Name: fabrication of a multiplexed artificial cellular microenvironment array
Uploaded: 2018-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array at JoVE.com

Wir danken Prof. N. Nakatsuji bei iCeMS, Kyoto University, für die Bereitstellung von humanen ES-Zellen. Wir danken auch Prof. A. Maruyama am Tokyo Institute of Technology für seine Unterstützung im Umgang mit dem Rasterkraftmikroskop. Finanzierung wurde großzügig zur Verfügung gestellt von der Japan Society for Promotion of Science (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 und 24656502); auch wurde von der neuen Energie and Industrial Technology Development Organization (NEDO) und der Terumo Life Science Foundation finanziert. WPI-iCeMS stützt sich auf die World Premier International Research Center Initiative (WPI), Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan. Ein Teil dieser Arbeit wurde von Kyoto Universität Nanotechnologie Hub und der AIST Nano-Verarbeitungsanlage in "Nanotechnologie Plattform Förderprojekt" MEXT, Japan unterstützt.

(1) Herstellung von MACME Array
Hinweis: Alle Materialien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
<ol><li>
Vorbereitung von Masken für eine Nanofaser-Array und eine Form für eine mikrofluidische Struktur
	<ol>
<li>Erstellen Sie dreidimensionale (3D) Bilder von Masken für die Nanofaser-Arrays und Formen für mikrofluidischen Strukturen mittels 3D Computergraphik-Software-Pakete (Tabelle 1) verwendet. Hinweis: Die 3D-Bilder ...

Dieses Protokoll zeigt die erste Screening-Methode um eine robuste Kultursystems für die Pflege des qualifizierten hPSCs zu etablieren. Erstens beschrieben wir, wie man eine Plattform mit verschiedenen künstlichen ECMs und Zelle dichten mithilfe eines mikrofluidischen Geräts integriert mit einem Nanofaser-Array, das Array MACME Aussaat vorzubereiten. Zweite, quantitative bildbasierte einzellige Phänotypisierung war durchgeführten50 Bewertung einzelner zellulärer Ergebnisse und Verhaltensweis...

Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs)1,2 selbst unbegrenzt zu erneuern und zu differenzieren in verschiedene Gewebe Abstammungen, die Entwicklung von Medikamenten, zellbasierte Therapien, Gewebetechnik und regenerative Medizin revolutionieren könnte 3 , 4 , 5 , 6. allgemeine Kultur Gerichte und Mikrotiter-Platten, jedoch sollen nicht präzise physikalische und chemische Zelle Manipulation auf zellulärer Ebene mit dem Bereich der Nano -, Mikro-Meter, aktivieren, wodurch ein entscheidender Faktor für die zelluläre Expansion ist, Selbsterneuerung und Differenzierung. Um diesen Nachteil zu beheben, haben Studien die Rolle der zellulären Mikroumgebungen bei der Regulierung der Zelle-Schicksal Entscheidungen und Zelle Funktionen4untersucht. In den letzten Jahren haben eine wachsende Zahl von Studien durchgeführt, um zelluläre Mikroumgebungen in-vitro-7,8zu rekonstruieren. Nano und Mikro-Herstellungsprozesse haben diese Mikroumgebungen durch die Manipulation der chemischen9,10,11,12,13etabliert, 14,15,16,17 und physischen18,19,20 ökologische Hinweise. Bis jetzt gab es keine Berichte, die zugrunde liegenden Mechanismen der chemischen und physikalischen Umwelt Hinweise auf Zelle-Schicksal Entscheidungen und Funktionen innerhalb einer einzigen Plattform systematisch zu untersuchen.
Hier stellen wir eine Strategie basiert auf einfachen Design-Prinzipien, eine robuste Screening-Plattform (Abbildung 1) zu etablieren. Zunächst beschreiben wir die Entwicklung Vorgehensweise einer integrierten Plattform für die Erstellung vielseitiger, künstliche zellulärer Mikroumgebungen mithilfe einer Nanofaser-Array und mikrofluidischen Struktur: die gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME) Array (Abbildung 1A , 2A). Das Nanofaser-Array enthält 12 verschiedene Mikroumgebungen in unterschiedlichen Kombinationen von Nanofaser Materialien und dichten. Elektrospinnen wurde zur Nanofasern zu fabrizieren. Die Nanofaser-Materialien, wie Polystyrol (PS)21, Polymethylglutarimide (PMGI)22und Gelatine (GT)23, wurden entwickelt, um ihrer chemischen Eigenschaften testen die Zelladhäsion und Aufrechterhaltung der Pluripotenz ( beeinträchtigen könnten Abbildung 2B). Nanofaser dichten waren vielfältig durch Elektrospinnen Zeit ändern und die generierten Nanofasern wurden nach ihrer Dichte definiert (DNF, mit D = XLow/Low/Mid/High). Die mikrofluidischen Struktur besteht aus Polydimethylsiloxan (PDMS) beherbergen 48 Zellkultur Kammern, die entlang die Standardabmessungen der 96-Well Mikrotestplatte positioniert werden können. PDMS ist eine biokompatible und Gas-austauschbare Polymer in der Regel zur Herstellung von mikrofluidischen Geräten24verwendet. Jeden mikrofluidischen Kanal wurde entwickelt, um 700 µm breit und 8,4 mm lang und hatte zwei Buchten an den Rändern (Tabelle 1). Die Kammern hatten unterschiedliche Höhen (250, 500 und 1000 µm), die erste Zelle Aussaat dichten (0,3 und 0,6 1,2 × 105 Zellen/cm2), die mit überleben, Proliferation und Differenzierung von hPSCs25 korrelieren könnte zu manipulieren (Abbildung 2C). Die Anzahl der Zellen ausgesät in eine Kammer ist proportional zu der Spalte Dichte über dem Kammerboden, und somit erste Zelle Dichte Aussaat wurde durch die Einführung der gleichen Zellsuspension in Kultur Kammern mit unterschiedlichen Höhen gesteuert. Alle Kanäle wurden entwickelt, um ≥ 250 µm hohen26 werden zur Minimierung der Auswirkungen von sauerstoffarmen Spannung27 und Schubspannung28 auf die Zellen. Kanal-Höhen von 250, 500 und 1000 µm werden hier abgekürzt als XCD mit X = Low, Mid, und hoch, beziehungsweise. Umgebungen mit unterschiedlichen Nanofaser dichten und erste Zelle Aussaat dichten wurden als "Material_NF-Density_Cell-Dichte" verkürzt (z. B. GT_HighNF_HighCD: ein Umfeld mit hoher Dichte GT Nanofasern und hohe anfängliche Zelle-seeding geprägt Dichte).
Anschließend beschreiben wir, wie einzellige Analysen um Zellen Verhalten als Reaktion auf Umweltfaktoren (Abbildung 1B) systematisch zu untersuchen. Als ein Proof-of-Concept identifizierten wir die optimale zelluläre Umgebung hPSC Selbsterneuerung, das ist eine zentrale Funktion für hPSC Wartung (Abbildung 1B)29. Image-basierte zytometrie, gefolgt von statistischen Analysen ermöglicht quantitative Interpretation der einzelnen zellulären phänotypischen Antworten auf zelluläre Umgebungen. Unter einer Vielzahl von zellulären Funktionen bietet dieses Papier ein detailliertes Verfahren um die optimalen Bedingungen für die Aufrechterhaltung der hPSC Selbsterneuerung zu identifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="699">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polystyrene (PS)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#182435</td>
			<td style="width:231px;">Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polymethylglutarimide (PMGI)</td>
			<td style="width:135px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">G113113</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin (GT)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G2625</td>
			<td style="width:231px;">From porcine skin, type A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:135px;">Doe Corning Toray</td>
			<td style="width:119px;">#1064291</td>
			<td style="width:231px;">PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">OpenSCAD</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">AutoCAD 2014</td>
			<td style="width:135px;">Autodesk</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3D printer, AGILISTA-3000</td>
			<td style="width:135px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UV-curable resin, AR-M2</td>
			<td style="width:135px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is used for 3D printing by Agilista.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#338826</td>
			<td style="width:231px;">&#8805;99.99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#270989</td>
			<td style="width:231px;">Anhydrous, 99.8%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#401757</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MSP-30T</td>
			<td style="width:135px;">Vacuum Device</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">Magnetron sputtering machine</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Nunc OmniTray</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#242811</td>
			<td style="width:231px;">This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Gun-type corona discharge machine</td>
			<td style="width:135px;">Shinko Electric &#38; Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">CFG-500</td>
			<td style="width:231px;">This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 &#34;Assembly of the MACME arrays&#34; in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:135px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS-05SZ</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stainless-steel blunt needle (23-gauge)</td>
			<td style="width:135px;">Nipro</td>
			<td style="width:119px;">#2166</td>
			<td style="width:231px;">Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High-voltage power supply</td>
			<td style="width:135px;">TechDempaz</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride</td>
			<td style="width:135px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">W001</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Hydroxysuccinimide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#56480</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">#354277</td>
			<td style="width:231px;">This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellAdhere Vitronectin, Human, Solution</td>
			<td style="width:135px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#07004</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TeSR-E8</td>
			<td style="width:135px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#05940</td>
			<td style="width:231px;">Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">#253-00513</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#12605028</td>
			<td style="width:231px;">This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10086</td>
			<td style="width:231px;">The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A13203</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oct-3/4 Antibody (C-10)</td>
			<td style="width:135px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-5279</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (DyLight 488)</td>
			<td style="width:135px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab96875</td>
			<td style="width:231px;">This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">ECLIPSE Ti-E</td>
			<td style="width:135px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4&#215;/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td style="width:135px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CellProfiler, Version 2.1.0</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">R</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Cluster 3.0</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Java TreeView</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">H9 human embryonic stem cell</td>
			<td style="width:135px;">WiCell Stem Cell Bank</td>
			<td style="width:119px;">WA09</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a multiplexed artificial cellular microenvironment array

Zelluläre Mikroumgebungen bestehen aus einer Vielzahl von Signalen, wie Wachstumsfaktoren, extrazellulären Matrizen und interzelluläre Wechselwirkungen. Diese Hinweise sind gut inszeniert und von entscheidender Bedeutung bei der Regulierung der Zellfunktionen in ein lebendiges System. Obwohl eine Reihe von Forschern versucht haben, die Korrelation zwischen Umweltfaktoren und gewünschte Zellfunktionen zu untersuchen, bleibt noch viel Unbekanntes. Dies ist vor allem auf das Fehlen einer richtigen Methodik derartige ökologische Hinweise in Vitrozu imitieren und gleichzeitig testen verschiedene ökologische Hinweise auf Zellen. Hier berichten wir über eine integrierte Plattform von mikrofluidischen Kanälen und einer Nanofaser-Palette, gefolgt von hoch-einzellige Inhaltsanalyse, Stammzell-Phänotypen verändert durch verschiedene Umweltfaktoren zu untersuchen. Um die Anwendung dieser Plattform zu demonstrieren, konzentriert sich diese Studie auf die Phänotypen menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) selbst zu erneuern. Hier präsentieren wir Ihnen die Vorbereitung-Verfahren für eine Nanofaser-Array und mikrofluidischen Struktur bei der Herstellung eines Arrays gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME). Darüber hinaus werden allgemeine Schritte der Profilierung, Zelle färben mit mehreren fluoreszierenden Marker, mehrere Fluoreszenz-Bildgebung und statistische Analysen, einzellige beschrieben.

MACME Arrays: Design und Herstellung: In Kombination mit Nanofaser-Technologie verwendeten wir mikrofluidischen Zellkultur und screening-Verfahren zuvor eingesetzt, um optimale Bedingungen für hPSC Selbsterneuerung und Differenzierung35,36 (Abbildung 1) zu identifizieren. Dies eignet sich gut für den Aufbau robuster Hochdurchsatz-zellbasierte Assays, weil die Zelle Kultur Kammern un...

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Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Herstellung eines Multiplex künstliche zellulären Mikroumgebung Arrays

Dieser Artikel beschreibt die detaillierte Methode ein Array gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME) Vorbereitung für Hochdurchsatz-Manipulation von physikalischen und chemischen imitiert in Vivo zellulären Mikroumgebungen Queues und Identifizieren Sie die optimale zelluläre Umgebung für menschliche pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einzelligen profiling.

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Research

JoVE Journal

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