Name: fabrication of a multiplexed artificial cellular microenvironment array
Uploaded: 2018-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array at JoVE.com

Vi takker Prof. N. Nakatsuji på iCeMS, Kyoto University, for at give humane ES-celler. Vi takker også Prof. A. Maruyama på Tokyo Institute of Technology for hans støtte i brugen af atomic force microscope. Finansiering blev generøst leveret af Japan samfund til fremme af videnskab (JSP'ER; 22350104, 23681028, 25886006 og 24656502); finansieringen blev også leveret af den nye energi og industrielle teknologi udvikling Organization (NEDO) og Terumo Life Science Foundation. WPI-iCeMS understøttes af verden Premier International Research Center initiativ (WPI), Ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT), Japan. En del af dette arbejde blev støttet af Kyoto University nanoteknologi Hub og AIST Nano-behandlingsanlæg i "Nanotechnology Platform projekt" sponsoreret af MEXT, Japan.

1. fremstilling af MACME Array
Bemærk: Alle materialer og udstyr er angivet i tabellen materialer.
<ol><li>
Fremstilling af masker til en nanofiber array og en form for en mikrofluid struktur
	<ol>
<li>Oprette tre-dimensionelle (3D) billeder af masker anvendes til nanofiber arrays og forme til mikrofluid strukturer ved hjælp af 3D-computergrafik softwarepakker (tabel 1). Bemærk: 3D-billeder er læse og trykt af en 3D-printer. Trykte ma...

Denne protokol viser den første screeningsmetode for at etablere en robust kultur system til vedligeholdelse af kvalificerede hPSCs. Første gang, vi beskrevet hvordan du forbereder en platform, byder forskellige kunstige ECMs og celle såning tætheder ved hjælp af en mikrofluid enhed integreret med en nanofiber array, MACME array. Andet, kvantitative image-baserede encellede fænotyper blev udført50 til at vurdere individuelle cellulære resultater og adfærd ændres af forskellige biokemiske...

Humane pluripotente stamceller (hPSCs)1,2 selvstændige forny ubegrænset og differentiere sig til forskellige væv slægter, som kunne revolutionere udvikling af lægemidler, celle-baserede behandlinger, vævsmanipulering og regenerativ medicin 3 , 4 , 5 , 6. generel kultur retter og mikrotiter plader, men er ikke designet til at aktiverer præcise fysiske og kemiske celle manipulation på cellulært niveau med vifte af nano - til mikro-meter, som er en kritisk faktor for cellulære ekspansion, selvfornyelse og differentiering. For at løse denne ulempe, har undersøgelser undersøgt roller af cellulære microenvironments i reguleringen af celle-skæbne beslutninger og celle funktioner4. I de senere år er et stigende antal undersøgelser blevet gennemført for at rekonstruere cellulære microenvironments in vitro-7,8. Nano - og mikro-fabrication processer har etableret disse microenvironments gennem manipulation af kemiske9,10,11,12,13, 14,15,16,17 og fysiske18,19,20 miljømæssige stikord. Indtil nu var der ingen rapporter til systematisk undersøge de underliggende mekanismer i kemiske og fysiske miljømæssige stikord på celle-skæbne beslutninger og funktioner inden for en enkelt platform.
Her introducerer vi en strategi baseret på enkle designprincipper til at etablere en robust screening platform (figur 1). Først, vi beskriver proceduren udvikling af en integreret platform for at skabe alsidig, kunstige cellulære microenvironments ved hjælp af en nanofiber array og en mikrofluid struktur: The multipleksede kunstige cellulære mikromiljø (MACME) array (Figur 1A og 2A). Nanofiber matrix har 12 forskellige microenvironments i forskellige kombinationer af nanofiber materialer og tætheder. Electrospinning blev brugt til at fremstille nanofibers. Nanofiber materialer såsom polystyren (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22og gelatine (GT)23, var designet til at teste deres kemiske egenskaber, som kan påvirke celle vedhæftning og vedligeholdelse af pluripotency ( Figur 2B). Nanofiber tætheder blev varieret ved at ændre electrospinning tid og de genererede nanofibers blev defineret ifølge deres tætheder (DNF, med D = XLow/lav/Mid/High). Mikrofluid struktur er sammensat af Polydimethylsiloxan (PDMS) husly 48 cellekultur kamre, som kan placeres langs 96-brønd mikrotiterplade standard dimensioner. PDMS er et biokompatibelt og gas-udskiftelige polymer generelt bruges til at fremstille mikrofluid enheder24. Hver mikrofluid kanal blev designet til at være 700-µm wide og 8,4-mm lang og havde to fjorde på sine kanter (tabel 1). Afdelingerne havde forskellige højder (250, 500 og 1000 µm) til at manipulere de oprindelige celle-seeding tætheder (0,3 og 0,6 1,2 × 105 celler/cm2), som kan korrelere med overlevelse, spredning og differentiering af hPSCs25 (Figur 2C). Antallet af celler seedede i et kammer er proportional med kolonnen tæthed over salen gulvet, og dermed første celle såning tæthed blev kontrolleret ved at indføre den samme cellesuspension i kultur kamre med forskellige højder. Alle kanaler blev designet til at være ≥ 250 µm høje26 at minimere virkningerne af lav-oxygen spænding27 og shear stress28 på cellerne. Kanalen højder af 250, 500 og 1000 µm er forkortet her som XCD med X = Low, Mid, og høj, henholdsvis. Miljøer med distinct nanofiber tætheder og første celle-seeding tætheder blev forkortet som "Material_NF density_Cell tæthed" (f.eks. GT_HighNF_HighCD: et miljø præget af high-density GT nanofibers og høj oprindelige celle såning tæthed).
Efterfølgende, beskriver vi, hvordan du udføre én celle analyser til systematisk undersøge celle adfærd som reaktion på miljømæssige faktorer (figur 1B). Som en proof-of-concept identificeret vi den optimal cellulære miljø for hPSC selvfornyelse, hvilket er en vigtig funktion for hPSC vedligeholdelse (figur 1B)29. Billed-baserede flowcytometri, efterfulgt af statistiske analyser, giver mulighed for kvantitativ tolkning af individuelle cellulære fænotypiske svar til cellulære miljøer. Blandt en række cellulære funktioner indeholder dette white paper en detaljeret procedure for at identificere de optimale betingelser for at opretholde hPSC selvfornyelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="699">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polystyrene (PS)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#182435</td>
			<td style="width:231px;">Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polymethylglutarimide (PMGI)</td>
			<td style="width:135px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">G113113</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin (GT)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G2625</td>
			<td style="width:231px;">From porcine skin, type A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:135px;">Doe Corning Toray</td>
			<td style="width:119px;">#1064291</td>
			<td style="width:231px;">PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">OpenSCAD</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">AutoCAD 2014</td>
			<td style="width:135px;">Autodesk</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3D printer, AGILISTA-3000</td>
			<td style="width:135px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UV-curable resin, AR-M2</td>
			<td style="width:135px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is used for 3D printing by Agilista.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#338826</td>
			<td style="width:231px;">&#8805;99.99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#270989</td>
			<td style="width:231px;">Anhydrous, 99.8%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#401757</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MSP-30T</td>
			<td style="width:135px;">Vacuum Device</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">Magnetron sputtering machine</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Nunc OmniTray</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#242811</td>
			<td style="width:231px;">This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Gun-type corona discharge machine</td>
			<td style="width:135px;">Shinko Electric &#38; Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">CFG-500</td>
			<td style="width:231px;">This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 &#34;Assembly of the MACME arrays&#34; in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:135px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS-05SZ</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stainless-steel blunt needle (23-gauge)</td>
			<td style="width:135px;">Nipro</td>
			<td style="width:119px;">#2166</td>
			<td style="width:231px;">Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High-voltage power supply</td>
			<td style="width:135px;">TechDempaz</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride</td>
			<td style="width:135px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">W001</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Hydroxysuccinimide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#56480</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">#354277</td>
			<td style="width:231px;">This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellAdhere Vitronectin, Human, Solution</td>
			<td style="width:135px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#07004</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TeSR-E8</td>
			<td style="width:135px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#05940</td>
			<td style="width:231px;">Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">#253-00513</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#12605028</td>
			<td style="width:231px;">This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10086</td>
			<td style="width:231px;">The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A13203</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oct-3/4 Antibody (C-10)</td>
			<td style="width:135px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-5279</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (DyLight 488)</td>
			<td style="width:135px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab96875</td>
			<td style="width:231px;">This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">ECLIPSE Ti-E</td>
			<td style="width:135px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4&#215;/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td style="width:135px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CellProfiler, Version 2.1.0</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">R</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Cluster 3.0</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Java TreeView</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">H9 human embryonic stem cell</td>
			<td style="width:135px;">WiCell Stem Cell Bank</td>
			<td style="width:119px;">WA09</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a multiplexed artificial cellular microenvironment array

Cellulære microenvironments består af en række stikord, som vækstfaktorer, ekstracellulære matricer og intercellulære interaktioner. Disse signaler er godt orkestreret og er afgørende i regulerer cellefunktioner i et levende system. Selv om en række forskere har forsøgt at undersøge sammenhængen mellem miljøfaktorer og ønskede cellulære funktioner, stadig meget ukendt. Dette er hovedsagelig på grund af manglen på en korrekt metode til at efterligne sådanne miljømæssige stikord i in vitro, og samtidig tester forskellige miljømæssige stikord på celler. Her rapporterer vi en integreret platform af mikrofluid kanaler og en nanofiber array, efterfulgt af high-indhold single-celle analyse, for at undersøge stamceller fænotyper ændret af forskellige miljøfaktorer. For at demonstrere anvendelsen af denne platform, fokuserer denne undersøgelse på fænotyper af selvstændig fornyelse humane pluripotente stamceller (hPSCs). Vi præsenterer her, forberedelse procedurer for en nanofiber vifte og mikrofluid struktur i fabrikation af en multipleksede kunstige cellulære mikromiljø (MACME) array. Derudover er overordnede trin af encellede profilering, celle farvning med flere fluorescerende markører, flere fluorescens imaging og statistiske analyser, beskrevet.

MACME arrays: Design og produktion: I kombination med nanofiber teknologi brugte vi mikrofluid cellekultur og screeningsteknikker ansat tidligere at identificere optimale betingelser for hPSC selvfornyelse eller differentiering35,36 (figur 1). Dette er velegnet til oprettelse af robust høj overførselshastighed cellebaserede assays, fordi den celle kultur kamre, og betingelser er net...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array at JoVE.com

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Fabrikation af en multiplex kunstige cellulære mikromiljø Array

I denne artikel beskrives den detaljerede metode til at forberede en multipleksede kunstige cellulære mikromiljø (MACME) array for høj overførselshastighed manipulation af fysiske og kemiske cues efterligner i vivo cellulære microenvironments og til identificere den optimal cellulære miljø for humane pluripotente stamceller (hPSCs) med enkelt-celle profilering.

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Montering af Semi-kunstige Molekylær Machine og dens anvendelse til påvisning af DNA-skader

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Hollow mikro-baserede sensor for Multiplexed Transdermal Elektrokemisk Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Syntese af en Intein-medieret Kunstig Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

Tissue Engineering af Tumor Stromal mikromiljø med Application til cancercelleinvasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polymere mikronålarray Fabrication ved Fotolitografi

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Fremstilling af et bioaktivt, PCL-baserede &quot;Self-montering&quot; formhukommelse polymerskelet

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikrofluid Platform med Multiplexed Elektronisk Detection for fysisk sporing af partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fremstilling og karakterisering af optiske væv Phantoms indeholdende Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...