Name: adeno-associated virus-mediated transgene expression in genetically defined neurons of the spinal cord
Uploaded: 2018-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord at JoVE.com

Wij danken Hanns Ulrich Zeilhofer voor royaal ondersteunen dit werk. Hendrik Wildner werd gesteund door de Stichting Olga Mayenfisch. Wij danken Carmen Birchmeier voor het antilichaam Lmx1b.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Zwitserse kantonnale Veterinair Bureau (Zürich) en zijn overeenkomstig en naleving van alle relevante regelgevend en institutioneel richtsnoeren.
Opmerking: Alle materialen samen met respectievelijke fabrikanten en/of leveranciers worden weergegeven in de Tabel van materialen.
1. generatie van Cre-afhankelijke AAV vectoren
Opmerking: Een verscheidenheid van Cre-afhankelijke vecto...

<ol>
	<li>Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+downunder:+an+update+from+the+spinal+cord.">Inhibition downunder: an update from the spinal cord.</a> Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).</li><li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).</li><li>Sandkuhler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+and+mechanisms+of+hyperalgesia+and+allodynia.">Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia.</a> Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).</li><li>Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+synaptic+inhibition+in+spinal+sensory+processing+and+pain+control.">Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control.</a> Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).</li><li>Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skilled+reaching+relies+on+a+V2a+propriospinal+internal+copy+circuit.">Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit.</a> Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).</li><li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Early+RET++Deep+Dorsal+Spinal+Cord+Interneurons+in+Gating+Pain.">Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain.</a> Neuron. 91 (6), 1413 (2016).</li><li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation,+silencing,+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch.">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li><li>Francois, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brainstem-Spinal+Cord+Inhibitory+Circuit+for+Mechanical+Pain+Modulation+by+GABA+and+Enkephalins.">A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins.</a> Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).</li><li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Horn+Circuits+for+Persistent+Mechanical+Pain.">Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain.</a> Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).</li><li>Petitjean, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Horn+Parvalbumin+Neurons+Are+Gate-Keepers+of+Touch-Evoked+Pain+after+Nerve+Injury.">Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury.</a> Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+local+and+descending+inputs+for+primary+sensory+neurons.">Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons.</a> J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).</li><li>Haenraets, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+nociceptive+circuit+analysis+with+recombinant+adeno-associated+viruses:+the+impact+of+serotypes+and+promoters.">Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters.</a> J Neurochem. , (2017).</li><li>Abraira, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+and+Synaptic+Architecture+of+the+Mechanosensory+Dorsal+Horn.">The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn.</a> Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).</li><li>Wildner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analysis+of+Ptf1a-+and+Ascl1-deficient+mice+reveals+new+markers+for+distinct+dorsal+horn+interneuron+populations+contributing+to+nociceptive+reflex+plasticity.">Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity.</a> J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).</li><li>Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+injection+of+a+viral+vector+for+conditional+gene+manipulation+in+the+mouse+spinal+cord.">Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord.</a> J Vis Exp. (73), e50313 (2013).</li><li>Kohro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+minimally-invasive+method+for+microinjection+into+the+mouse+spinal+dorsal+horn.">A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn.</a> Sci Rep. 5, 14306 (2015).</li><li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gate+control+of+mechanical+itch+by+a+subpopulation+of+spinal+cord+interneurons.">Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons.</a> Science. 350 (6260), 550-554 (2015).</li><li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control.">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li><li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain.">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li><li>Gutierrez-Mecinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preprotachykinin+A+is+expressed+by+a+distinct+population+of+excitatory+neurons+in+the+mouse+superficial+spinal+dorsal+horn+including+cells+that+respond+to+noxious+and+pruritic+stimuli.">Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli.</a> Pain. 158 (3), 440-456 (2017).</li><li>Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+boundaries+in+roof+plate+and+choroid+plexus+identified+by+intersectional+gene+activation.">Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation.</a> Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).</li><li>Kim, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+genetically+defined+neurons+to+behavior+through+a+broadly+applicable+silencing+allele.">Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele.</a> Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).</li><li>Kim, J. C., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate-mapping+approaches:+new+means+to+explore+the+embryonic+origins+of+the+cochlear+nucleus.">Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus.</a> Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).</li></ol>

Intraspinal injectie van AAVs kan worden een krachtige techniek in een laboratorium van het onderzoek, waardoor de analyse van spinale cellen met een hoge temporele en ruimtelijke oplossing. Dit protocol maakt de transductie van de drie belangrijkste spinale segmenten wordt geïnnerveerd door de sensorische neuronen uitbreiding van hun perifere axonen naar de stuk. Transducing drie segmenten produceert robuuste en reproduceerbare gedrags-gegevens. Ook kunnen testen van een grotere sensorische ruimte dan mogelijk na een e...

Het dorsale ruggenmerg is essentieel voor de uitwisseling van informatie tussen de periferie van het lichaam en de hersenen. Zintuiglijke prikkels zoals warmte, koude, aanraking, of schadelijke stimuli worden gedetecteerd door gespecialiseerde perifere neuronen, die deze informatie voor de neuronen van de dorsale Hoorn van het ruggenmerg. Hier, een complex netwerk van remmende en excitatory interneuronen moduleert en uiteindelijk de sensorische informatie relais via spinale projectie neuronen te supraspinal1,2sites. De berekeningen uitgevoerd door spinale inter- en projectie neuronen gate zintuiglijke informatie, dus bepalen welke informatie wordt onderdrukt of doorgegeven bij welke intensiteit. Wijzigingen in de integratie van sensorische stimuli, zoals een gewijzigd evenwicht tussen inhibitie en excitatie, kunnen leiden tot sensorische stoornissen zoals overgevoeligheid of allodynia (pijnlijke gewaarwordingen na normaal niet-pijnlijke stimulatie). Deze wijzigingen worden beschouwd als dat de onderliggende oorzaak van verschillende chronische pijn staat3,4. Spinale circuits zijn dus van groot belang zijn bij de verwerking van zintuiglijke en bijgevolg in de perceptie van een organisme milieu en zelf. Met de recente komst en combinatie van moleculaire, genetische, en chirurgische technieken waarmee de precieze manipulatie van genetisch geïdentificeerde spinale neuron subpopulaties, beginnen wetenschappers nu te begrijpen van de onderliggende spinale circuits verantwoordelijk voor de verwerking van de afzonderlijke zintuiglijke modaliteiten.
Intraspinal injectie van rAAV in wild-type of transgene muizen heeft bijgedragen aan de manipulatie, analyse en begrip van de functie van specifieke deelverzamelingen van ruggenmerg neuronen5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. deze techniek maakt het mogelijk de levering van marker eiwitten (zoals GFP / GFP fusion eiwitten), verslaggever eiwitten (zoals GCaMP) of effector eiwitten (zoals bacteriële toxines, channelrhodopsin of Farmacogenetische receptoren) in een ruimtelijk beperkte wijze ruggenmerg neuronen. Lokale injectie van Cre-afhankelijke rAAVs in transgene muizen uiting van Cre recombinase in een specifieke subset van ruggenmerg neuronen kan de specifieke analyse van de respectieve neuronale bevolking. We hebben gebruikt deze techniek te etiketteren, lasertherapie, remmen of spinale glycinergic neuronen die aantonen dat zij zijn een essentieel onderdeel van de spinal gate beheersing van pijn en jeuk van transmissie7activeren. In deze experimenten, intraspinal injectie van Cre-afhankelijke rAAV in GlyT2::Cre muizen ingeschakeld de selectieve manipulatie van glycinergic neuronen in de lumbale ruggemerg. Gelijktijdige manipulatie van supraspinal circuits waarin glycinergic neuronen cruciaal voor de overleving van het dier kan worden vermeden.
Terwijl een intraspinal injectie van rAAVs infectie aan de plaats van injectie beperkt, kan virale transductie optreden niet alleen in lokale neuronen, maar ook in neuronen die verbinding met de injectieplaats via axonale projecties maken. De laatste wordt vaak gebruikt om trace CNS gebieden leveren van neuronale informatie aan een bepaalde kern in de hersenen. De besmetting van axonale projecties, maar ook kan een storende factor wanneer een gedefinieerde populatie van neuronen zal worden bestudeerd op een bepaalde site. Om deze kwesties te behandelen, hebben we onlangs een uitgebreide analyse van AAV serotypen en expressie cassettes te identificeren serotypes en initiatiefnemers die kunnen worden gebruikt om te minimaliseren of maximaliseren retrograde transductie uitgevoerd. In het kader van dit specifieke onderzoek in spinale circuits geanalyseerd wij het vermogen van verschillende serotypes en initiatiefnemers om retrogradely transduce neuronen in de achterwortelganglia, bevatten (DRG), de rostraal ventromediale medulla (RVM) en de Somatosensorische cortex 12. de techniek beschreven in dit protocol kan daarom worden gebruikt voor het analyseren van ruggenmerg neuronen op de injectieplaats of analyseren van projectie neuronen die inbreng op de ingespoten site van het ruggenmerg. In het protocol beschreven hier, worden drie injecties van rAAV in de linker kant van het lumbale ruggemerg uitgevoerd zodat transductie van neuronen in de drie lumbale segmenten (L3-L5). De L3-L5 segmenten ontvangen de meerderheid van de sensorische input het stuk ipsilaterale om de injectieplaats. Wij laten zien dat functionele manipulatie van genetisch gelabelde neuronen in L3-L5 voldoende te roepen robuuste gedragsveranderingen, waardoor het functionele bewijs voor de functie van de circuit van dergelijke een genetisch gelabelde neuron-subtype.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller</td>
			<td>Zeitz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator</td>
			<td>Weinmann</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat mat: Mio Star Thermocare 100</td>
			<td>Migros</td>
			<td>717614700000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Philips</td>
			<td>BT9290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical microscope (OPMI pico)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal stereotaxic apparatus</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurostar StereoDrive (optional)</td>
			<td>Neurostar</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-4811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD Ultra syringe pump with nanomite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 701 RN 10 &#956;l glass microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7635-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>55750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40</td>
			<td>Osada</td>
			<td>OS-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spherical cutter, 0.5mm</td>
			<td>Busch</td>
			<td>12001005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electronic von Frey anesthesiometer</td>
			<td>IITC</td>
			<td>23905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible von Frey hairs</td>
			<td>IITC</td>
			<td>#7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710 Pascal confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 NA &#215; 20 Plan-apochromat objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3 NA &#215; 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4, 13cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16121-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #2 laminectomy forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11223-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables and Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW 100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1, 5 and 20 ml)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>(9166917V, 4606051V, 4606205V)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G beveled needle</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4665457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpel blades</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>BB523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>C1046220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>C0932191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS or saline (0.9%)</td>
			<td></td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 70% (disinfectant)</td>
			<td></td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution (e.g. Braunol)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>18380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetics&#160; (e.g. Attane isoflurane)</td>
			<td>Provet</td>
			<td>2222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldasorber</td>
			<td>Provet</td>
			<td>333526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic)</td>
			<td>Indivior</td>
			<td>GTIN: 7680419310018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos)</td>
			<td>Pharma medica</td>
			<td>GTIN: 4031626710635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs (e.g. from)</td>
			<td>IVF Hartmann</td>
			<td>1628100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facial tissues (e.g. from)</td>
			<td>Uehlinger AG</td>
			<td>2015.10018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice&#160; (wildtype)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID:IMSR_JAX:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (ROR&#946;Cre)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID:IMSR_JAX:023526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP)</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV1963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP)</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-ALL854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-ALL864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA)</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Custom production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Custom production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>44361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.EF1&#945;.flex.hChR2(H134R)-eYFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDS42</td>
			<td>ScarabGenomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC 500</td>
			<td>Machery &#38; Nagel</td>
			<td>740574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clozapine-N-oxide (CNO)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BBL-NS105-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroquine diphosphate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>histamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies (dilution)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP (1:1000)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>RRID:AB_221570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NeuN (1:3000)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>RRID:AB_10711153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Pax2 (1 : 200)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>RRID:AB_10889828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000)</td>
			<td>Dr Carmen Birchmeier</td>
			<td>Muller et al. 2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFAP (1 : 1000)</td>
			<td>DakoCytomation</td>
			<td>RRID:AB_10013382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies raised in donkey (1:800)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adeno-associated virus-mediated transgene expression in genetically defined neurons of the spinal cord

Selectieve manipulatie van spinale neuronale subpopulaties is hoofdzakelijk bereikt door twee verschillende methoden: 1) Intersectional genetica, waarbij dubbele of driedubbele transgene muizen worden gegenereerd met het oog op een selectieve uitdrukking van een verslaggever of effector gen (bijvoorbeelduit de Rosa26 locus) in de gewenste spinale bevolking. 2) intraspinal injectie van Cre-afhankelijke recombinante adeno-associated virus (rAAV); Hier worden Cre-afhankelijke AAV vectoren codering voor de verslaggever of effector gen keuze ingespoten in het ruggenmerg van muizen uiting van Cre recombinase in de gewenste neuronale subpopulatie. Dit protocol beschrijft hoe te genereren van Cre-afhankelijke rAAV vectoren en hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg segmenten L3-L5 met rAAVs. Als de lumbale spinale segmenten L3-L5 zijn geïnnerveerd door die perifere sensoriële neuronen die sensorische informatie van de hindlimbs zenden, kunnen spontane gedrag en reacties op zintuiglijke tests toegepast naar de stuk ipsilaterale aan de zijkant van de injectie worden geanalyseerd om de functie van de gemanipuleerde neuronen in de sensorische verwerking ondervragen. We bieden voorbeelden van hoe deze techniek kan worden gebruikt voor het analyseren van genetisch gedefinieerd deelverzamelingen van ruggenmerg neuronen. De belangrijkste voordelen van virus-gemedieerde transgenic expressie in transgene muizen Cre in vergelijking met klassieke verslaggever transgenic muis-geïnduceerde expressie zijn de volgende: 1) verschillende Cre-afhankelijke rAAVs codering van verschillende verslaggever of effector eiwitten kunnen in een enkele Cre transgene lijn, dus het overwinnen van de noodzaak te creëren verschillende meerdere transgene muis lijnen geïnjecteerd. 2) intraspinal injectie beperkt manipulatie van Cre-uiten cellen op de injectieplaats en de tijd na de injectie. De belangrijkste nadelen zijn: 1) de genexpressie verslaggever van rAAVs is meer variabele. 2) chirurgie is vereist voor de transduce van het ruggenmerg neuronen van belang. Welke van de twee methoden meer geschikt is, hangt af van het neuron bevolking en onderzoek vraag worden aangepakt.

Om te illustreren de niveaus van de expressie die kunnen worden verkregen door het intraspinal injectie van rAAV codering van een marker-eiwit, we eerst geïnjecteerd AAV1. CAG.eGFP in de lumbale ruggemerg van wild-type muizen. Drie injecties verdeeld ongeveer 1 mm uit elkaar geproduceerd een bijna continue infectie van lumbale spinale segmenten L3 L5 (figuur 1A-C). Injectie van het virus op een diepte van 300 µm van het spinale oppervlak le...

Watch this Scientific Journal Video about Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord at JoVE.com

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Intraspinal injectie van recombinase afhankelijk recombinante adeno-associated virus (rAAV) kan worden gebruikt om te manipuleren alle genetisch gelabelde celtype in het ruggenmerg. Hier beschrijven we hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg. Deze techniek maakt functionele ondervraging van het subtype gemanipuleerde neuron.

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Elektrofysiologie II: Extracellulaire Suction Elektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Analyse van differentiële genexpressie in Geëlektroporeerde Chick Embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Diffusion Imaging in het Rat ruggenmerg

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

zebravis<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...