально вылечить ОЦР. Разработать более эффективные терапевтические подходы, были созданы различные модели доклинических мыши рака, которые имитируют характеристики ОЦР. Различные линии клетки CRC широко используются для создания ксенотрасплантатов опухоль из-за их удобство и простота манипуляции. Однако, долгосрочные культуры рак клеточных линий, часто вызывает выбор уникальных клеточных популяций, которые довольно пролиферативной при условии конкретной культуры, что приводит ненадежные результаты и решающее значение ограничения в доклинических наркотиков развития.
Не будучи культивировали в пробирке, пациент производные опухоли ксенотрасплантатов (PDXs) также генерируются имплантации в животных моделях тканях человека CRC, хирургически расчлененный от больных2,3,4. PDXs широко признаются как изложив основные Гистопатологические особенности и генетические изменения первоначально в опухоли пациентов, из которых они были получены. Кроме того пациент производные опухоли organoids состоит из опухолевых клеток, кластеры были созданы культуры условиях 3D, которые тесно имитировать биологических свойств оригинальной опухоли5,6. Эти опухоли organoids также применялись к высок объём наркотиков скрининг, тем самым позволяя персонализированной терапии разработаны5. Однако, заметно гетерогенных CRC населения предполагается присутствовать в опухоль массы. Особое CRC население может выборочно размножаться и расширить в ходе в vivo и in vitro серии проходы PDX и опухоли organoids, соответственно. Это также может позволить общие профили выражение гена и РПИ/генетический статус пострадавших ОЦР для изменения, результате чего минимальное сходство с родительского КПР.
Пациент производные CRC organoids и те, извлеченные из доброкачественные человека Колон, спроектированы для гавани, что комбинации онкогенных мутаций также были использованы для изучения отличительными чертами человека опухолевых клеток, подтверждается прорастание опухоли и метастазов 6,,78,9. Однако очень низкий уровень заболеваемости спонтанное метастазов, вытекающие из ортотопическая имплантации пациент производные КПР в иммунодефицитных мышей, затрудняет изучение многоэтапный процесс вторжения метастаз Каскад, который включает местные вторжение, intravasation, транспорт в кровоток, кровоподтек и колонизации отдаленные органы4,10. Micrometastasis как представлены опухолевых клеток осаждения ≤2 мм, образованный пациента производные organoids CRC, часто игнорировались гистопатологические анализа разделов от пострадавших в отдаленные органы в экспериментальной мыши модели. Визуализация спонтанное микрометастазы был также минимальным в естественных условиях из-за сложности эффективного введения флуоресцентных маркеров в органоид клетки опухоли до их введения в получателей мышей. В этом исследовании, мы разработали протокол эффективно передают GFP человека в PDX-производные CRC органоид клетки в 3D культуре до инъекции в получателей мышей и позволить высокочувствительный обнаружения, используя стерео флуоресцентной микроскопии, из их Колонизация различных органов в форме микрометастазы.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NOD/Shi-scid IL2R&#947; null (NOG) mice</td>
			<td>The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wound clips 
			2&#215;10mm</td>
			<td>Natsume manufacturing, Japan</td>
			<td>#C-21-S</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 
			needle size:22 gauge</td>
			<td>Tokyo Science, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>#92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>#92412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml conical tube</td>
			<td>Sumitono Bakelite</td>
			<td>MS-57150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tube</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-57500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#0030120086</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Erma</td>
			<td>#03-202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#354234</td>
			<td>Store aliqupts at -20&#176;C. 
			Place on ice until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C1030</td>
			<td>150 mg/ml collagenase type1 in 1&#215;PBS. Store aliqupts at -20&#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovate Cell Technologies</td>
			<td>#5V2623A</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 with GlutaMAX&#8482;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10565018</td>
			<td>Store at 4&#176;C. Warm at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell banker 1plus</td>
			<td>ZENOAQ</td>
			<td>#628</td>
			<td>Store at 4&#176;C. Use within 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#15140122</td>
			<td>Store at 4&#176;C. Use within 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#15140122</td>
			<td>Store at 4&#176;C. Use within 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Add to medium on same day as use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632, a ROCK inhibitor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#253-00591</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Add to medium on 
			same day as use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>DMEM/F-12 with GlutaMAX&#8482; supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 &#181;g/ml streptomycin. 
			Store at 4&#176;C. Use within 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRC organoid culture medium 
			with 1% or 5% FCS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM/F-12 with GlutaMAX&#8482; supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 &#181;g/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 &#181;M Y27632, a ROCK inhibitor. 
			Store at 4&#176;C. Use within 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the FuGENE 6 transfection regent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814 443001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.45 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius stedim</td>
			<td>17598-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRRL-GFP vector</td>
			<td>Gift from Dr. Robert A. Weinberg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Gift from Dr. Robert A. Weinberg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-dR8.2 dvpr</td>
			<td>Gift from Dr. Robert A. Weinberg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the SW55Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-sensitivity detection of micrometastases generated by gfp lentivirus-transduced organoids cultured from a patient-derived colon tumor

Несмотря на текущие достижения в лечении человека колоректального рака (CRC) несколько радикального лечения эффективны для поздних стадиях CRC. Для преодоления этой клинической проблемой, опухоли ксенотрансплантата мыши модели с помощью давно человека рак клеточных линий и многие трансгенные мыши, которые были разработаны модели с опухолями как доклинических моделей. Они частично имитировать функции человека карциномы, но часто не удается повторить ключевые аспекты человеческого злокачественных опухолей, включая вторжения и метастаз. Таким образом альтернативные модели, которые лучше представляют злокачественные прогрессии в человека CRC давно ждали.
Здесь мы покажем поколения опухоли пациента производные ксенотрасплантатов (PDXs) путем подкожной имплантации небольших фрагментов CRC, хирургически расчлененный от пациента. Толстой PDXs развивать и histopathologically напоминают CRC в пациента. Однако несколько спонтанных микрометастазы обнаруживаются в обычных сечения пострадавших отдаленные органы в PDX модели. Для облегчения обнаружения метастазов распространения в отдаленные органы, мы извлекали органоид клетки опухоли из PDXs толстой кишки в культуре и инфицированных GFP человека до инъекции в высоко иммунодефицитных NOD/Ши ТКИД IL2Rγзначение null (Нагель) мышах. Orthotopically вводят PDX-производные CRC органоид клетки последовательно положительные формы первичной опухоли для GFP получателей мышей. Кроме того спонтанно развивающихся micrometastatic, которые особенно колоний, выражая GFP обнаруживаются в легких этих мышей микроскопии флуоресцирования. Кроме того intrasplenic инъекции CRC organoids часто производит печеночная колонизации. Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о GFP-помечены PDX-производные CRC органоид клетки, чтобы быть визуально обнаружить во время многоэтапный процесс называют Каскад вторжения метастазы. Описанные протоколы включают в себя создание PDXs человека CRC и 3D культуры соответствующего CRC органоид клетки преобразованы GFP лентивирусные частицами.

Первичной кишки аденокарциномы, диагноз как умеренно дифференцированная хирургически резецируется от 76-летняя женщина с TNM классификации, этап IIIa, следуют послеоперационной химиотерапии. Основной immunohistochemically клетки CRC витражи позитивные раково-эмбрионального антиг?...

Watch this Scientific Journal Video about High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor at JoVE.com

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Чтобы разрешить высокочувствительный обнаружения распространения человека колоректального рака (CRC) клетки колонизацию тканей, мы здесь показать протокол для эффективного трансдукции зеленого флуоресцентного белка (ГФП) лентивирусные частиц в PDX-производные CRC органоид клетки перед их введением в получателей мышей, с стерео флуоресценции микроскопические наблюдения.

Высокая чувствительность обнаружения микрометастазы, порожденных GFP человека преобразованы Organoids культивированный от опухоли пациента производные Колон

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Маркировку рака молочной железы на пациента получены ксенотрансплантатов с прослеживаемы Репортеров для опухолевого роста и метастазирования исследований

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Изоляция и характеристика опухолевых клеток от саркомы пациента полученных Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Метод для определения последствий экологических обогащения на биоразнообразие Микрофлора толстой кишки в мышиной модели опухоли толстой кишки

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Пациент полученных ортотопические ксенотрансплантат Модели для человека Уротелиальной карциномы клеток и колоректального рака опухоли роста и спонтанного метастаза

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Экспланты опухолей, полученные от пациентов, как «живая» доклиническая платформа для прогнозирования лекарственной устойчивости у пациентов

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Высокопроизводительный анализ in vitro с использованием органоидов опухолей, полученных от пациента

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Профилирование чувствительности к таргетной терапии в органоидах EGFR-мутантного НМРЛ, полученных из пациента

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Создание 3-мерных сфероидов из образцов опухолей, полученных от пациентов, и оценка их чувствительности к лекарствам

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Генерация и культивирование высокодифференцированных серозных органоидов, полученных от пациентов с раком яичников

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...