Name: fabrication of a multiplexed artificial cellular microenvironment array
Uploaded: 2018-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array at JoVE.com

Мы благодарим проф. н. Nakatsuji iCeMS, Университет Киото, для обеспечения человеческих клеток ES. Мы также благодарим профессора A. Маруяма в Токийском технологическом институте за его поддержку в использовании атомно-силового микроскопа. Щедро финансировались японского общества для содействия развитию науки (страниц JSP; 22350104, 23681028, 25886006 и 24656502); финансирование было также предоставлено новой энергии и организация развития промышленных технологий (NEDO) и Фондом Terumo науки о жизни. WPI-iCeMS поддерживается мир премьер международного исследовательский центр инициативы (ИЗВ), Министерство образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ), Япония. Часть этой работы была поддержана центром нанотехнологий университета Киото и аист нано-перерабатывающего завода в «Нанотехнологии платформы проекта «авторами МПКСНТ, Япония.

1. Изготовление MACME массива
Примечание: Все материалы и оборудование, перечислены в таблице материалы.
<ol><li>
Подготовка масок для нановолокно массив и плесень microfluidic структуры
	<ol>
<li>Создание трехмерного (3D) изображения маски, используемые для нановолокно массив?...

Этот протокол демонстрирует первый метод скрининга для создания системы надежных культуры для поддержания квалифицированных hPSCs. Во-первых мы описали как подготовить платформу, показывая различные искусственные ECMs и клеток, заполнение плотности, используя microfluidic устройства, интегри?...

Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs)1,2 самостоятельно продлевать неограниченно и дифференцироваться в различные ткани линий, которые могут революционизировать разработки лекарственных средств, на основе ячеек терапии, тканевой инженерии и регенеративной медицины 3 , 4 , 5 , 6. Общая культура блюда и микротитровальных пластин, однако, не предназначены для включения точные физические и химические Сотовый манипуляции на клеточном уровне с диапазоном от nano - для микро метров, который является критическим фактором для сотовых расширения, самообновления и дифференциации. Чтобы устранить этот недостаток, исследования изучили роль клеточных микросреды в регулировании клеток судьба решения и функции клеток4. В последние годы все большее число исследований были проведены реконструировать сотовой микросреды в vitro7,8. Нано - и микро изготовление процессы создали эти микросреды через манипуляции химических9,10,11,12,13, 14,,1516,17 и физической18,19,20 экологические сигналы. До сих пор не поступало систематически расследовать основных механизмов химических и физических экологических сигналы на решений клеток судьба и функций в рамках единой платформы.
Здесь мы представляем стратегию, основанную на принципах простой дизайн для создания надежного скрининга платформы (рис. 1). Во-первых, мы описываем порядок разработки интегрированной платформы для создания универсальный, искусственные сотовой микросреды, используя массив нановолокно и структуру microfluidic: массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME) (Рис. 1A и 2A). Нановолокно массив имеет 12 различных микросреды в разных сочетаниях нановолокно материалов и плотности. Electrospinning была использована для изготовления нановолокон. Нановолокно материалов, таких, как полистирол (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22и23желатин (GT), были разработаны для проверки их химические свойства, которые могут повлиять на клеточной адгезии и поддержания плюрипотентности ( Рисунок 2B). Нановолокно плотности были разнообразны, изменяя время electrospinning и сгенерированный nanofibers были определены согласно их плотности (DNF, с D = XLow/низкий/средний/высокий). Microfluidic структура состоит из укрывательство 48 камеры в культуре клеток, которые могут быть расположены вдоль стандартные размеры 96-луночных микропланшетов полидиметилсилоксан (PDMS). PDMS — обычно используется для изготовления microfluidic приборы24биосовместимых и газ сменный полимер. Каждый канал microfluidic был разработан чтобы быть 700 мкм широкий и 8.4-мм длиной и имел два отверстия на его краях (Таблица 1). Камеры были разной высоты (250, 500 и 1000 мкм) для манипулирования первоначального заполнения ячейки плотности (0,3 0,6 и 1.2 × 105 клеток/см2), которые можно соотнести с выживания, пролиферации и дифференцирования hPSCs25 (Рис. 2C). Количество ячеек в камеру семенами пропорциональна плотности столбца над полом камеры, и таким образом первоначальная клеточная посева плотность контролировался путем введения же суспензию клеток в культуре камер с разных высот. Все каналы были призваны быть ≥ 250 мкм высотой26 для сведения к минимуму воздействия напряжения низкой кислорода27 и касательное напряжение28 на клетки. Канал высот 250, 500 и 1000 мкм сокращенно здесь как XCD с X = низкий, Mid и высокий, соответственно. Средах с собственный нановолокно и первоначальный плотностью заполнения ячейки были укорочены как «Material_NF density_Cell» (например, GT_HighNF_HighCD: окружающей среды, характеризуется высокой плотностью GT нановолокон и высокой начального заполнения ячейки плотность).
Впоследствии мы описывают, как выполнять анализ одноклеточных систематически расследовать поведение клеток в ответ на экологические факторы (рис. 1Б). Как доказательство концепции мы определили оптимальные клеточной среды для hPSC самообновлению, который является одной из ключевых функций для hPSC обслуживание (рис. 1Б)29. На основе образа цитометрии, следуют статистического анализа, позволяет для количественной интерпретации отдельных клеточных реакций фенотипические клеточной среде. Среди различных клеточных функций этот документ содержит подробные процедуры для выявления оптимальных условий для поддержания hPSC самообновлению.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="699">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polystyrene (PS)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#182435</td>
			<td style="width:231px;">Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polymethylglutarimide (PMGI)</td>
			<td style="width:135px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">G113113</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin (GT)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G2625</td>
			<td style="width:231px;">From porcine skin, type A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:135px;">Doe Corning Toray</td>
			<td style="width:119px;">#1064291</td>
			<td style="width:231px;">PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">OpenSCAD</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">AutoCAD 2014</td>
			<td style="width:135px;">Autodesk</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3D printer, AGILISTA-3000</td>
			<td style="width:135px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UV-curable resin, AR-M2</td>
			<td style="width:135px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is used for 3D printing by Agilista.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#338826</td>
			<td style="width:231px;">&#8805;99.99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#270989</td>
			<td style="width:231px;">Anhydrous, 99.8%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#401757</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MSP-30T</td>
			<td style="width:135px;">Vacuum Device</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">Magnetron sputtering machine</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Nunc OmniTray</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#242811</td>
			<td style="width:231px;">This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Gun-type corona discharge machine</td>
			<td style="width:135px;">Shinko Electric &#38; Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">CFG-500</td>
			<td style="width:231px;">This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 &#34;Assembly of the MACME arrays&#34; in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:135px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS-05SZ</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stainless-steel blunt needle (23-gauge)</td>
			<td style="width:135px;">Nipro</td>
			<td style="width:119px;">#2166</td>
			<td style="width:231px;">Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High-voltage power supply</td>
			<td style="width:135px;">TechDempaz</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride</td>
			<td style="width:135px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">W001</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Hydroxysuccinimide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#56480</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">#354277</td>
			<td style="width:231px;">This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellAdhere Vitronectin, Human, Solution</td>
			<td style="width:135px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#07004</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TeSR-E8</td>
			<td style="width:135px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#05940</td>
			<td style="width:231px;">Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">#253-00513</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#12605028</td>
			<td style="width:231px;">This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10086</td>
			<td style="width:231px;">The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A13203</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oct-3/4 Antibody (C-10)</td>
			<td style="width:135px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-5279</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (DyLight 488)</td>
			<td style="width:135px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab96875</td>
			<td style="width:231px;">This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">ECLIPSE Ti-E</td>
			<td style="width:135px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4&#215;/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td style="width:135px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CellProfiler, Version 2.1.0</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">R</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Cluster 3.0</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Java TreeView</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">H9 human embryonic stem cell</td>
			<td style="width:135px;">WiCell Stem Cell Bank</td>
			<td style="width:119px;">WA09</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a multiplexed artificial cellular microenvironment array

Сотовый микросреды состоят из различных сигналов, таких как факторы роста, внеклеточной матрицы и межклеточных взаимодействий. Эти сигналы являются хорошо организованы и имеют решающее значение в регуляции функций клеток в живых систем. Хотя ряд исследователей пытались исследовать взаимосвязь между экологическими факторами и желаемого клеточных функций, многое остается неизвестным. Это во многом обусловлено отсутствием надлежащей методологии имитировать такие экологические сигналы в пробирке, и одновременно проверить различные экологические сигналы на клетки. Здесь мы приводим интегрированной платформы microfluidic каналов и массив нановолокно, следуют высоким содержанием одноклеточных анализа, для изучения стволовых клеток фенотипов, изменено, различных экологических факторов. Чтобы продемонстрировать применение этой платформы, это исследование посвящено фенотипов самостоятельного обновления человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs). Здесь мы представляем процедуры подготовки нановолокно массив и структуру microfluidic в изготовление массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME). Кроме того описаны общие шаги одной ячейки, профилирование, клетки, окрашивание с несколькими флуоресцентные маркеры, несколько изображений флуоресценции и статистического анализа.

MACME массивы: проектирование и изготовление: В сочетании с технологией нановолокно мы использовали microfluidic клеточной культуры и проверки методов, используемых ранее определить оптимальные условия для hPSC самообновлению или дифференциация35,<...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array at JoVE.com

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Изготовление мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения массива

Эта статья описывает подробная методология подготовить массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME) для манипуляции высок объём физико-химические сигналы подражая в vivo сотовой микросреды и Определите оптимальные клеточной среды для человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) с одной ячейкой профилирования.

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Микрофлюидных устройство для воссоздания микроокружение опухоли<em&gt; В Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Low-Cost Cryo-световой микроскопии этап Изготовление для Коррелированные Свет / Электронная микроскопия

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

В пробирке Ассамблеи Semi-искусственные молекулярные машины и его использование для обнаружения повреждений ДНК

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Полые микроиглы на основе датчиков для электрохимических мультиплексный Трансдермальные зондирования

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Синтез интеин-опосредованной искусственного белка гидрогеля

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

Тканевая инженерия из стромальных опухолей микроокружения с применением к клеточной Рак Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Полимерные микроиглы массив Изготовление по фотолитографии

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Изготовление биоактивными, PCL основе &quot;Self-установки&quot; памятью формы полимеров Scaffold

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Микрожидкостных Платформа с уплотненными электронным детектором для пространственного слежения частиц

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Изготовление и характеристика фантомы оптических ткани, содержащие макроструктуры

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...