Name: fabrication of a multiplexed artificial cellular microenvironment array
Uploaded: 2018-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array at JoVE.com

हम iCeMS, क्योटो विश्वविद्यालय में प्रो एन Nakatsuji, मानव ES कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए धंयवाद । हम भी टोक्यो प्रौद्योगिकी संस्थान में प्रो Maruyama परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोप के उपयोग में उनके समर्थन के लिए धंयवाद । धन उदारता विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी द्वारा प्रदान की गई (JSPS; २२३५०१०४, २३६८१०२८, २५८८६००६, और २४६५६५०२); नई ऊर्जा एवं औद्योगिक प्रौद्योगिकी विकास संगठन (नेदो) और Terumo लाइफ साइंस फाउंडेशन द्वारा भी धन प्रदान किया गया । WPI-iCeMS विश्व प्रीमियर अंतर्राष्ट्रीय अनुसंधान केंद्र पहल (WPI), शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MEXT), जापान द्वारा समर्थित है । इस काम का एक हिस्सा क्योटो विश्वविद्यालय नैनो हब और MEXT, जापान द्वारा प्रायोजित "नैनो प्लेटफ़ॉर्म प्रोजेक्ट" में AIST नैनो-प्रोसेसिंग सुविधा द्वारा समर्थित किया गया था ।

1. MACME सरणी का निर्माण
नोट: सभी सामग्री और उपकरण सामग्री तालिका में सूचीबद्ध हैं ।
<ol><li>
एक nanofiber सरणी और एक microfluidic संरचना के लिए एक सांचे में ढालना के लिए मास्क की तैयारी
	<ol>
<li>3 डी-कंप्यूटर ग्राफि...

यह प्रोटोकॉल योग्य hPSCs के रखरखाव के लिए एक सुदृढ़ संस्कृति प्रणाली स्थापित करने के लिए पहली स्क्रीनिंग विधि को दर्शाता है । सबसे पहले, हम एक nanofiber सरणी, MACME सरणी के साथ एकीकृत एक microfluidic डिवाइस का उपयोग करके विव...

मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs)1,2 स्वयं को सीमित रूप से नए सिरे से और विभिंन ऊतक वंश है, जो दवा के विकास में क्रांतिकारी बदलाव सकता है, कोशिका आधारित चिकित्सा, ऊतक इंजीनियरिंग, और अपक्षयी दवा में अंतर 3 , 4 , 5 , 6. सामांय संस्कृति व्यंजन और microtiter प्लेटें, तथापि, नैनो की सीमा के साथ सेलुलर स्तर पर सटीक शारीरिक और रासायनिक सेल हेरफेर सक्षम करने के लिए डिजाइन नहीं कर रहे है माइक्रो मीटर, जो सेलुलर विस्तार के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, स्व नवीकरण, और भेदभाव । इस खामी को हल करने के लिए, अध्ययनों ने सेल-भाग्य फैसलों और सेल4कार्यों को विनियमित करने में सेलुलर microenvironments की भूमिकाओं की जांच की है । हाल के वर्षों में, अध्ययनों की एक बढ़ती हुई संख्या में सेलुलर microenvironments पुनर्निर्माण करने के लिए आयोजित किया गया है इन विट्रो7,8. नैनो और सूक्ष्म निर्माण प्रक्रियाओं रासायनिक9,10,11,12,13के हेरफेर के माध्यम से इन microenvironments की स्थापना की है, 14,15,16,17 और शारीरिक18,19,20 पर्यावरण cues । अब तक, वहां के लिए व्यवस्थित सेल पर रासायनिक और भौतिक पर्यावरण cues के अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए कोई रिपोर्ट थे भाग्य फैसलों और कार्यों के भीतर एक ही मंच ।
यहां, हम एक मजबूत स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म (चित्रा 1) स्थापित करने के लिए सरल डिजाइन सिद्धांतों के आधार पर एक रणनीति का परिचय । सबसे पहले, हम एक nanofiber सरणी और एक microfluidic संरचना का उपयोग करके बहुमुखी, कृत्रिम सेलुलर microenvironments बनाने के लिए एक एकीकृत मंच के विकास की प्रक्रिया का वर्णन: मल्टीप्लेक्स कृत्रिम सेलुलर MicroEnvironment (MACME) सरणी (चित्रा 1ए और 2a) । nanofiber सरणी nanofiber सामग्री और घनत्व के संयोजन अलग करने में 12 विभिंन microenvironments है । Electrospinning का उपयोग nanofibers किर करने के लिए किया जाता था । nanofiber सामग्री, जैसे polystyrene (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22, और जिलेटिन (GT)23, उनके रासायनिक गुण है, जो सेल आसंजन और pluripotency के रखरखाव को प्रभावित हो सकता है परीक्षण के लिए डिजाइन किए गए थे ( चित्रा 2बी) । Nanofiber घनत्व electrospinning समय बदलकर विविध थे और उत्पन्न nanofibers उनके घनत्व के अनुसार परिभाषित किए गए थे (DNF, with D = XLow/कम/मध्य/ microfluidic संरचना polydimethylsiloxane (PDMS) ४८ सेल-संस्कृति कक्षों, जो ९६-well microplate के मानक आयामों के साथ तैनात किया जा सकता है बंदरगाह से बना है । PDMS एक और संगत है गैस विनिमेय बहुलक आम तौर पर microfluidic उपकरणों24बनाना इस्तेमाल किया । प्रत्येक microfluidic चैनल को ७००-µm चौड़ा और ८.४-mm लंबा बनाया गया था और इसके किनारों (टेबल 1) पर दो की सुविधा थी । कक्षों अलग ऊंचाइयों था (२५०, ५००, और १००० µm) प्रारंभिक सेल में हेरफेर करने के लिए घनत्व सीडिंग (०.३, ०.६, और १.२ × 105 कोशिकाओं/मुख्यमंत्री2), जो अस्तित्व के साथ सहसंबंधी हो सकता है, प्रसार, और hPSCs के भेदभाव25 (चित्रा 2सी) । एक कक्ष में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या चैंबर फर्श के ऊपर स्तंभ घनत्व के लिए आनुपातिक है, और इस प्रकार प्रारंभिक कोशिका बोने घनत्व अलग ऊंचाइयों के साथ संस्कृति मंडलों में एक ही सेल निलंबन शुरू करने से नियंत्रित किया गया था । सभी चैनलों के लिए डिज़ाइन किया गया ≥ २५०-µm-उच्च26 कम ऑक्सीजन तनाव के प्रभाव को कम करने के लिए27 और कतरनी28 कोशिकाओं पर तनाव. २५०, ५००, और १००० µm के चैनल हाइट्स यहां एक्स के साथ XCD के रूप में संक्षिप्त कर रहे है = कम, मध्य, और उच्च, क्रमशः । अलग nanofiber घनत्व और प्रारंभिक कोशिका बोने घनत्व के साथ वातावरण "Material_NF density_Cell घनत्व" (जैसे, GT_HighNF_HighCD: एक उच्च घनत्व जीटी nanofibers और उच्च प्रारंभिक कोशिका बोने की विशेषता पर्यावरण के रूप में छोटा किया गया घनत्व) ।
बाद में, हम वर्णन कैसे एकल सेल विश्लेषण करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए पर्यावरण कारकों के जवाब में सेल व्यवहार की जांच (चित्रा 1ख) । एक सबूत की अवधारणा के रूप में, हम hPSC आत्म नवीकरण, जो hPSC रखरखाव (चित्रा 1ख)29के लिए एक महत्वपूर्ण कार्य है के लिए इष्टतम सेलुलर वातावरण की पहचान की । छवि आधारित cytometry, सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद, सेलुलर वातावरण के लिए व्यक्तिगत सेलुलर phenotypic प्रतिक्रियाओं की मात्रात्मक व्याख्या के लिए अनुमति देता है । सेलुलर कार्यों की एक किस्म के बीच, इस कागज hPSC आत्म नवीकरण को बनाए रखने के लिए इष्टतम स्थितियों की पहचान करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="699">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polystyrene (PS)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#182435</td>
			<td style="width:231px;">Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polymethylglutarimide (PMGI)</td>
			<td style="width:135px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">G113113</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin (GT)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G2625</td>
			<td style="width:231px;">From porcine skin, type A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:135px;">Doe Corning Toray</td>
			<td style="width:119px;">#1064291</td>
			<td style="width:231px;">PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">OpenSCAD</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">AutoCAD 2014</td>
			<td style="width:135px;">Autodesk</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3D printer, AGILISTA-3000</td>
			<td style="width:135px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UV-curable resin, AR-M2</td>
			<td style="width:135px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is used for 3D printing by Agilista.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#338826</td>
			<td style="width:231px;">&#8805;99.99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#270989</td>
			<td style="width:231px;">Anhydrous, 99.8%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#401757</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MSP-30T</td>
			<td style="width:135px;">Vacuum Device</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">Magnetron sputtering machine</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Nunc OmniTray</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#242811</td>
			<td style="width:231px;">This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Gun-type corona discharge machine</td>
			<td style="width:135px;">Shinko Electric &#38; Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">CFG-500</td>
			<td style="width:231px;">This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 &#34;Assembly of the MACME arrays&#34; in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:135px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS-05SZ</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stainless-steel blunt needle (23-gauge)</td>
			<td style="width:135px;">Nipro</td>
			<td style="width:119px;">#2166</td>
			<td style="width:231px;">Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High-voltage power supply</td>
			<td style="width:135px;">TechDempaz</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride</td>
			<td style="width:135px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">W001</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Hydroxysuccinimide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#56480</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">#354277</td>
			<td style="width:231px;">This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellAdhere Vitronectin, Human, Solution</td>
			<td style="width:135px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#07004</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TeSR-E8</td>
			<td style="width:135px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#05940</td>
			<td style="width:231px;">Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">#253-00513</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#12605028</td>
			<td style="width:231px;">This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10086</td>
			<td style="width:231px;">The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A13203</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oct-3/4 Antibody (C-10)</td>
			<td style="width:135px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-5279</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (DyLight 488)</td>
			<td style="width:135px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab96875</td>
			<td style="width:231px;">This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">ECLIPSE Ti-E</td>
			<td style="width:135px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4&#215;/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td style="width:135px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CellProfiler, Version 2.1.0</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">R</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Cluster 3.0</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Java TreeView</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">H9 human embryonic stem cell</td>
			<td style="width:135px;">WiCell Stem Cell Bank</td>
			<td style="width:119px;">WA09</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a multiplexed artificial cellular microenvironment array

सेलुलर microenvironments कई संकेतों की एक किस्म से मिलकर बनता है, जैसे वृद्धि कारकों, extracellular मैट्रिक्स, और सेलुलर बातचीत. इन cues अच्छी तरह से आर्केस्ट्रा और एक जीवित प्रणाली में सेल कार्यों को विनियमित करने में महत्वपूर्ण हैं । हालांकि शोधकर्ताओं के एक नंबर पर्यावरण कारकों और वांछित सेलुलर कार्यों के बीच संबंध की जांच करने का प्रयास किया है, बहुत अज्ञात रहता है । यह काफी हद तक एक उचित पद्धति की कमी के कारण है इन विट्रो मेंऐसे पर्यावरणीय cues नकल, और एक साथ कोशिकाओं पर विभिंन पर्यावरणीय cues परीक्षण । यहां, हम microfluidic चैनल के एक एकीकृत मंच और एक nanofiber सरणी, उच्च सामग्री एकल सेल विश्लेषण के बाद की रिपोर्ट, स्टेम सेल की जांच करने के लिए विशिष्ट पर्यावरणीय कारकों द्वारा बदल phenotypes । इस मंच के आवेदन को प्रदर्शित करने के लिए, यह अध्ययन स्व-नवीनीकरण मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) के phenotypes पर केंद्रित है । यहां, हम एक nanofiber सरणी के लिए तैयारी प्रक्रियाओं और एक मल्टीप्लेक्स कृत्रिम सेलुलर MicroEnvironment (MACME) सरणी के निर्माण में microfluidic संरचना प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, एकल सेल रूपरेखा के समग्र कदम, कई फ्लोरोसेंट मार्करों, एकाधिक प्रतिदीप्ति इमेजिंग, और सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ सेल धुंधला, वर्णित हैं ।

MACME arrays: डिजाइन और निर्माण: nanofiber प्रौद्योगिकी के साथ संयोजन में, हम microfluidic सेल संस्कृति और स्क्रीनिंग पहले नियोजित hPSC स्व के लिए इष्टतम स्थितियों के नवीकरण या भेदभाव३५,?...

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Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

एक मल्टीप्लेक्स कृत्रिम सेलुलर MicroEnvironment सरणी का निर्माण

इस लेख में vivo सेलुलर microenvironments में नकल उतार शारीरिक और रासायनिक cues के उच्च प्रवाह हेरफेर के लिए एक मल्टीप्लेक्स कृत्रिम सेलुलर MicroEnvironment (MACME) सरणी तैयार करने के लिए विस्तृत पद्धति का वर्णन है और एकल सेल रूपरेखा के साथ मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) के लिए इष्टतम सेलुलर वातावरण की पहचान ।

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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dynamics ...

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