Name: adeno-associated virus-mediated transgene expression in genetically defined neurons of the spinal cord
Uploaded: 2018-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord at JoVE.com

Ringraziamo Hanns Ulrich Zeilhofer per sostenere generosamente questo lavoro. Hendrik Wildner è stata sostenuta dalla Fondazione Olga Mayenfisch. Ringraziamo Carmen Birchmeier per l'anticorpo di Lmx1b.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'ufficio veterinario cantonale svizzero (Zurigo) e sono in accordo e in conformità con tutte le pertinenti orientamenti normativi e istituzionali.
Nota: Tutti i materiali con rispettivi produttori e/o fornitori sono elencati nella Tabella materiali.
1. generazione di vettori AAV Cre-dipendente
Nota: Una varietà di vettori di Cre-dipendente con differenti promoto...

<ol>
	<li>Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+downunder:+an+update+from+the+spinal+cord.">Inhibition downunder: an update from the spinal cord.</a> Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).</li><li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).</li><li>Sandkuhler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+and+mechanisms+of+hyperalgesia+and+allodynia.">Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia.</a> Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).</li><li>Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+synaptic+inhibition+in+spinal+sensory+processing+and+pain+control.">Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control.</a> Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).</li><li>Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skilled+reaching+relies+on+a+V2a+propriospinal+internal+copy+circuit.">Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit.</a> Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).</li><li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Early+RET++Deep+Dorsal+Spinal+Cord+Interneurons+in+Gating+Pain.">Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain.</a> Neuron. 91 (6), 1413 (2016).</li><li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation,+silencing,+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch.">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li><li>Francois, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brainstem-Spinal+Cord+Inhibitory+Circuit+for+Mechanical+Pain+Modulation+by+GABA+and+Enkephalins.">A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins.</a> Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).</li><li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Horn+Circuits+for+Persistent+Mechanical+Pain.">Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain.</a> Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).</li><li>Petitjean, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Horn+Parvalbumin+Neurons+Are+Gate-Keepers+of+Touch-Evoked+Pain+after+Nerve+Injury.">Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury.</a> Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+local+and+descending+inputs+for+primary+sensory+neurons.">Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons.</a> J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).</li><li>Haenraets, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+nociceptive+circuit+analysis+with+recombinant+adeno-associated+viruses:+the+impact+of+serotypes+and+promoters.">Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters.</a> J Neurochem. , (2017).</li><li>Abraira, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+and+Synaptic+Architecture+of+the+Mechanosensory+Dorsal+Horn.">The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn.</a> Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).</li><li>Wildner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analysis+of+Ptf1a-+and+Ascl1-deficient+mice+reveals+new+markers+for+distinct+dorsal+horn+interneuron+populations+contributing+to+nociceptive+reflex+plasticity.">Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity.</a> J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).</li><li>Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+injection+of+a+viral+vector+for+conditional+gene+manipulation+in+the+mouse+spinal+cord.">Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord.</a> J Vis Exp. (73), e50313 (2013).</li><li>Kohro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+minimally-invasive+method+for+microinjection+into+the+mouse+spinal+dorsal+horn.">A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn.</a> Sci Rep. 5, 14306 (2015).</li><li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gate+control+of+mechanical+itch+by+a+subpopulation+of+spinal+cord+interneurons.">Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons.</a> Science. 350 (6260), 550-554 (2015).</li><li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control.">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li><li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain.">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li><li>Gutierrez-Mecinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preprotachykinin+A+is+expressed+by+a+distinct+population+of+excitatory+neurons+in+the+mouse+superficial+spinal+dorsal+horn+including+cells+that+respond+to+noxious+and+pruritic+stimuli.">Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli.</a> Pain. 158 (3), 440-456 (2017).</li><li>Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+boundaries+in+roof+plate+and+choroid+plexus+identified+by+intersectional+gene+activation.">Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation.</a> Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).</li><li>Kim, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+genetically+defined+neurons+to+behavior+through+a+broadly+applicable+silencing+allele.">Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele.</a> Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).</li><li>Kim, J. C., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate-mapping+approaches:+new+means+to+explore+the+embryonic+origins+of+the+cochlear+nucleus.">Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus.</a> Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).</li></ol>

Intraspinal iniezione di AAVs può diventare una tecnica potente in un laboratorio di ricerca, consentendo l'analisi delle cellule spinali con un'alta soluzione temporale e spaziale. Questo protocollo consente la trasduzione dei tre principali segmenti spinali innervati dai neuroni sensoriali, estendendo loro assoni periferici per l'arto posteriore. Transducing tre segmenti produce dati comportamentali robusti e riproducibili. Permette inoltre di test di un'area sensoriale più grande rispetto a possibili dopo una singol...

Il dorsale del midollo spinale è essenziale per lo scambio di informazioni tra la periferia del corpo e il cervello. Stimoli sensoriali quali calore, freddo, toccare, o stimoli nocivi vengono rilevati da neuroni periferici specializzati, che trasmettono queste informazioni ai neuroni del corno dorsale del midollo spinale. Qui, una complessa rete di interneuroni inibitorie ed eccitatorie modula e alla fine il informazioni sensoriali relè tramite i neuroni di proiezione spinale di supraspinal siti1,2. I calcoli effettuati da midollo spinale inter- e neuroni di proiezione informazioni sensoriali, determinando così le informazioni che sono soppresso o inoltrate a quale intensità del cancello. Cambiamenti nell'integrazione degli stimoli sensoriali, come ad esempio un equilibrio alterato tra inibizione ed eccitazione, possono causare disfunzioni sensoriali quali ipersensibilità o allodynia (sensazioni dolorose dopo stimolo normalmente non doloroso). Questi cambiamenti sono probabilmente che la causa del dolore cronico vari stati3,4. Così, circuiti spinali sono di grande importanza nell'elaborazione sensoriale e di conseguenza nella percezione di sé e ambiente di un organismo. Con il recente avvento e combinazione di genetica, molecolare e le tecniche chirurgiche che consentono la manipolazione precisa delle sottopopolazioni di neuroni spinali geneticamente identificati, gli scienziati ora stanno cominciando a capire i circuiti spinali sottostanti responsabile per l'elaborazione di distinte modalità sensoriali.
Iniezione intraspinal di rAAV nei topi wild-type o transgenici ha notevolmente contribuito alla comprensione della funzione di sottoinsiemi specifici di neuroni spinali5,6,7, , l'analisi e manipolazione 8 , 9 , 10 , 11. questa tecnica permette la consegna delle proteine marker (come GFP / proteine di fusione di GFP), proteine reporter (ad esempio GCaMP), o proteine effettrici (ad esempio tossine batteriche, channelrhodopsin o recettori farmacogenetici) nello spazio modo limitato ai neuroni spinali. Iniezione locale di Cre-dipendente rAAVs in topi transgenici che esprimono Cre ricombinasi in un sottoinsieme specifico dei neuroni spinali permette l'analisi specifica della rispettiva popolazione neuronale. Abbiamo impiegato questa tecnica di un'etichetta, l'ablazione, inibire o attivare glycinergic spinale neuroni dimostrando che sono una parte essenziale del cancello spinale controllo del dolore e prurito trasmissione7. In questi esperimenti, iniezione intraspinal di rAAV Cre-dipendente nei topi GlyT2::Cre abilitato la manipolazione selettiva dei neuroni glycinergic nel midollo spinale lombare. Quindi, manipolazione simultanea dei circuiti sovraspinali che contengono glycinergic neuroni critici per la sopravvivenza dell'animale può essere evitato.
Mentre un'iniezione intraspinal di rAAVs limita l'infezione al sito di iniezione, trasduzione virale può verificarsi non solo nei neuroni locali, ma anche nei neuroni che si connettono al sito di iniezione tramite proiezioni assonali. Quest'ultimo viene spesso utilizzato per aree cerebrali traccia che fornisce l'input di un neurone a un particolare nucleo nel cervello. L'infezione delle proiezioni axonal può, tuttavia, essere anche un fattore di confusione quando una popolazione definita dei neuroni deve essere studiata presso un determinato sito. Per risolvere questi problemi, abbiamo recentemente condotto un'analisi completa di AAV sierotipi e cassette di espressione per identificare i sierotipi e promotori che possono essere utilizzati per minimizzare o massimizzare la trasduzione retrograda. Nell'ambito di questa specifica ricerca in circuiti spinali, abbiamo analizzato la capacità di diversi sierotipi e promotori di trasdurre retrogradely neuroni a livello dei gangli della radice dorsale (DRG), il midollo rostrale ventromediale (RVM) e la corteccia somatosensoriale 12. la tecnica descritta in questo protocollo può essere utilizzata quindi per analizzare i neuroni spinali al sito di iniezione o per analizzare i neuroni di proiezione che forniscono l'input per il sito iniettato del midollo spinale. Nel protocollo descritto qui, tre iniezioni di rAAV nel lato sinistro del midollo spinale lombare vengono eseguite per abilitare la trasduzione dei neuroni nei tre segmenti lombari (L3-L5). I segmenti di L3-L5 ricevono la maggior parte dell'input sensoriale dall'arto posteriore ipsilateral al sito di iniezione. Dimostriamo che la manipolazione funzionale dei neuroni geneticamente con etichettati in L3-L5 è sufficiente per evocare cambiamenti comportamentali robusti, così fornendo la prova funzionale per il circuito in funzione di un sottotipo di neurone geneticamente con etichetta.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller</td>
			<td>Zeitz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator</td>
			<td>Weinmann</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat mat: Mio Star Thermocare 100</td>
			<td>Migros</td>
			<td>717614700000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Philips</td>
			<td>BT9290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical microscope (OPMI pico)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal stereotaxic apparatus</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurostar StereoDrive (optional)</td>
			<td>Neurostar</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-4811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD Ultra syringe pump with nanomite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 701 RN 10 &#956;l glass microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7635-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>55750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40</td>
			<td>Osada</td>
			<td>OS-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spherical cutter, 0.5mm</td>
			<td>Busch</td>
			<td>12001005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electronic von Frey anesthesiometer</td>
			<td>IITC</td>
			<td>23905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible von Frey hairs</td>
			<td>IITC</td>
			<td>#7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710 Pascal confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 NA &#215; 20 Plan-apochromat objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3 NA &#215; 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4, 13cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16121-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #2 laminectomy forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11223-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables and Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW 100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1, 5 and 20 ml)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>(9166917V, 4606051V, 4606205V)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G beveled needle</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4665457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpel blades</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>BB523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>C1046220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>C0932191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS or saline (0.9%)</td>
			<td></td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 70% (disinfectant)</td>
			<td></td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution (e.g. Braunol)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>18380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetics&#160; (e.g. Attane isoflurane)</td>
			<td>Provet</td>
			<td>2222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldasorber</td>
			<td>Provet</td>
			<td>333526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic)</td>
			<td>Indivior</td>
			<td>GTIN: 7680419310018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos)</td>
			<td>Pharma medica</td>
			<td>GTIN: 4031626710635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs (e.g. from)</td>
			<td>IVF Hartmann</td>
			<td>1628100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facial tissues (e.g. from)</td>
			<td>Uehlinger AG</td>
			<td>2015.10018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice&#160; (wildtype)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID:IMSR_JAX:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (ROR&#946;Cre)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID:IMSR_JAX:023526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP)</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV1963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP)</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-ALL854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-ALL864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA)</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Custom production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>Custom production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>44361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.EF1&#945;.flex.hChR2(H134R)-eYFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDS42</td>
			<td>ScarabGenomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC 500</td>
			<td>Machery &#38; Nagel</td>
			<td>740574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clozapine-N-oxide (CNO)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BBL-NS105-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroquine diphosphate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>histamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies (dilution)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP (1:1000)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>RRID:AB_221570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NeuN (1:3000)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>RRID:AB_10711153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Pax2 (1 : 200)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>RRID:AB_10889828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000)</td>
			<td>Dr Carmen Birchmeier</td>
			<td>Muller et al. 2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFAP (1 : 1000)</td>
			<td>DakoCytomation</td>
			<td>RRID:AB_10013382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies raised in donkey (1:800)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adeno-associated virus-mediated transgene expression in genetically defined neurons of the spinal cord

Manipolazione selettiva delle sottopopolazioni neuronali spinali è stato realizzato principalmente con due metodi differenti: 1) Intersezionali genetica, per cui vengono generati topi transgenici doppi o triplo per conseguire l'espressione selettiva di un giornalista o un effettore gene (ad es., dal locus Rosa26) nella popolazione spinale desiderata. 2) intraspinal iniezione di virus ricombinante adeno-associato Cre-dipendente (rAAV); qui vettori AAV Cre-dipendente che codifica per il gene reporter o effettore di scelta vengono iniettati nel midollo spinale di topi che esprimono Cre ricombinasi nella sottopopolazione neuronale desiderata. Questo protocollo viene descritto come generare dei vettori-rAAV Cre-dipendente e come trasduce neuroni nel corno dorsale del midollo spinale lombare L3-L5 dei segmenti con rAAVs. Come i segmenti spinali lombari L3-L5 sono innervate da quei neuroni sensoriali periferici che trasmettono informazioni sensoriali dalle zampe posteriori, comportamento spontaneo e le risposte al test sensoriali applicato per l'arto posteriore ipsilateral al lato di iniezione possono essere analizzati al fine di interrogare la funzione dei neuroni manipolati in elaborazione sensoriale. Forniamo esempi di come questa tecnica può essere utilizzata per analizzare geneticamente definita sottoinsiemi dei neuroni spinali. I principali vantaggi di espressione del transgene virus-mediate in topi transgenici Cre rispetto all'espressione indotta da mouse transgene reporter classica sono i seguenti: 1) diverse Cre-dipendente rAAVs codifica diverse proteine reporter o effettore può essere iniettato in una singola riga transgenica Cre, superando così la necessità di creare diversi mouse transgenico più linee. 2) intraspinal iniezione limita la manipolazione di cellule che esprimono Cre al sito di iniezione e per il tempo dopo l'iniezione. Gli svantaggi principali sono: 1) espressione di gene Reporter da rAAVs è più variabile. 2) chirurgia è necessaria per trasdurre i neuroni spinali di interesse. Quale dei due metodi è più appropriato dipende dalla domanda di ricerca e di popolazione di neurone da affrontare.

Al fine di illustrare i livelli di espressione che possono essere ottenuti tramite l'iniezione intraspinal di rAAV codifica una proteina marker, abbiamo iniettato prima AAV1. CAG.eGFP nel midollo spinale lombare di topi wild-type. Tre iniezioni a distanza di circa 1 mm prodotta un'infezione quasi continua dei segmenti spinali lombari L3 a L5 (Figura 1A-C). Iniezione di virus ad una profondità di 300 µm dalla superficie spinale conduce all'i...

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Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Espressione del Transgene di mediata da Virus adeno-associato in neuroni geneticamente definiti del midollo spinale

L'iniezione intraspinal di recombinase dipendente ricombinanti virus adeno-associato (rAAV) può essere utilizzato per manipolare qualsiasi tipo di cellula geneticamente etichettati nel midollo spinale. Qui descriviamo come trasduce neuroni nel corno dorsale del midollo spinale lombare. Questa tecnica consente funzionale interrogatorio del sottotipo del neurone manipolati.

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

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