Name: fabrication of a multiplexed artificial cellular microenvironment array
Uploaded: 2018-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array at JoVE.com

Agradecemos o Prof N. Nakatsuji no iCeMS, Universidade de Quioto, para fornecer células ES humanas. Também agradecemos a Prof A. Maruyama no Tokyo Institute of Technology pelo seu apoio na utilização do microscópio de força atômica. O financiamento foi generosamente fornecido pela sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 e 24656502); financiamento também foi fornecido pela nova energia e organização de desenvolvimento de tecnologia Industrial (NEDO) e a Fundação de Ciências da vida Terumo. O iCeMS-WPI é suportado pelo mundo Premier International Research Centre iniciativa (WPI), o Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT), Japão. Uma parte deste trabalho foi apoiada pelo Hub de nanotecnologia de Universidade de Quioto e as instalações de processamento de Nano AIST no projeto"nanotecnologia plataforma" patrocinado pelo MEXT, Japão.

1. fabricação de matriz MACME
Nota: Todos os materiais e equipamentos estão listados na tabela de materiais.
<ol><li>
Elaboração de máscaras para uma matriz de nanofibras e um molde para uma estrutura microfluídicos
	<ol>
<li>Crie imagens de tridimensionais (3D) de máscaras usadas para as matrizes de nanofibras e moldes para estruturas microfluidic usando pacotes de software 3D-computação gráfica (tabela 1). Nota: As imagens 3D...

Este protocolo demonstra o primeiro método de triagem para estabelecer um sistema robusto de cultura para a manutenção de hPSCs qualificado. Primeiro, descrevemos como preparar uma plataforma com diversos ECMs artificiais e célula densidades de semeadura usando um dispositivo microfluidic integrado com uma matriz de nanofibras, a matriz MACME. Segunda, quantitativa baseada em imagem única célula fenotipagem foi realizada50 para avaliar os resultados individuais de celulares e comportamentos ...

De1,(hPSCs) as células-tronco pluripotentes humanas2 auto renovar ilimitadamente e se diferenciar em várias linhagens de tecido, que poderiam revolucionar o desenvolvimento de drogas, terapias baseadas em células, engenharia de tecidos e medicina regenerativa 3 , 4 , 5 , 6. pratos de cultura geral e placas de microtitulação, no entanto, não são projetadas para permitir a manipulação de célula precisa de física e química a nível celular, com o intervalo de nano - para micrometros, que é um fator crítico para a expansão celular, auto-renovação e diferenciação. Para resolver este inconveniente, estudos têm investigado os papéis do microambiente celular na regulação da célula-destino decisões e célula funções4. Nos últimos anos, um número crescente de estudos têm sido realizado para reconstruir o microambiente celular em vitro7,8. Processos de fabricação de micro e nano estabeleceram esses microambiente através da manipulação de químicos9,10,11,12,13, 14,15,16,17 e19,de física18,20 pistas ambientais. Até agora, não havia nenhum relatórios sistematicamente, investigar os mecanismos subjacentes de pistas ambientais físicas e químicas na célula destino decisões e funções dentro de uma única plataforma.
Aqui, apresentamos uma estratégia baseada em princípios de design simples, para estabelecer uma plataforma robusta de triagem (Figura 1). Primeiro, descrevemos o processo de desenvolvimento de uma plataforma integrada para a criação artificial, versátil microambiente celular usando uma matriz de nanofibras e uma estrutura de microfluidic: matriz de The multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) (Figura 1A e 2A). A matriz de nanofibras tem 12 microambiente diferentes em diferentes combinações de materiais de nanofibras e densidades. Eletrofiação foi usada para fabricar nanofibras. Os materiais de nanofibras, tais como o poliestireno (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22e gelatina (GT)23, foram projetados para testar suas propriedades químicas, que podem afetar a aderência de célula e manutenção da pluripotência ( Figura 2B). Densidades de nanofibras eram variadas, alterando o tempo de eletrofiação e as gerado nanofibras foram definidas de acordo com suas densidades (DNF, com D = XLow/Low/Mid/High). A estrutura de microfluidic é composta de polidimetilsiloxano (PDMS), abrigando 48 câmaras de cultura de células, que podem ser posicionadas junto as dimensões padrão de microplacas de 96 poços. PDMS é um polímero biocompatível e gás-intercambiáveis, geralmente usado para fabricar de dispositivos microfluídicos24. Cada canal microfluidic foi projetado para ser 700-µm de largura e 8,4 mm de comprimento e tinha duas entradas em suas bordas (tabela 1). As câmaras tinham diferentes alturas (250, 500 e 1000 µm) para manipular as iniciais célula-semeadura densidades (0.3, 0.6 e 1.2 × 105 células/cm2), que podem correlacionar com a sobrevivência, proliferação e diferenciação de hPSCs25 (Figura 2C). O número de células semeado em uma câmara é proporcional a densidade da coluna acima do piso da câmara, e, portanto, célula inicial, densidade de semeadura era controlada por introduzir a mesma suspensão de eritrócitos em câmaras de cultura com diferentes alturas. Todos os canais foram projetados para serem ≥ 250 µm-alta26 para minimizar os efeitos da tensão de oxigênio baixo27 e tensão de cisalhamento28 sobre as células. Alturas de canal de 250, 500 e 1000 µm são abreviadas aqui como XCD com X = Low, Mid e alta, respectivamente. Os ambientes com nanofibras distintas densidades e densidades de semeadura de células iniciais foram encurtados como "Densidade de density_Cell de Material_NF" (por exemplo, GT_HighNF_HighCD: um ambiente caracterizado por nanofibras GT de alta densidade e alta inicial célula-semeadura densidade).
Posteriormente, descrevemos como executar análises de célula única para investigar sistematicamente o comportamento da célula em resposta a fatores ambientais (Figura 1B). Como um prova de conceito, identificamos o ambiente celular ideal para hPSC auto-renovação, que é uma função chave para hPSC manutenção (Figura 1B)29. Citometria baseada em imagem, seguida de análises estatísticas, permite a interpretação quantitativa de respostas fenotípicas celulares individuais para ambientes celulares. Entre uma variedade de funções celulares, este artigo fornece um procedimento detalhado para identificar as condições ideais para a manutenção de hPSC auto-renovação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="699">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polystyrene (PS)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#182435</td>
			<td style="width:231px;">Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polymethylglutarimide (PMGI)</td>
			<td style="width:135px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">G113113</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin (GT)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G2625</td>
			<td style="width:231px;">From porcine skin, type A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:135px;">Doe Corning Toray</td>
			<td style="width:119px;">#1064291</td>
			<td style="width:231px;">PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">OpenSCAD</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">AutoCAD 2014</td>
			<td style="width:135px;">Autodesk</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3D printer, AGILISTA-3000</td>
			<td style="width:135px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UV-curable resin, AR-M2</td>
			<td style="width:135px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is used for 3D printing by Agilista.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#338826</td>
			<td style="width:231px;">&#8805;99.99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#270989</td>
			<td style="width:231px;">Anhydrous, 99.8%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#401757</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MSP-30T</td>
			<td style="width:135px;">Vacuum Device</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">Magnetron sputtering machine</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Nunc OmniTray</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#242811</td>
			<td style="width:231px;">This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Gun-type corona discharge machine</td>
			<td style="width:135px;">Shinko Electric &#38; Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">CFG-500</td>
			<td style="width:231px;">This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 &#34;Assembly of the MACME arrays&#34; in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:135px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS-05SZ</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stainless-steel blunt needle (23-gauge)</td>
			<td style="width:135px;">Nipro</td>
			<td style="width:119px;">#2166</td>
			<td style="width:231px;">Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High-voltage power supply</td>
			<td style="width:135px;">TechDempaz</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride</td>
			<td style="width:135px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">W001</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Hydroxysuccinimide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#56480</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">#354277</td>
			<td style="width:231px;">This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellAdhere Vitronectin, Human, Solution</td>
			<td style="width:135px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#07004</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TeSR-E8</td>
			<td style="width:135px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#05940</td>
			<td style="width:231px;">Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">#253-00513</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#12605028</td>
			<td style="width:231px;">This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10086</td>
			<td style="width:231px;">The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A13203</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oct-3/4 Antibody (C-10)</td>
			<td style="width:135px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-5279</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (DyLight 488)</td>
			<td style="width:135px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab96875</td>
			<td style="width:231px;">This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">ECLIPSE Ti-E</td>
			<td style="width:135px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4&#215;/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td style="width:135px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CellProfiler, Version 2.1.0</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">R</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Cluster 3.0</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Java TreeView</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">H9 human embryonic stem cell</td>
			<td style="width:135px;">WiCell Stem Cell Bank</td>
			<td style="width:119px;">WA09</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a multiplexed artificial cellular microenvironment array

Microambiente celular consiste em uma variedade de pistas, como fatores de crescimento, matrizes extracelulares e interações intercelulares. Estes tacos são bem orquestrados e são fundamentais na regulação de funções de células em um sistema vivo. Embora um número de pesquisadores tentaram investigar a correlação entre fatores ambientais e funções celulares desejadas, muito permanece desconhecido. Isto é principalmente devido a falta de uma metodologia adequada para imitar tais pistas ambientais em vitroe testar simultaneamente diferentes pistas ambientais nas células. Aqui, nós relatamos uma plataforma integrada de canais microfluídicos e uma matriz de nanofibras, seguido de análise de célula única de alto teor, para examinar células estaminais fenótipos alterados por fatores ambientais distintas. Para demonstrar a aplicação desta plataforma, este estudo centra-se sobre os fenótipos de self que renova as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Aqui, apresentamos os procedimentos de preparação para uma matriz de nanofibras e a estrutura de microfluidic na fabricação de uma matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME). Além disso, as etapas gerais da único-célula de criação de perfil, pilha que mancha com vários marcadores fluorescentes, várias imagens de fluorescência e análises estatísticas, são descritas.

Matrizes MACME: projeto e fabricação: Em combinação com a tecnologia de nanofibras, usamos microfluidic cultura de pilha e triagem técnicas empregadas anteriormente para identificar condições óptimas para hPSC auto-renovação ou diferenciação35,36 (Figura 1). Isto é bem adequado para o estabelecimento de ensaios robustos de cell-based do elevado-throughput porque as câmar...

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Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado

Este artigo descreve a metodologia detalhada para preparar uma matriz multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulação de alta produtividade de física e química sugestões imitando na vivo o microambiente celular e para Identifica o ambiente celular ideal para as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) com perfis de célula única.

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

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