Name: fabrication of a multiplexed artificial cellular microenvironment array
Uploaded: 2018-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array at JoVE.com

Vi tackar Prof. N. Nakatsuji på iCeMS, Kyoto University, för att ge mänskliga ES-celler. Vi tackar också Prof. A. Maruyama vid Tokyo Institute of Technology för hans stöd i användningen av mikroskopet atomic force. Generöst finansieringen tillhandahölls av Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 och 24656502); finansiering tillhandahålls var också av den nya energin och Industrial Technology Development Organization (NEDO) och Terumo Life Science Foundation. Den WPI-iCeMS stöds av världen Premier International Research Centre initiativ (WPI), ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT), Japan. En del av detta arbete stöds av Kyoto universitet nanoteknik Hub och AIST Nano-Processing Facility i ”nanoteknik plattform-projekt” som sponsras av MEXT, Japan.

1. tillverkning av MACME Array
Obs: Alla material och utrustning listas i tabellen material.
<ol><li>
Beredning av masker för en nanofiber-matris och en form för en mikroflödessystem struktur
	<ol>
<li>Skapa tredimensionella (3D) bilder av masker som används för nanofiber matriser och formar för mikroflödessystem strukturer med hjälp av 3D-datorgrafik programvarupaket (tabell 1). Obs: 3D-bilder läses och skrivs ut av en 3D-skriva...

Detta protokoll visar den första screeningmetoden för att upprätta ett robust kultur system för underhåll av kvalificerad hPSCs. Först beskrev vi hur man förbereder en plattform med olika konstgjorda ECMs och cell sådd densiteter med hjälp av en mikroflödessystem-enhet som är integrerad med en nanofiber array, MACME matrisen. Andra, kvantitativa bildbaserade encelliga fenotypning var utfört50 att utvärdera enskilda cellulära resultat och beteenden förändras genom olika biokemiska o...

Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs)1,2 själv förnya obegränsat och differentieras till olika vävnad härstamningar, som kan revolutionera läkemedelsutveckling, cellbaserade terapier, vävnadsteknik och regenerativ medicin 3 , 4 , 5 , 6. allmänna kulturen rätter och mikrotiter plattor, dock är inte utformade att möjliggöra exakta fysiska och kemiska cell manipulation på cellnivå med utbud av nano - till mikro-meter, som är en kritisk faktor för cellulära expansion, självförnyelse och differentiering. För att lösa denna nackdel, har studier undersökt av cellulära mikromiljö reglera cell-öde beslut och cell funktioner4roller. Under de senaste åren har ett ökande antal studier genomförts för att rekonstruera cellulära mikromiljö in vitro7,8. Nano - och micro-tillverkning processer har upprättat dessa mikromiljö genom manipulering av kemiska9,10,11,12,13, 14,15,16,17 och fysiska18,19,20 miljömässiga ledtrådar. Tills nu fanns det inga rapporter att systematiskt undersöka de bakomliggande mekanismerna av kemiska och fysiska miljön ledtrådar på cell-öde beslut och funktioner inom en enda plattform.
Här, införa vi en strategi som bygger på enkel designprinciper för att upprätta en robust screening plattform (figur 1). Först beskriver vi proceduren utveckling av en integrerad plattform för att skapa mångsidiga, konstgjorda cellulära mikromiljö med hjälp av en nanofiber-matris och en mikroflödessystem struktur: The Multiplexed konstgjorda cellulära närmiljön (MACME) array (Figur 1A och 2A). Nanofiber matrisen har 12 olika mikromiljö i varierande kombinationer av nanofiber material och densiteter. Electrospinning användes för att fabricera nanofibrer. Nanofiber material, såsom polystyren (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22och gelatin (GT)23, utformades för att testa sina kemiska egenskaper, vilket kan påverka celladhesion och underhåll av pluripotency ( Figur 2B). Nanofiber tätheter varierades genom att ändra electrospinning tid och de genererade nanofibrer definierades enligt deras densiteter (DNF, med D = XLow/låg/mellan/hög). Mikroflödessystem strukturen består av Polydimetylsiloxan (PDMS) härbärgerat 48 cellkultur kammare, som kan placeras längs 96 brunnar mikroplattan standard dimensioner. PDMS är ett biokompatibelt och gas-utbytbara polymer som allmänt används för att tillverka mikroflödessystem enheter24. Varje mikroflödessystem kanal var avsedd att vara 700 µm breda och 8,4-mm lång och hade två vikar vid kanterna (tabell 1). Kamrarna hade olika höjder (250, 500 och 1000 µm) att manipulera den initiala cell-sådd tätheter (0,3 0,6 och 1,2 × 105 celler/cm2), som kan korrelera med överlevnad, proliferation och differentiering av hPSCs25 (Figur 2C). Antalet celler som seedade in i en kammare är proportionell till kolumn tätheten över kammaren golvet och därmed första cellen sådd densitet kontrollerades genom att införa samma cellsuspensionen i kultur avdelningar med olika höjder. Alla kanaler utformades för att vara ≥ 250-µm hög26 att minimera effekterna av låg-syre spänning27 och skjuvspänning28 på cellerna. Kanal höjder av 250, 500 och 1000 µm är förkortade här som XCD med X = Low, Mid, High, respektive. Miljöerna med distinkta nanofiber tätheter och inledande cell-sådd densiteter förkortades som ”Material_NF density_Cell täthet” (t.ex. GT_HighNF_HighCD: en miljö som kännetecknas av hög densitet GT nanofibrer och hög initial cell-sådd densitet).
Därefter beskriver vi hur du utför encelliga analyser för att systematiskt undersöka cell beteende som svar på miljöfaktorer (figur 1B). Som ett proof-of-concept identifierat vi den optimala cellulära miljön för hPSC självförnyelse, vilket är en nyckelfunktion för hPSC underhåll (figur 1B)29. Image-baserad flödescytometri, följt av statistiska analyser, möjliggör kvantitativ tolkning av enskilda cellulära fenotypiska svar till cellulära miljöer. Bland en mängd olika cellulära funktioner ger detta dokument en detaljerad för att identifiera de optimala förutsättningarna för att upprätthålla hPSC självförnyelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="699">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polystyrene (PS)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#182435</td>
			<td style="width:231px;">Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polymethylglutarimide (PMGI)</td>
			<td style="width:135px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">G113113</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin (GT)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G2625</td>
			<td style="width:231px;">From porcine skin, type A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:135px;">Doe Corning Toray</td>
			<td style="width:119px;">#1064291</td>
			<td style="width:231px;">PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">OpenSCAD</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">AutoCAD 2014</td>
			<td style="width:135px;">Autodesk</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3D printer, AGILISTA-3000</td>
			<td style="width:135px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UV-curable resin, AR-M2</td>
			<td style="width:135px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is used for 3D printing by Agilista.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#338826</td>
			<td style="width:231px;">&#8805;99.99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#270989</td>
			<td style="width:231px;">Anhydrous, 99.8%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#401757</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MSP-30T</td>
			<td style="width:135px;">Vacuum Device</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">Magnetron sputtering machine</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Nunc OmniTray</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#242811</td>
			<td style="width:231px;">This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Gun-type corona discharge machine</td>
			<td style="width:135px;">Shinko Electric &#38; Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">CFG-500</td>
			<td style="width:231px;">This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 &#34;Assembly of the MACME arrays&#34; in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:135px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS-05SZ</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stainless-steel blunt needle (23-gauge)</td>
			<td style="width:135px;">Nipro</td>
			<td style="width:119px;">#2166</td>
			<td style="width:231px;">Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High-voltage power supply</td>
			<td style="width:135px;">TechDempaz</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride</td>
			<td style="width:135px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">W001</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Hydroxysuccinimide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#56480</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">#354277</td>
			<td style="width:231px;">This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellAdhere Vitronectin, Human, Solution</td>
			<td style="width:135px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#07004</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TeSR-E8</td>
			<td style="width:135px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#05940</td>
			<td style="width:231px;">Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">#253-00513</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#12605028</td>
			<td style="width:231px;">This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10086</td>
			<td style="width:231px;">The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A13203</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oct-3/4 Antibody (C-10)</td>
			<td style="width:135px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-5279</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (DyLight 488)</td>
			<td style="width:135px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab96875</td>
			<td style="width:231px;">This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">ECLIPSE Ti-E</td>
			<td style="width:135px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4&#215;/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td style="width:135px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CellProfiler, Version 2.1.0</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">R</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Cluster 3.0</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Java TreeView</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">H9 human embryonic stem cell</td>
			<td style="width:135px;">WiCell Stem Cell Bank</td>
			<td style="width:119px;">WA09</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a multiplexed artificial cellular microenvironment array

Cellulära mikromiljö består av en mängd olika tecken, till exempel tillväxtfaktorer, extracellulära matriser och intercellulära interaktioner. Dessa signaler är väl iscensatt och är avgörande för att reglera cellfunktioner i ett levande system. Även om ett antal forskare har försökt att undersöka sambandet mellan miljöfaktorer och önskad cellulära funktioner, förblir mycket okänd. Detta beror till stor del på bristen på en lämplig metod att efterlikna sådana miljömässiga ledtrådar i vitrooch samtidigt testa olika miljömässiga ledtrådar på celler. Vi rapporterar här, en integrerad plattform av mikrofabricerade kanaler och en nanofiber array, följt av hög-encelliga innehållsanalys, att undersöka stamceller fenotyper ändras av olika miljöfaktorer. För att demonstrera tillämpning av denna plattform, fokuserar denna studie på fenotyperna själv förnya mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs). Här presenterar vi förberedelse förfarandena för en nanofiber array och mikroflödessystem strukturen vid tillverkning av en multiplex konstgjorda cellulära närmiljön (MACME)-matris. Dessutom beskrivs övergripande steg av de encelliga profilering, cell färgning med flera fluorescerande markörer, flera fluorescens imaging och statistiska analyser.

MACME matriser: Design och tillverkning: I kombination med nanofiber teknik använde vi mikroflödessystem cellkultur och screening tekniker anställd tidigare identifiera optimala förhållanden för hPSC självförnyelse eller differentiering35,det36 (figur 1). Detta är väl lämpad för att fastställa robust hög genomströmning cellbaserade analyser eftersom cell kultur chambers...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array at JoVE.com

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Tillverkning av en multiplexade konstgjorda cellulära mikromiljö Array

Denna artikel beskriver den detaljerna metoden för att förbereda en multiplex konstgjorda cellulära närmiljön (MACME)-matris för hög genomströmning manipulation av fysikaliska och kemiska signaler symtom liknande i vivo cellulära mikromiljö och till identifiera den optimala cellulära miljön för mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) med encelliga profilering.

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Mikroflödessystem enhet för att återskapa en tumör mikromiljö<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Låg kostnad Cryo-ljusmikroskopi Stage Fabrication för korrelerade ljus / elektronmikroskopi

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro-Montering av Semi-konstgjorda molekylär maskin och dess användning för detektion av DNA-skador

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Ihåliga mikronål-baserad sensor för Multiplexade Transdermal Elektrokemisk Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Syntes av ett intein medierad Artificiell Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

Tissue Engineering av tumör Stromal mikromiljö med Ansökan till Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polymera mikronålmatris Fabrication genom fotolitografi

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Tillverkning av ett bioaktivt, PCL-baserade &quot;Självpassande&quot; formminne polymerskelettet

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikroflödes Plattform med Multiplex elektronisk detektering för rumslig Spårning av partiklar

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Tillverkning och karakterisering av optiska vävnad fantomer som innehåller Makrostrukturell

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...