Name: measurement of mitochondrial oxygen consumption in permeabilized fibers of drosophila using minimal amounts of tissue
Uploaded: 2018-04-07T14:00:00
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Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni dalla Nazionale Scienze e ingegneria Research Council (NSERC, scoperta grant) e Université de Moncton NP. LHB desidera ringraziare i finanziamenti a sostegno dell'Istituto canadese della Université de Moncton, Nuovo Brunswick Innovation Foundation (NBIF) e Health Research (CIHR). Il lavoro di EHC è supportato dall'Alzheimer Society of Canada, Canada di cervello, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, New Brunswick Health Research Foundation e Université de Moncton.

1. reagenti preparazione
<ol><li>Preparare le seguenti soluzioni per la dissezione e la permeabilizzazione del tessuto.<ol>
<li>Preparare la soluzione di conservazione: 2,77 CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, 20mm della taurina, 15mm fosfocreatina di Na2, imidazolo di 20 mM, 0.5 mM dithiothreitol e 50 mM K-MES, pH 7.1 (possono essere memorizzati a-20 ° C).</li>
		<li>Preparare la soluzione di saponina: 5 mg di saponina in 1 mL di soluzione di...

<ol>
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In questo studio, è descritto un metodo per la preparazione del campione prima le misure del consumo di ossigeno mitocondriale in drosofila. Questo metodo è stato sviluppato per risolvere diversi problemi relazionati ai protocolli utilizzando isolamenti mitocondriali, in particolare in termini di durata e numero di esemplari richiesto. Invece di lavorare con isolamenti mitocondriali solitamente che richiedono grandi quantità di tessuti ottenuti da individui diversi, questo esperimento viene eseguito sulle fibre muscol...

Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è stato utilizzato come organismo modello per la ricerca genetica per sopra un secolo1. Lo studio di questo organismo non ha solo portato a significative conoscenze fondamentali sull'ereditarietà legata al sesso2, mutazione tasso3, lo sviluppo del sistema neurale e la determinazione di destino cella4, ma anche recentemente è emerso come un strumento prezioso per studiare i meccanismi inerenti alle diverse malattie come Alzheimer e Parkinson5,6. Inoltre, è un modello popolare per studiare il processo di invecchiamento, in quanto può essere sollevate in gran numero per un breve periodo di tempo e hanno una durata breve. Inoltre possiedono strutture omologhe degli organi umani, come un cuore, corpi grassi (funziona allo stesso modo come il tessuto adiposo bianco e fegato), oenocytes (hepatocyte-come le cellule), insulina producendo le cellule (equivalente a cellule β-pancreatiche), nonché la emolinfa trasporta metaboliti (analogo al sangue dei vertebrati)7. Inoltre, le vie centrali del metabolismo intermedio (tra cui la via di segnalazione dell'insulina/insulina-come il fattore di crescita e i percorsi del bersaglio della rapamicina-TOR) sono altamente conservato7. Per questi motivi, Drosophila recentemente sono state sfruttate per descrivere i meccanismi fondamentali che controllano il metabolismo, soprattutto in condizioni patologiche inerenti umani malattie metaboliche come il diabete8. Una componente importante del metabolismo è il mitocondrio che integra le vie multiple ed esegue una delle più importanti funzioni biologiche della vita, produzione di ATP, tramite il processo di fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Considerando il loro ruolo centrale nel metabolismo dell'organismo, non è sorprendente che le disfunzioni mitocondriali sono coinvolti in molte malattie come il morbo di Parkinson9 e morbo di Alzheimer malattie10, così come nella sclerosi laterale amiotrofica 11 , 12. sono anche determinanti fondamentali del processo di invecchiamento. Infatti, sono i principali produttori di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella cellula, che può essere dannosa per la cella ad alta concentrazione a danni ossidativi11. Invecchiamento inoltre è stata associata all'accumulo di DNA danneggiato o mutato mitocondriale13, mitophagy disfunzioni14,15 , così come danno della biogenesi mitocondriale16. I mitocondri sono anche determinanti dell'omeostasi della cella come possono utilizzare diversi substrati per regolare diverse funzioni cellulari secondo l'abbondanza o la scarsità di macronutrienti17,18.
Infatti, le diverse sostanze nutritive nella dieta (carboidrati, lipidi e proteine) sono digerite, assorbite e trasportate nelle cellule. Vengono poi trasformati nel citosol, e i substrati derivati vengono trasportati nella matrice mitocondriale dove si producono equivalenti riducenti, quali NADH e FADH219. Questi equivalenti riducenti sono quindi ossidati dai diversi complessi enzimatici del sistema di trasporto dell'elettrone (ETS). Questi complessi vengono incorporati nella membrana mitocondriale interna, come complesso I e II complesso. Inoltre, altri complessi enzimatici come il glicerolo-3-fosfato deidrogenasi mitocondriale e la deidrogenasi di prolina rappresentano percorsi alternativi per la voce di elettroni in ETS20,21. Questi complessi 'alternativi' sono particolarmente importanti in insetti, come secondo le specie, possono partecipare attivamente per aumentare la respirazione20,22,23,21. Elettroni da questi sistemi di alimentazione di ETS sono trasferiti ad l'ubiquinone e successivamente al complesso III e quindi al complesso IV, fino al ricettore finale, ossigeno molecolare. Questo trasferimento di elettroni genera una Forza Protonomotrice attraverso la membrana mitocondriale interna guida la fosforilazione di ADP in ATP al complesso V (Figura 1). Considerando il ruolo centrale dei mitocondri nell'omeostasi della cella, studiando il metabolismo mitocondriale utilizzando il relativo modello d. melanogaster rappresenta un potente strumento per delineare i meccanismi di fondo di varie fisiopatologico condizioni o sotto stress cellulare e ambientale. Sorprendentemente però, solo una manciata di studi effettivamente misurati la respirazione mitocondriale in Drosophila24,25,26. Infatti, gli esperimenti con l'obiettivo di valutare il consumo di ossigeno mitocondriale richiedono l'isolamento dei mitocondri. Anche se vantaggioso per la misurazione delle diverse funzioni mitocondriali (ad esempio produzione di ROS o rapporto di P/O come indicatore di efficienza mitocondriale27,28), questi isolamenti richiedono generalmente piuttosto grandi quantità del tessuto da diversi individui24,29. Questo requisito per elevate quantità di tessuto e di individui è un importante fattore limitante, soprattutto se si considera che tutti gli individui dovrebbero essere della stessa età e preferibilmente dello stesso sesso per gli esperimenti, rendendo la misura della respirazione in tempi diversi punti laborioso nella migliore delle ipotesi. Inoltre, mentre gli isolamenti mitocondriali possono fornire significativi comprensione dei meccanismi fondamentali che regolano il metabolismo mitocondriale, i metodi utilizzati per isolare i mitocondri hanno diversi inconvenienti come la difficoltà di ottenere risultati replicabili , la rottura della rete mitocondriale e alterazione di mitocondriale struttura e funzione29,30,31.
Lo scopo di questo studio è di presentare un protocollo robusto per misurare il consumo di ossigeno mitocondriale in Drosophila usando solo una minima quantità di tessuto da pochissimi individui. Questo protocollo consiste nel misurare ossigeno mitocondriale consumo in situ utilizzando fibre muscolari permeabilized29 da toraci di Drosophila in combinazione con alta risoluzione respirometry32,33, 34 , 35. questo metodo ha anche altri vantaggi rispetto al metodo classico isolamento mitocondriale poiché le interazioni con gli altri componenti della cellula come bene come mitocondriale struttura e funzione sono più conservati in permeabilizzate fibre29,31,36, che rende questo approccio più fisiologicamente rilevanti. Con questo protocollo, funzioni mitocondriali possono essere accuratamente valutate utilizzando manometrica ad alta risoluzione in solo tre toraci di Drosophila, con substrati permettendo la determinazione del consumo di ossigeno alle diverse fasi dell'ETS. Di conseguenza, questo protocollo potrebbe aiutare rispondere alle domande fondamentali circa i meccanismi fondamentali che controllano il metabolismo nel contesto delle diverse condizioni ambientali o patofisiologiche sfruttando il modello di Drosophila.
Per misurare il consumo di ossigeno alle diverse fasi dell'ETS e valutare come i diversi substrati contribuiscono alla respirazione, diversi substrati (Figura 1), disaccoppiatore, e inibitori sono usati30 dopo permeabilizzazione della tessuto. In particolare, aggiunte sequenziale di diversi substrati vengono eseguite per stimolare l'entrata di elettroni attraverso diversi complessi dell'ETS. Un disaccoppiatore, Carbonil cianuro 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), viene quindi aggiunto a concentrazione ottimale per misurare la respirazione non accoppiati, cioè, la respirazione non fosforilante stimolata al massimo consumo di ossigeno. Inibizioni sequenziale dei complessi che i, II e III stiamo quindi eseguita per monitorare il consumo di ossigeno residuo che è a causa di reazioni di ossidazione del non-ETS. Infine, capacità di respirazione massima complesso IV può essere valutata tramite l'iniezione di N, N, N', N, - tetrametil - p-fenilendiammina (TMPD), un elettrone artificiale provider e ascorbato. È importante notare che gli esperimenti sono condotti a 24 °C, dal momento che è la temperatura alla quale vengono generati i mosche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-resolution respirometer Oxygraph O2K</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>10022-02</td>
			<td>Startup O2K respirometer kit 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K-Titration Set&#160;</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes with different volumes 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab software</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>20700</td>
			<td>Software for data acquisition and analysis 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped antimagnetic forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-400</td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secura225D-1S-DQE</td>
			<td>Sartorius AG, Goettingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Semi-micro balance (distributed by several companies)&#160; 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster wild-type w1118</td>
			<td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Storage Condition: 24 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>EGTA 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td>CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td> 
			Storage Condition: -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td> 
			Storage Condition: -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td> 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin from quillaja bark</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Saponin 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05470</td>
			<td> 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S2O4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Pyruvate 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(-)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Malate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-diphosphate monopotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>ADP 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>Cytochrome c 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td>Proline 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td>Succinate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Glycerol-3-phosphate 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td>Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td>TMPD 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&#160; -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Ascorbate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&#160; -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.&#160; 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial oxygen consumption in permeabilized fibers of drosophila using minimal amounts of tissue

Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, rappresenta un modello emergente per lo studio del metabolismo. Infatti, drosophila hanno strutture omologhe a organi umani, possiedono vie metaboliche altamente conservate e hanno una durata relativamente breve che consente lo studio dei meccanismi fondamentali differenti in un breve periodo di tempo. Sorprende, tuttavia, che uno dei meccanismi essenziali per il metabolismo cellulare, la respirazione mitocondriale, non è stato accuratamente studiato in questo modello. È probabile che la misura della respirazione mitocondriale in drosofila richiede solitamente un numero molto grande di individui e i risultati ottenuti non sono altamente riproducibili. Qui, è descritto un metodo che permette la misurazione precisa del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando la minima quantità di tessuto dalla drosofila. In questo metodo, toraci sono sezionati e permeabilizzate sia meccanicamente con una pinza tagliente e chimicamente con saponina, permettendo diversi composti di attraversare la membrana cellulare e modulano la respirazione mitocondriale. Dopo il permeabilization, un protocollo viene eseguito per valutare la capacità dei diversi complessi del sistema di trasporto dell'elettrone (ETS) di ossidare substrati diversi, così come la loro risposta per un disaccoppiatore e parecchi inibitori. Questo metodo presenta molti vantaggi rispetto ai metodi utilizzando isolamenti mitocondriali, in quanto è più fisiologicamente rilevante perché i mitocondri sono ancora interagendo con le altre componenti cellulari e la morfologia mitocondriale è conservata. Inoltre, la preparazione del campione sono più veloci, e i risultati ottenuti sono altamente riproducibili. Combinando i vantaggi della drosofila come un modello per lo studio del metabolismo con la valutazione della respirazione mitocondriale, importanti nuove intuizioni possono essere svelati, soprattutto quando le mosche sono sperimentando diversi ambientale o fisiopatologico condizioni.

Una traccia di rappresentante del consumo di ossigeno mitocondriale mediante il protocollo descritto sopra è fornita nella Figura 2. Il piruvato e malate iniettato nelle camere insieme con le fibre muscolari permeabilized si riferiscono alla respirazione CI-perdita, vale a dire, quando il complesso I di ETS è stimolato dal NADH prodotte attraverso l'ossidazione del piruvato e malate tramite il ciclo dell'acido tricarbossilico (CI). Durante questo t...

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Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

In questa carta, è descritto un metodo per misurare il consumo di ossigeno utilizzando ad alta risoluzione manometrica in permeabilized toraci di Drosophila. Questa tecnica richiede una minima quantità di tessuto rispetto alla tecnica classica isolamento mitocondriale e i risultati ottenuti sono più fisiologicamente rilevanti.

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

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