Name: measurement of mitochondrial oxygen consumption in permeabilized fibers of drosophila using minimal amounts of tissue
Uploaded: 2018-04-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue at JoVE.com

Deze studie werd gefinancierd door subsidies van de National Sciences, de Engineering Research Council (NSERC, ontdekking subsidie) en de Université de Moncton aan NP. LHB wil de financiële steun van het Canadees Instituut voor gezondheid onderzoek (CIHR), de Stichting van de innovatie van New Brunswick (NBIF) en de Université de Moncton erkennen. Het werk van EHC wordt ondersteund door de Alzheimer Society of Canada, hersenen Canada, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick innovatie Foundation, New Brunswick Health Research Foundation en de Université de Moncton.

1. reagentia voorbereiding
<ol><li>De volgende oplossingen voorbereiden op dissectie en permeabilization van het weefsel.<ol>
<li>Bereiden van behoud oplossing: 2,77 CaK2EGTA, 7.23 mM K2EGTA, 5.77 mM nb2ATP, 6.56 mM MgCl2, taurine, 20 mM 15 mM nb2phosphocreatine, 20 mM imidazool, 0.5 mM dithiothreitol, en 50 mM K-MES, pH 7.1 (kan worden opgeslagen bij-20 ° C).</li>
		<li>Bereid saponine oplossing: 5 mg saponine in 1 mL behoud oplossing (bereiden verse dagelijks).<...

<ol>
	<li>Stephenson, R., Metcalfe, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+a+fly+through+its+history+and+current+use.">Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use.</a> The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+attempt+to+analyze+the+constitution+of+the+chromosomes+on+the+basis+of+sex-limited+inheritance+in+Drosophila.">An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila.</a> Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).</li><li>Dobzhansky, T., Wright, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Natural+Populations.+V.+Relations+between+Mutation+Rate+and+Accumulation+of+Lethals+in+Populations+of+Drosophila+Pseudoobscura.">Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura.</a> Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).</li><li>Zipursky, S. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Neuronal+Cell+Fate:+Lessons+from+the+R7+Neuron+of+Drosophila.">Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).</li><li>Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+therapeutic+potential+of+doxycycline+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Alzheimer+disease.">Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease.</a> The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).</li><li>Blandini, F., Armentero, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Parkinson's+disease.">Animal models of Parkinson's disease.</a> FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).</li><li>Baker, K. D., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+Larvae+and+Obese+Flies-Emerging+Studies+of+Metabolism+in+Drosophila.">Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).</li><li>Morris, S. N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster.">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).</li><li>Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+insights+of+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+mitochondrial+damage:+importance+in+non-SOD1+ALS.">Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).</li><li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+oxidants,+and+aging.">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120 (4), 483-495 (2005).</li><li>Szibor, M., Holtz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ageing.">Mitochondrial ageing.</a> Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans.">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li><li>L&#243;pez-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+and+healthy+aging.">Mitochondrial biogenesis and healthy aging.</a> Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).</li><li>Muoio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+inflexibility:+When+mitochondrial+indecision+leads+to+metabolic+gridlock.">Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock.</a> Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).</li><li>Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient-sensing+mechanisms+and+pathways.">Nutrient-sensing mechanisms and pathways.</a> Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).</li><li>Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+respiration+and+ATP+synthesis+in+mammalian+mitochondria+and+cells.">Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells.</a> The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).</li><li>McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&amp;#34;Alternative&amp;#34;+fuels+contributing+to+mitochondrial+electron+transport:+Importance+of+non-classical+pathways+in+the+diversity+of+animal+metabolism.">&amp;#34;Alternative&amp;#34; fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).</li><li>Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Physiology+in+the+Major+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti:+Substrate+Preferences+and+Sexual+Differences+Define+Respiratory+Capacity+and+Superoxide+Production.">Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production.</a> PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).</li><li>Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+substrate+specificity+in+beetle+flight+muscle:+assessing+respiratory+oxygen+flux+in+small+samples+from+Dermestes+maculatus+and+Tenebrio+molitor.">Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor.</a> Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).</li><li>Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+as+a+fuel+for+insect+flight:+enhancing+carbohydrate+oxidation+in+hymenopterans.">Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).</li><li>Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+decline+in+mitochondrial+respiration+and+electron+transport+in+Drosophila+melanogaster.">Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster.</a> The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).</li><li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+of+superoxide+production+by+complex+III+and+glycerol+3-phosphate+dehydrogenase+in+Drosophila+mitochondria.">The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).</li><li>Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympatric+Drosophila+simulans+flies+with+distinct+mtDNA+show+difference+in+mitochondrial+respiration+and+electron+transport.">Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+superoxide+production+from+different+sites+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).</li><li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers,+tissues+and+cells.">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.+New+perspectives+of+mitochondrial+physiology.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+isolation,+structure+and+function.">Mitochondria: isolation, structure and function.</a> The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).</li><li>Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+sensitivity+of+mitochondrial+functions+in+permeabilized+muscle+fibers+from+two+populations+of+Drosophila+simulans+with+divergent+mitotypes.">Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes.</a> American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).</li><li>Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mitochondrial+dna+haplotypes+exhibit+metabolic+differences:+insight+into+functional+properties+of+mitochondria.">Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria.</a> Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).</li><li>Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+influences+the+intake+target+and+mitochondrial+functions+of+Drosophila+melanogaster+males.">Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males.</a> Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).</li><li>Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., C&#244;t&#233;, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+implications+of+mitochondrial+genetic+variation:+mitochondrial+genetic+effects+on+OXPHOS+respiration+and+mitochondrial+quantity+change+with+age+and+sex+in+fruit+flies.">Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies.</a> Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+proline,+a+stress+substrate,+modulates+carcinogenic+pathways.">The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways.</a> Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).</li><li>Bender, T., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+health+and+disease:+To+carry+or+not+to+carry?.">The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry?.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>McCommis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+role+for+the+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+glucose-stimulated+insulin+secretion.">An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion.</a> Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).</li></ol>

In dit onderzoek is een methode voor de bereiding van de monsters vóór de meting van de mitochondriale zuurstofverbruik in Drosophila beschreven. Deze methode werd ontwikkeld om te overwinnen van de verschillende problemen in verband met de protocollen die met behulp van mitochondriale isolatie, met name wat betreft de duur en aantal personen vereist. In plaats van het werken met mitochondriale isolatie meestal vereisen grote hoeveelheid weefsels verkregen uit meerdere personen, wordt dit experiment uitgevoerd op perme...

De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is gebruikt als een modelorganisme voor genetisch onderzoek voor meer dan een eeuw1. De studie van dit organisme heeft niet alleen geleid tot belangrijke fundamentele kennis over geslachtsgebonden overerving2, mutatie tarief3, de ontwikkeling van neurale systeem en de cel lot bepaling4, maar ook onlangs heeft ontpopt als een waardevol instrument te bestuderen van de mechanismen die inherent zijn aan verschillende ziekten zoals Alzheimer en Parkinson5,6. Bovendien is het een populair model te bestuderen van het verouderingsproces, zoals ze in groot aantal over een korte periode van tijd kunnen worden verhoogd en een korte levensduur hebben. Zij bezitten ook homologe structuren aan menselijke organen, zoals een hart oenocytes (hepatocyte-achtige cellen), fat organen (functioneren op dezelfde manier als de lever en wit vetweefsel), de insuline producerende cellen (equivalent aan β-pancreatic cellen), evenals de Hemolymfe transport van metabolieten (analoog aan het bloed van gewervelde dieren)7. Bovendien is de centrale trajecten van intermediaire metabolisme (met inbegrip van de insuline/insuline-achtige groeifactor-achtige signalering traject en doel van Rapamycin-TOR trajecten) zijn ook zeer geconserveerde7. Om deze redenen hebben onlangs Drosophila benut om te beschrijven de fundamentele mechanismen waarmee metabolisme, vooral in pathologische omstandigheden die inherent zijn aan menselijke metabole ziekten zoals diabetes,8. Een belangrijk onderdeel van het metabolisme is het mitochondrion die integreert meerdere trajecten en voert een van life's meest belangrijke biologische functies, productie van ATP, via de oxidatieve fosforylatie proces (OXPHOS). Gezien hun centrale rol in het metabolisme van het organisme is het niet verwonderlijk dat mitochondriale stoornissen zijn betrokken in vele ziekten zoals Parkinson,9 en10ziekten van Alzheimer, evenals in Amyotrofische laterale sclerose 11 , 12. ze zijn ook fundamentele determinanten van het verouderingsproces. Inderdaad, ze zijn de belangrijkste producenten van reactieve zuurstof soorten (ROS) in de cel, die schadelijk voor de cel in hoge concentraties t/m11van de oxidatieve schade zijn kan. Veroudering is ook gekoppeld aan de accumulatie van beschadigde of gemuteerde mitochondriaal DNA-13, mitophagy disfuncties14,15 , alsmede bijzondere waardevermindering van mitochondriale biogenese16geweest. Mitochondriën zijn ook belangrijke determinanten van de cel van de homeostase als ze kunnen gebruik maken van verschillende substraten om aan te passen van de verschillende cellulaire functies aanroept volgens de overvloed of schaarste van macronutriënten17,18.
Inderdaad, de verschillende voedingsstoffen in de voeding (koolhydraten, lipiden en eiwitten) zijn verteerd, geabsorbeerd en vervoerd in de cellen. Ze worden vervolgens getransformeerd in het cytosol en de afgeleide substraten worden getransporteerd naar de mitochondriale matrix waar ze verminderen equivalenten, zoals NADH en FADH2-19 produceren. Deze vermindering equivalenten zijn vervolgens geoxideerd door verschillende enzymatische complexen van het elektronentransport systeem (ETS). Deze complexen zijn ingebed in de mitochondriale binnenste membraan, zoals Complex I en complexe II. Bovendien vertegenwoordigen andere enzymatische complexen zoals de mitochondriale glycerol-3-fosfaat dehydrogenase en de proline dehydrogenase alternatieve routes voor de toetreding van de elektronen in de ETS20,21. Deze 'alternatieve' complexen zijn met name belangrijk bij insecten, als gelang van de diersoort, zij kunnen actief deelnemen te verhogen van de ademhaling20,22,23,21. Elektronen uit deze ETS Voersystemen worden overgebracht naar de ubiquinone en vervolgens complexe III, en vervolgens naar complexe IV, tot de definitieve acceptor, moleculaire zuurstof. Deze elektronen overdracht genereert een proton-stuwende kracht over de innerlijke mitochondriale membraan de fosforylatie van ADP rijden naar ATP bij complexe V (Figuur 1). Gezien de centrale rol van mitochondria in cel homeostase, bestuderen van mitochondriale metabolisme met behulp van het relevante model D. melanogaster vertegenwoordigt een krachtig hulpmiddel om af te bakenen de onderliggende mechanismen van diverse pathofysiologische voorwaarden of onder cellulaire en milieu benadrukt. Verrassend echter slechts een handvol studies gemeten eigenlijk mitochondriale ademhaling in Drosophila24,25,26. Inderdaad, moeten experimenten gericht op het beoordelen van de mitochondriale zuurstofverbruik het isolement van de mitochondriën. Hoewel voordelig voor het meten van verschillende mitochondriale functies (zoals ROS productie of P/O verhouding als markering van mitochondriale efficiëntie27,28), vereisen deze isolatie in het algemeen liever grote hoeveelheden van weefsel van verschillende individuen24,29. Deze eis voor grote hoeveelheden weefsel en individuen is een belangrijke beperkende factor, vooral gezien het feit dat alle individuen dezelfde leeftijd moeten worden en bij voorkeur van hetzelfde geslacht voor de experimenten, waardoor de maatregel van de ademhaling op verschillende tijden moeizame wijst op zijn best. Bovendien, terwijl mitochondriale isolatie significante inzicht in de fundamentele mechanismen bestuur mitochondriale metabolisme bieden kunnen, de gebruikte methoden voor het isoleren van de mitochondriën hebben enkele nadelen zoals de moeilijkheid om repliceerbaar resultaten te verkrijgen , verstoring van de mitochondriale netwerk, en wijziging van mitochondriale structuur en functie29,30,31.
Het doel van deze studie is te presenteren van een robuust protocol voor het meten van mitochondriale zuurstofverbruik in Drosophila met behulp van slechts een minimale hoeveelheid weefsel van zeer weinig individuen. Dit protocol bestaat uit het meten van mitochondriale zuurstof verbruik in situ spiervezels permeabel29 van Drosophila thoraxes gebruiken in combinatie met hoge resolutie respirometrie32,33, 34 , 35. deze methode heeft ook extra voordelen in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-methode omdat de interacties met de andere componenten van de cel als goed als mitochondriale structuur en functie worden meer bewaard in permeabel vezels29,31,36, waardoor deze aanpak meer fysiologisch relevante. Met dit protocol, kunnen mitochondriale functies nauwkeurig getoetst met behulp van hoge-resolutie respirometrie in slechts drie thoraxes van Drosophila, met substraten toestaan van de bepaling van zuurstofverbruik in verschillende stappen van de ETS. Daarom kon dit protocol helpen beantwoorden van belangrijke vragen over de fundamentele mechanismen waarmee de stofwisseling in het kader van vele milieu- of pathofysiologische omstandigheden door te profiteren van de Drosophila model.
Meten van het zuurstofverbruik in verscheidene verschillende stappen van de ETS en evalueren van hoe verschillende substraten bijdragen aan de ademhaling, de verschillende substraten (Figuur 1), de uncoupler, en remmers zijn gebruikte30 na permeabilization van de weefsel. Specifiek, worden opeenvolgende toevoegingen van verschillende substraten uitgevoerd om het stimuleren van de toetreding van elektronen door verschillende complexen van de ETS. Een uncoupler, carbonyl cyanide 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), wordt vervolgens toegevoegd aan de optimale concentratie voor het meten van de ademhaling niet-gekoppeld, dat wil zeggen, de niet-phosphorylating ademhaling gestimuleerd om maximaal zuurstofverbruik. Opeenvolgende remmingen van complexen die i, II en III worden vervolgens uitgevoerd om te controleren de residuele zuurstofverbruik thats als gevolg van de niet-ETS oxidatiereacties. Ten slotte, complexe IV maximale ademhaling capaciteit kan worden geëvalueerd door de injectie van N, N, N', N, - Tetramethyl - p-fenyleendiamine (TMPD), een kunstmatige elektron provider, en ascorbaat. Het is belangrijk op te merken dat de experimenten zijn uitgevoerd op 24 °C omdat het de temperatuur waarop de vliegen zijn gerezen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-resolution respirometer Oxygraph O2K</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>10022-02</td>
			<td>Startup O2K respirometer kit 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K-Titration Set&#160;</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes with different volumes 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab software</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>20700</td>
			<td>Software for data acquisition and analysis 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped antimagnetic forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-400</td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secura225D-1S-DQE</td>
			<td>Sartorius AG, Goettingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Semi-micro balance (distributed by several companies)&#160; 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster wild-type w1118</td>
			<td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Storage Condition: 24 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>EGTA 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td>CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td> 
			Storage Condition: -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td> 
			Storage Condition: -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td> 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin from quillaja bark</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Saponin 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05470</td>
			<td> 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S2O4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Pyruvate 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(-)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Malate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-diphosphate monopotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>ADP 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>Cytochrome c 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td>Proline 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td>Succinate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Glycerol-3-phosphate 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td>Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td>TMPD 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&#160; -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Ascorbate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&#160; -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.&#160; 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial oxygen consumption in permeabilized fibers of drosophila using minimal amounts of tissue

De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, vertegenwoordigt een opkomende model voor de studie van het metabolisme. Inderdaad, drosophila structuren homoloog aan menselijke organen hebben, beschikken over zeer geconserveerde stofwisselingsroutes en hebben een relatief korte levensduur waarmee de studie van verschillende fundamentele mechanismen in een korte periode van tijd. Het is echter verrassend dat een van de mechanismen die essentieel zijn voor cellulaire metabolisme, de mitochondriale ademhaling, niet grondig in dit model onderzocht is. Het is waarschijnlijk omdat de maatregel van de mitochondriale ademhaling in Drosophila meestal een zeer groot aantal personen vereist en de resultaten niet zeer reproduceerbaar zijn. Hier, wordt een methode waardoor de nauwkeurige meting van mitochondriale zuurstofverbruik met minimale hoeveelheden weefsel van Drosophila beschreven. Bij deze methode worden de thoraxes ontleed en permeabel, zowel mechanisch met scherpe pincet en chemisch saponine, waardoor verschillende verbindingen te steken van het celmembraan en het moduleren van de mitochondriale ademhaling. Na permeabilization, wordt een protocol uitgevoerd om te evalueren van de capaciteit van de verschillende complexen van het elektronentransport systeem (ETS) om te oxideren verschillende substraten, evenals hun reactie op een uncoupler en verschillende remmers. Deze methode biedt veel voordelen ten opzichte van methoden met behulp van mitochondriale isolatie, aangezien er meer fysiologisch relevant omdat de mitochondriën zijn nog steeds interactie met de andere cellulaire componenten en de mitochondriale morfologie is geconserveerd. Bovendien staalvoorbereiding zijn sneller, en de verkregen resultaten zijn zeer reproduceerbaar. Door het combineren van de voordelen van Drosophila als een model voor de studie van het metabolisme met de evaluatie van de mitochondriale ademhaling, belangrijke nieuwe inzichten kunnen worden onthuld, vooral wanneer de vliegen ondervindt verschillende milieu- of pathofysiologische voorwaarden.

Een representatieve spoor van mitochondriale zuurstofverbruik met behulp van het protocol die hierboven beschreven wordt gegeven in Figuur 2. De pyruvaat en malate geïnjecteerd in de kamers samen met de permeabilized spiervezels zijn bedoeld om de CI-lek ademhaling, dat wil zeggen, wanneer het complex I van de ETS wordt gestimuleerd door de NADH geproduceerd door oxidatie van pyruvaat en malate via de tricarboxylic acid cyclus (CI). Tijdens deze ade...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue at JoVE.com

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Gelijktijdige meting van Superoxide/waterstofperoxide en NADH productie door Flavin-bevattende mitochondriale Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Meten lever mitochondriale zuurstofverbruik en Proton lek kinetiek te schatten van mitochondriale ademhaling in Holstein melkvee

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Meten en interpreteren van zuurstof verbruik geheel vliegen hoofd segmenten

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Directe meting van KDM1A target engagement met behulp van Chemoprobe-gebaseerde immunoassay

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Snelle en kosteneffectieve RNA-extractie van rattenlelfum

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Kwantificering van subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspiervezels met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

High-throughput image-based kwantificering van mitochondriale DNA-synthese en -distributie

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...