Name: rna pull-down procedure to identify rna targets of a long non-coding rna
Uploaded: 2018-04-10T14:30:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA at JoVE.com

यह काम ऐक्स-मार्सैय विश्वविद्यालय और CNRS द्वारा समर्थित और फाइजर प्रयोगशालाओं से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

सभी प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए यूरोपीय आर्थिक समुदाय के साथ सख्त अनुसार प्रदर्शन किया गया (86/609/EEC और 2010/63/यत) और एक Becquet को दी लाइसेंस के तहत (प्रीफेक्चर des Bouches-du-Rhône, प्राधिकरण no. 13-002) ।
1. जांच डिजाइन
<ol><li>
ब्याज की lncRNA के प्राथमिक अनुक्रम का प्रयोग, "RNAstructure वेब सर्वर"5पर अपने माध्यमिक संरचना उत्पंन करते हैं । नोट: इस साइट पर, विभिन्न एल्गोरिदम इस्तेमाल किया जा सकता है. तीन भविष्यवाणी उपकरण है कि जांच डिजाइन के लिए सबसे अच्छा परिणाम दे रहे हैं: "गुना" (सबसे कम मुक्त ऊर्जा संरचना), "MaxExpect" (अत्यधिक संभावित आधार जोड़े), और "Probnot" (pseudoknots सहित संभावित आधार जोड़े) । इन तीन विश्लेषणों का प्रदर्शन और तुलना की जा सकती है. अंय वेब सर्वर, जैसे वियना आरएनए websuite7, भी किया जा सकता है ।<ol>
<li>इन क्षेत्रों के लिए एक मजबूत संबंध के साथ 25 ठिकानों की आंतरिक आधार बाँधना और डिजाइन विरोधी भावना oligonucleotide जांच की एक कम संभावना प्रदर्शित क्षेत्रों का चयन करें । नोट: इन जांच की जीसी सामग्री 40 और 60% के बीच शामिल किया जाना चाहिए । एक संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) का उपयोग करना, सुनिश्चित करें कि चयनित विरोधी भावना oligonucleotide जांच न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम अंय आरएनए चुना सेल प्रणाली में व्यक्त में पहचान नहीं है ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>डिजाइन भी 25 ठिकानों की एक गैर विशिष्ट डीएनए oligonucleotide जांच जो ब्याज की lncRNA के लिए न तो संबध प्रदर्शित करता है और न ही ब्याज के जीनोम में अंय आरएनए अनुक्रम के लिए ।</li>
	<li>3 ' अंत में बायोटिन के साथ जांच आदेश । नोट: आदेश में steric बाधा को कम करने के लिए, oligonucleotide और बायोटिन के बीच की दूरी एक triethyleneglycerol स्पेसर के साथ वृद्धि की जानी है । एक इष्टतम परिणाम के लिए, और खींचने के परिणामों की विशिष्टता का आकलन करने में सक्षम होने के लिए नीचे, यह 3 अलग विरोधी भावना oligonucleotide जांच डिजाइन करने के लिए सिफारिश की है और फिर प्रयोग करने के लिए अपनी कार्यकुशलता की तुलना ।</li>
</ol>2. पार से जोड़ने
<ol><li>
कल्चरल सेल को परस्पर जोड़ना
	<ol>
<li>संस्कृति GH4C1 sommatolactotroph है हैम F10 मध्यम में पिट्यूटरी कोशिकाओं 15% हार्स सीरम और 2% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक । ७८.५ cm2 कल्चर प्लेट्स में संगम तक कोशिकाओं को बढ़ाएं । यह लगभग 1 x 107 कक्षों से मेल खाती है ।</li>
		<li>एक धाराप्रवाह GH4C1 ७८.५ cm2 संस्कृति प्लेट से सेल संस्कृति माध्यम निकालें, तो 1x के साथ कुल्ला फॉस्फेट के मध्यम मात्रा में बफर खारा (पंजाब)</li>
		<li>पंजाब में 1% paraformaldehyde समाधान के साथ कोशिकाओं को ठीक करें (एक ७८.५ cm2 व्यंजन के लिए 10 मिलीलीटर); यह समाधान एक 4% paraformaldehyde शेयर समाधान से हौसले से तैयार होना चाहिए । क्रॉस-कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए आंदोलन के तहत लिंक (आरटी) । चेतावनी: Paraformaldehyde (पीएफए) विषाक्त है, और सावधानी के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए ।</li>
		<li>glycine 1.25 मीटर (paraformaldehyde समाधान के 10 मिलीलीटर प्रति 1 मिलीलीटर) की 1/10 मात्रा जोड़कर paraformaldehyde कार्रवाई बुझाने; आरटी पर आंदोलन 5 मिनट ।</li>
		<li>आकांक्षा द्वारा मीडिया को त्यागें और दो बार कुल्ला (5 मिनट) 1x के साथ पंजाब के मध्यम मात्रा ।</li>
		<li>मीडिया की मात्रा के 1/10 के लिए इसी पंजाब के एक खंड जोड़ें, एक सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा, और फिर एक केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।</li>
		<li>5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 510 जी पर स्पिन ।</li>
		<li>जितना हो सके उतना supernatant निकालें ।</li>
		<li>स्टोर छर्रों अनिश्चित काल के रूप में-80 डिग्री सेल्सियस पर की जरूरत है ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ऊतक पार से जोड़ने
	<ol>
<li>1% के एक समाधान में हौसले से प्राप्त माउस पिट्यूटरी ग्रंथि ऊतक के 5 मिलीग्राम रखो paraformaldehyde (लगभग 10x ऊतक की मात्रा) में पतला है, 10 मिनट के लिए आरटी पर आंदोलन ।</li>
		<li>एक 1.25 मीटर glycine समाधान (paraformaldehyde समाधान के 10 मिलीलीटर प्रति 1 मिलीलीटर) और आरटी पर 5 मिनट आंदोलन जोड़कर paraformaldehyde कार्रवाई बुझाने ।</li>
		<li>आकांक्षा द्वारा मीडिया को त्यागें और पंजाबियों के साथ दो बार कुल्ला (लगभग 10x ऊतक की मात्रा) । जितना हो सके उतना supernatant निकालें ।</li>
		<li>-80 ° c पर अनिश्चित रूप से पार से जुड़े ऊतक स्टोर ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. कोशिका या ऊतक Lysis
<ol><li>Lysis बफर तैयार (50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.0, 10 mm EDTA, 1% एसडीएस एक RNAse अवरोध करनेवाला समाधान के 200 U/एमएल के साथ पूरक, और एक कॉकटेल अवरोध करनेवाला 5 µ l/</li>
	<li>पहले गल बिना लीजड ड नमूनों को प्राप्त करने के लिए, पुन: निलंबित सेल छर्रों या पार से जुड़े ऊतकों को इस बफर के साथ (लगभग 1 मिलीलीटर सेल गोली या ऊतक के 100 मिलीग्राम प्रति). एक सेल 1 एक्स 10 से प्राप्त की गोली7 कोशिकाओं को एक लीजड ड प्रोटीन के लगभग 20 मिलीग्राम युक्त नमूने को जंम दे । नोट: इस्तेमाल किया ऊतक पर निर्भर करता है, यांत्रिक व्यवधान का एक कदम जोड़ा जाना चाहिए. इस मामले में, यह अतिरिक्त कदम के दौरान नमूनों की हीटिंग से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।</li>
</ol>4. Sonication
<ol><li>
sonication शर्तों का अनुकूलन
	<ol>
<li>30 एस के 2 से 5 श्रृंखला पर और 30 एस के साथ sonicator कार्यक्रम ।</li>
		<li>पतला लीजड ड नमूनों (कमजोर पड़ने फैक्टर ½ या लगभग 10 या 5 मिलीग्राम प्रोटीन के लिए इसी ¼) पर sonication शर्तों का अनुकूलन करने के लिए परीक्षण निष्पादित करें । 4 ° c पानी स्नान में पतला लीजड ड नमूनों प्लेस और sonication श्रृंखला शुरू करते हैं ।</li>
		<li>या तो एक आरएनए शुद्धि किट के साथ या एक आरएनए अलगाव रिएजेंट के साथ RNAs शुद्ध (उदा., Trizol) ।</li>
		<li>TBE बफर में एक 1% agarose जेल ट्रो पर शुद्ध आरएनए की समग्रता लोड, आरएनए टुकड़े की लंबाई की जाँच करें. यह लंबाई 200 और 800 बीपी के बीच सीमा चाहिए । नोट: आरएनए टुकड़ा आकार के आधार पर, विरोधी भावना oligonucleotide ' जांच दक्षता भिन्न हो सकते हैं. यह तो sonication की विभिन्न परिस्थितियों के तहत जांच की दक्षता की जांच करने के लिए सिफारिश की है ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>
लीजड ड नमूनों की Sonication
	<ol>
<li>जगह लीजड ड नमूने 20 प्रोटीन के मिलीग्राम (4 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में (3.2 कदम के बाद प्राप्त) और के रूप में चरण 4.1 में अनुकूलित sonication श्रृंखला शुरू करते हैं ।</li>
		<li>तुरंत sonication के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 ग्राम में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । स्थानांतरण supernatants नए केंद्रापसारक ट्यूबों में । नोट: एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए, सूचना को दोहराने supernatants को इस चरण में परित और पुनः वितरित किया जा सकता है ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. आरएनए पुल-डाउन
<ol><li>
दिन 1-संकरण कदम
	<ol>
<li>संकरण बफर के 2 खंड जोड़ें (50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.0, 750 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1% एसडीएस, 15% Formamide जोड़ा extemporaneously) sonication चरण के बाद एकत्र supernatants करने के लिए । भंवर.</li>
		<li>एक केंद्रापसारक ट्यूब में प्रत्येक नमूने के 20 µ एल स्थानांतरण (इनपुट नमूने) और स्टोर पर-20 ° c ।</li>
		<li>biotinylated oligonucleotide जांच के 100 pmol जोड़ें (विशिष्ट या गैर-विशिष्ट; तालिका 1देखें) प्रत्येक नमूने के लिए । आर टी पर एक ट्यूब रोटेटर पर उदारवादी आंदोलन के तहत 4 से 6 घंटे की मशीन</li>
		<li>एक RNAse अवरोधक समाधान के 200 U/एमएल के साथ पूरक चुंबकीय streptavidin मोतियों की 50 µ एल जोड़ें और एक कॉकटेल अवरोधक 5 µ एल/</li>
		<li>आर टी पर ट्यूब रोटेटर पर उदारवादी आंदोलन के तहत रात भर गर्मी</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 दिवस-आरएनए अलगाव कदम
	<ol>
<li>सेल lysate से मोती अलग करने के लिए चुंबकीय समर्थन का प्रयोग करें, supernatant त्यागें, और धो बफर के 900 µ एल के साथ मोती धोने (एसडीएस 0.5%, एसएससी 2x) । आरटी पर रोटेटर पर 5 मिनट के आंदोलन के साथ 5 बार interspersed दोहराएँ ।</li>
		<li>पिछले धोने के बाद, एक आखिरी बार खिचड़ी भाषा और Proteinease k बफर के 95 µ एल जोड़ने (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.0, 100 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 0.5% एसडीएस) और µ-कश्मीर के 5 proteinase एल (20 मिलीग्राम/एमएल) के नमूने लिए ।</li>
		<li>बर्फ पर, इनपुट नमूनों (20 μL) गल और Proteinease k बफर के 75 µ एल जोड़ने और proteinase-कश्मीर (20 मिलीग्राम/एमएल) के 5 µ एल ।</li>
		<li>proteinase K के साथ सभी नमूनों को 50 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए, 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट की मशीन करें ।</li>
		<li>चुंबकीय समर्थन के साथ RNAs से मोतियों को अलग करने से पहले 3 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना ठंडा । supernatant को रखें और मोतियों का त्याग करें ।</li>
		<li>एक आरएनए शुद्धि किट के साथ शुद्ध RNAs, जिसमें डीएनए पाचन कदम शामिल होना चाहिए । स्टोर RNAs-80 ° c ।</li>
		<li>प्रदर्शन रिवर्स प्रतिलेखन qPCR (rt-qPCR) एक आरटी किट का उपयोग कर qPCR द्वारा पीछा किया विशिष्ट प्राइमर (तालिका 1) ।</li>
		<li>दो आरएनए पूल विशिष्ट Neat1 जांच (तालिका 1) में से प्रत्येक के साथ प्राप्त करने के लिए इसी के दोनों डीएनए पुस्तकालयों का निर्माण । एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रणाली पर अनुक्रमण करते हैं ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+maps+of+long+noncoding+RNA+occupancy+reveal+principles+of+RNA-chromatin+interactions.">Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions.</a> Mol Cell. , 667-678 (2011).</li><li>Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+isolation+by+RNA+purification+(ChIRP).">Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP).</a> J Vis Exp. , e3912 (2012).</li><li>Simon, M. D., Wang, C. I., Kharchenko, P. V., West, J. A., Chapman, B. A., Alekseyenko, A. A., Borowsky, M. L., Kuroda, M. I., Kingston, R. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

उनकी संख्या और विविधता द्वारा लंबे समय से कोडिंग RNAs (lncRNAs) अनुसंधान के एक बड़े क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते है और उनकी भूमिकाओं के अधिकांश अभी भी खोज की जानी है । इन lncRNAs के कई एक परमाणु स्थानीयकरण है और उनमें से, कुछ transcriptional या posttranscriptional तंत्र के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति के विनियामक रास्ते में फंसा रहे हैं । इस क्षेत्र में मौजूदा चुनौतियों में से एक RNAs के पोस्ट-transcriptional प्रोसेसिंग में उन lncRNAs की प्रासंगिकता को समझना है । इस प्रयोजन के लिए, lncRNAs द्वारा लक्षित RNAs की पहचान की जानी है । पिछले क्रोमेटिन के साथ lncRNAs के संघ पर ध्यान केंद्रित अध्ययन से प्रेरित होकर, हम एक प्रक्रिया है कि एक lncRNA के साथ जुड़े RNAs की पहचान की अनुमति देता है विकसित की है । इस प्रोटोकॉल की सफलता, नाम आरएनए पुल नीचे, मुख्य रूप से दो महत्वपूर्ण कदम पर निर्भर है, अर्थात् विरोधी भावना डीएनए oligonucleotide जांच के डिजाइन कि विशेष रूप से और विशेष रूप से ब्याज की lncRNA के साथ संकरण है, और ऊतक की शर्तों या सेल निर्धारण कि सभी आणविक भागीदारों के बीच नेटवर्क की अखंडता को बनाए रखने के लिए है ।
पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के साथ एक lncRNA को अलग करने के लिए कार्यविधियाँ प्रदान की इसके संबद्ध क्रोमेटिन अनुक्रम (कलरव1,2, चार्ट3,4) । उन प्रोटोकॉल में, विभिंन रणनीतियों के लिए विरोधी भावना डीएनए biotinylated oligonucleotide जांच डिजाइन कार्यरत थे । कलरव प्रक्रिया में, लेखकों डीएनए biotinylated oligonucleotide जांच के एक पूल सभी निरर्थक और गैर विशिष्ट जांच के बहिष्कार के बाद ब्याज की lncRNA की पूरी लंबाई को शामिल किया1,2। चार्ट प्रोटोकॉल में, लेखकों ने lncRNA के उन क्षेत्रों की पहचान की जो संकरण और डिज़ाइन कैप्चर oligonucleotides के लिए अधिक पहुंच वाले है जो इन क्षेत्रों को लक्षित करते हैं । इन क्षेत्रों का चयन उनके RNase-ज संवेदनशीलता के आधार पर किया गया । दरअसल, आरएनए-डीएनए बाइंडिंग की साइटों पर hydrolyze RNAs के लिए RNAse-एच की संपत्ति का उपयोग कर, oligonucleotides कि संकरण में सुलभ साइटों के लिए lncRNA आरएनए-डीएनए संकर का उत्पादन और एंजाइमी के lncRNA दरार करने के लिए सीसा । लेखकों ने इनमें से तीन परीक्षार्थी कैप्चर oligonucleotides चुने और उन्हें एक कॉकटेल3,4में इस्तेमाल किया.
प्रक्रिया हम विरोधी भावना डीएनए biotinylated oligonucleotide जांच डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया है कि चार्ट प्रोटोकॉल में इस्तेमाल के करीब था, लेकिन वांछित lncRNA के संकरण उपलब्ध क्षेत्रों उनके RNAse-एच संवेदनशीलता के आधार पर चयनित नहीं थे, लेकिन lncRNA माध्यमिक संरचना के bioinformatics मॉडलिंग के रूप में निर्धारित आंतरिक आधार बाँधना की उनकी कम संभावना के अनुसार. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विभिंन माध्यमिक संरचनाओं अलग एल्गोरिदम का उपयोग कर भविष्यवाणी की जाएगी, और जांच उन है कि माध्यमिक संरचनाओं की सबसे बड़ी संख्या में lncRNA के उपलब्ध दृश्यों के लिए संकरण होना चाहिए चुना है की भविष्यवाणी की । एक ही परिणाम के तीन डिजाइन, विशिष्ट जांच या एक एकल जांच व्यक्तिगत रूप से या तो एक कॉकटेल का उपयोग कर प्राप्त किया गया । यह दो अलग, विशिष्ट जांच और उन है कि इन दो जांच करने के लिए आम है के रूप में सकारात्मक परिणाम के विचार के उपयोग के लिए प्रेरित किया । अंत में, यह इसलिए विधि के विकास की शुरुआत में सिफारिश की है, एक इष्टतम परिणाम के लिए और पुल नीचे के परिणामों की विशिष्टता का आकलन करने में सक्षम हो, 3 अलग विरोधी भावना oligonucleotide जांच डिजाइन करने के लिए और फिर तुलना करने के लिए प्रयोगात्मक उनकी दक्षता, खासकर के बाद से जांच दक्षता सेल lysate तैयारी द्वारा बदला जा सकता है । फिर भी, जांच डिजाइन की प्रक्रिया lncRNA माध्यमिक संरचना हम इस्तेमाल की bioinformatics मॉडलिंग पर आधारित है कि टाइलिंग oligonucleotide जांच के पूल पर आधारित से भी कम महंगा रह गया है2, और इस पर आधारित विधि की तुलना में कम समय लगता था पर RNAse-H संवेदनशीलता4.
एक नकारात्मक नियंत्रण भी नकारात्मक कब्जा oligonucleotide के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए या तो नब्ज डीएनए biotinylated oligonucleotide जांच या हाथापाई oligonucleotide जांच, या oligonucleotides एक असंबंधित आरएनए के खिलाफ निर्देश दिया । क्योंकि प्राकृतिक antisense टेप lncRNAs, नब्ज oligonucleotide जांच के उपयोग के अस्तित्व के कारण कभी भी अपर्याप्त हो सकता है । नकारात्मक नियंत्रण के लिए चयनित oligonucleotide जांच की परवाह किए बिना, यह एक ज्ञात आरएनए के साथ संकरण नहीं करता है कि विस्फोट से जाँच करने के लिए आवश्यक है और इस oligonucleotide एक अभी भी संयुक्त राष्ट्र व्याख्या lncRNA करने के लिए संकरण कर सकते हैं कि मन में रखने के लिए.
इन आरएनए खींचने के प्रयोगों में प्रयुक्त सेल lysates 106 से 107 कोशिकाओं से प्राप्त किया गया जब संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं, और 1 से 10 मिलीग्राम जब ऊतक के साथ काम कर रहे. सेल lysates की तैयारी ऊतक या कोशिका दो मुख्य कदम है कि अनुकूलित किया जाना है के साथ प्रयोग प्रकार के अनुसार अनुकूलित करने की जरूरत है: अर्थात्, पार से जोड़ने कदम है कि lncRNA और उसके आणविक भागीदारों के बीच आबंध बांड के गठन की अनुमति देता है, और sonication कदम है कि बहुत तकलीफ क्रोमेटिन द्वारा चिपचिपापन कम कर देता है ।
पार से जोड़ने के कदम का उद्देश्य यह सुनिश्चित करना है कि सभी आरएनए लक्ष्य सभी आणविक भागीदारों के बीच एक नेटवर्क के गठन को प्रेरित करके lncRNA के लिए बंद रहते हैं । एक paraformaldehyde उपचार कदम है कि lncRNA और उसके भागीदारों के बीच आबंध बांड फार्म होगा नेटवर्क reticulated होने की अनुमति देता है. चार्ट प्रोटोकॉल में, यह सुझाव दिया गया था अगर परमाणु lncRNA के साथ काम करने, पूरे सेल lysate पर paraformaldehyde के साथ एक प्राथमिक उपचार करने के लिए और अलग न्यूक्लिक अंश3,4पर एक दूसरा उपचार । हमने देखा है कि इस अनुपूरक कदम की जांच की दक्षता में कमी आई, शायद कोशिकाओं में lncRNA पहुंच को कम करने के द्वारा । इसलिए, paraformaldehyde द्वारा reticulation की डिग्री खाते में सेल या ऊतक प्रकार इस्तेमाल ले अनुकूलित किया जाना है, ब्याज की lncRNA के स्थानीयकरण, और डिजाइन जांच की दक्षता ।
जबकि कोशिकाओं lysing, क्रोमेटिन lysate में जारी किया गया है और इसकी चिपचिपाहट बढ़ जाती है; यह तो नमूनों की तरलता बढ़ाने के लिए sonication द्वारा क्रोमेटिन टुकड़ा करने के लिए आवश्यक है और इसलिए ब्याज की lncRNA के लिए oligonucleotide जांच की पहुंच की सुविधा । हालांकि, sonication भी RNAs ब्याज की lncRNA के साथ निकाले टुकड़ा होगा । यह तो यह कुशलतापूर्वक lysate की चिपचिपाहट को कम कर देता है कि एक तरह से sonication के समय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, यह भी 200-800 बीपी के बीच शामिल एक लंबाई के साथ आरएनए टुकड़े की प्राप्त करने की अनुमति देती है. ध्यान दें कि sonication समय अत्यधिक हो जाएगा दोनों मात्रा और ऊतक या प्रसंस्कृत कोशिकाओं के प्रकार का इस्तेमाल किया पर निर्भर है ।
अंत में, यहां वर्णित प्रक्रिया 2-3 दिनों में एक वांछित lncRNA के आरएनए लक्ष्य का कब्जा में सक्षम बनाता है । RT-qPCR के साथ युग्मित, इन तरीकों को एक विशिष्ट संघ और एक उंमीदवार के रूप में वांछित lncRNA द्वारा एक mRNA के विनियमन की तलाश की अनुमति होगी । एक जीनोम चौड़ा दृष्टिकोण के लिए, आरएनए खींच-नीचे प्रयोगों वांछित lncRNA के साथ जुड़े सभी RNAs की पुनर्प्राप्ति की अनुमति उच्च प्रवाह आरएनए-अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । जो भी विश्लेषणात्मक रणनीति चुनी, आरएनए पुल डाउन प्रक्रिया lncRNAs द्वारा आरएनए विनियमन पर नए महत्वपूर्ण ज्ञान प्रदान करना चाहिए.

यहां वर्णित विधि के समग्र लक्ष्य के लिए एक लंबी डिकोडिंग आरएनए (lncRNA) के आरएनए आणविक भागीदारों की पहचान है । LncRNA एक निर्धारित पठन फ़्रेम के बिना 200 से अधिक न्यूक्लियोटाइड के अनुक्रम के अनुरूप है । उनमें से कुछ को जीन अभिव्यक्ति विनियमन में शामिल होना दिखाया गया है, न केवल transcriptional स्तर पर, लेकिन यह भी आरएनए सह के विभिंन चरणों में और transcriptional परिपक्वता के बाद । उत्तरार्द्ध मामलों में, lncRNA के आणविक भागीदारों RNAs कि पहचान करने के लिए कर रहे हैं । एक lncRNA हित के साथ प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से जुड़े RNAs की पहचान को सक्षम करने के लिए तो विकसित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा ।
पहले से प्रकाशित विधियां, जैसे आरएनए शुद्धि द्वारा क्रोमेटिन अलगाव (कलरव)1,2 और आरएनए के कब्जा संकरण विश्लेषण लक्ष्य (चार्ट)3,4, के उच्च प्रवाह की खोज की अनुमति दें आरएनए-बाउंड प्रोटीन्स और एक विशिष्ट lncRNA की जीनोमिक बाइंडिंग साइटें । इन दो तरीकों में, ब्याज की lncRNA पहले biotinylated पूरक oligonucleotides के लिए संकरित किया गया था, और जटिल तो streptavidin मोतियों का उपयोग अलग था । इन दोनों तकनीकों के बीच मुख्य अंतर जांच के डिजाइन से संबंधित है कि लक्ष्य lncRNAs । कलरव, आरएनए मछली से प्रेरित रणनीति, lncRNA की पूरी लंबाई टाइल करने के लिए लघु पूरक डीएनए oligonucleotide जांच के एक पूल डिजाइनिंग के शामिल थे । इसके विपरीत, चार्ट में, लेखक lncRNAs पर एक RNase एच मानचित्रण परख संकरण के लिए उपलब्ध साइटों की जांच करने के लिए अनुकूलित ।
प्रक्रिया विरोधी नब्ज डीएनए biotinylated oligonucleotide जांच डिजाइन करने के लिए यहां प्रस्तावित lncRNA माध्यमिक संरचना के bioinformatics मॉडलिंग का उपयोग करता है5 क्षेत्रों के लिए एक मजबूत समानता है कि आंतरिक की एक कम संभावना प्रदर्शित के साथ जांच का चयन करने के लिए आधार बाँधना. इस प्रक्रिया के टाइलिंग oligonucleotide जांच के पूल के आधार पर उन से कम महंगा होने का फायदा है2 और कम समय लेने वालों की तुलना में RNAse-एच संवेदनशीलता4पर आधारित है ।
के रूप में वहां के बाद के लिए सबूत के एक बढ़ती शरीर है transcriptional जीन विनियमन lncRNAs द्वारा6, यह बहुत ही एक lncRNA के लक्ष्य है कि RNAs के कब्जा को सक्षम करने के दृष्टिकोण को विकसित करने के लिए उपयोगी है । इसके अलावा, सबसे अनुप्रयोगों के लिए प्रयोग करने योग्य हो, दृष्टिकोण दोनों प्रसंस्कृत कोशिकाओं और ऊतक निष्कर्षों में अनुकूलित किया गया था ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads My One</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>Magnetic streptavidin beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15515-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Advance</td>
			<td>Mupid-One</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA XS purification kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740902</td>
			<td>RNA purificationkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseOUT</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td>RNAse inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SB2</td>
			<td>Eppendorf tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA to DNA</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4387405</td>
			<td>Reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725124</td>
			<td>qPCR reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied 7500 Fast</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4351107</td>
			<td>qPCR apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td>DNA library construction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq 500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>NGS system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna pull-down procedure to identify rna targets of a long non-coding rna

लंबी गैर-कोडिंग आरएनए (lncRNA), जो एक निर्धारित पठन फ़्रेम के बिना 200 से अधिक न्यूक्लियोटाइड के अनुक्रम हैं, विनियामक गैर-कोडिंग आरएनए के परिवार से संबंधित हैं । हालांकि उनके जैविक कार्य मोटे तौर पर अज्ञात रहते हैं, लेकिन इन lncRNAs की संख्या में लगातार वृद्धि हुई है और अब यह अनुमान है कि मनुष्यों में 10,000 से अधिक ऐसे टेप हो सकते हैं । इनमें से कुछ के लिए जीन अभिव्यक्ति जो transcriptional स्तर पर जगह ले के महत्वपूर्ण नियामक रास्ते में शामिल होने के लिए जाना जाता है, लेकिन यह भी आरएनए सह और बाद के विभिंन चरणों में transcriptional परिपक्वता । उत्तरार्द्ध मामलों में, RNAs कि lncRNA द्वारा लक्षित कर रहे है की पहचान की है । यही कारण है कि यह एक lncRNA ब्याज के साथ प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से जुड़े RNAs की पहचान को सक्षम करने के लिए एक विधि विकसित करने के लिए उपयोगी है ।
इस प्रोटोकॉल, जो पहले प्रकाशित एक lncRNA के अलगाव की अनुमति अपने संबद्ध क्रोमेटिन दृश्यों के साथ एक साथ प्रोटोकॉल से प्रेरित था, के लिए संबद्ध RNAs के अलगाव की अनुमति अनुकूलित था । हम निर्धारित किया है कि दो कदम इस प्रोटोकॉल की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं । पहले विशिष्ट विरोधी नब्ज डीएनए oligonucleotide जांच के डिजाइन के लिए ब्याज की lncRNA को संकरण कर रहा है । इस अंत करने के लिए, lncRNA माध्यमिक संरचना bioinformatics और विरोधी भावना oligonucleotide जांच द्वारा भविष्यवाणी की थी क्षेत्रों है कि आंतरिक आधार बाँधना की एक कम संभावना प्रदर्शित करने के लिए एक मजबूत संबंध के साथ डिजाइन किए गए थे । प्रक्रिया का दूसरा महत्वपूर्ण कदम ऊतक या संस्कृति कोशिकाओं है कि सभी आणविक भागीदारों के बीच नेटवर्क का संरक्षण किया है की निर्धारण की स्थिति पर निर्भर करता है । उच्च प्रवाह आरएनए अनुक्रमण के साथ युग्मित, इस आरएनए पुल डाउन प्रोटोकॉल ब्याज की एक lncRNA की पूरी आरएनए interactome प्रदान कर सकते हैं.

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RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

यह शाही सेना पुल-डाउन विधि एक लंबे समय से गैर कोडिंग आरएनए (lncRNA) के आरएनए लक्ष्यों की पहचान करने की अनुमति देता है । घर के संकरण के आधार पर बनाया, डिजाइन विरोधी भावना डीएनए oligonucleotide जांच एक उचित निश्चित ऊतक या सेल लाइन में इस lncRNA के लिए विशिष्ट, यह कुशलतापूर्वक lncRNA के सभी आरएनए लक्ष्यों पर कब्जा करने की अनुमति देता है ।

आरएनए Pull-डाउन प्रक्रिया एक लंबी गैर-कोडिंग आरएनए के आरएनए लक्ष्यों की पहचान करने के लिए

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Research

JoVE Journal

Genetics

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