Name: long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel
Uploaded: 2018-05-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel at JoVE.com

AFB, MAV og NJG gerne takke Ryan Quinton for kommentarer til manuskriptet og Adrian områder for TDRFP-NLS konstruktion. AFB og MAV er finansieret af NIGMS Biomolekylær farmakologi uddannelse Grant 5T32GM008541. NJG er medlem af Shamim og Ashraf Dahod bryst kræft forskningslaboratorier og understøttes af NIH tilskud GM117150 og CA-154531, Karin Grunebaum Foundation, Smith familie Awards Program, programmet Searle lærde og melanom forskning Alliance.

Denne protokol fokuserer på brug af ikke-transformeret og chromosomally stabile retinal pigmenteret epitel (ÅV-1) celle linjen til live-celle imaging eksperimenter. Denne protokol kan tilpasses til enhver vedhængende cellelinie, så længe celle dyrkningsbetingelserne er tilpasset efter behov. Alle procedurer skal overholde institutionelle biosikkerhed og etiske retningslinjer og forordninger.
1. forberede celler til Live-celle Imaging
<ol><li>
Brug frisk optøede og tidlige passa...

Det mest kritiske aspekt af langsigtede live-celle imaging er at sikre sundheden for cellerne at blive afbildet. Det er vigtigt, at celler blive udsat for minimal uvedkommende miljømæssige stressfaktorer, såsom substandard betingelser med hensyn til temperatur, fugtighed, og/eller CO2 niveauer. Det er også vigtigt at begrænse solskader fra fluorescerende excitation belysning, som imaging stress er kendt for at påvirke celle adfærd50. Begrænse solskader kan opnås på flere måde...

Anti-mitotiske narkotika har længe været anvendt i de kemoterapeutiske regimer af forskellige typer af solide tumorer og viser ofte stor effekt1,2,3. Mekanisk, disse stoffer forstyrrer normal mitotiske progression og fremme mitotiske anholdelse i hurtigt prolifererende kræftceller. Celle skæbne som svar på mitotiske anholdelse er dog meget varierende: mens en brøkdel af celler gennemgår celledød direkte fra mitose, andre afslutte mitosen og vende tilbage til interphase som tetraploide celler (en proces, der kaldes mitotiske skred)4, 5,6,7,8. Disse interphase celler kan udføre apoptose, gennemgå permanent celle-cyklus anholdelse eller endda genindtræde den celle cyklus4,5,6,7,8,9 ,10,11. Celler, der unddrager sig mitotiske celledød ved at glide over i interfase, kun til at genindtaste den celle cyklus efter narkotika fjernelse, kan derfor bidrage til re-fremkomsten af kræft cellepopulationer. Derudover tilbagefald celler at glide fra mitosen tetraploide, og tetraploidy er kendt for at fremme kromosom ustabilitet, der driver tumor12,13,14,15. Definere de faktorer, der styrer celle skæbne i svar til anti-mitotiske lægemiddelsbehandlinger er derfor kritisk at optimere nuværende therapeutics.
I denne protokol beskriver vi metoder til direkte observere og undersøge skæbnen af celler, der gennemgår langvarig mitotiske anholdelse i svar på den anti-mitotiske drug paclitaxel. Paclitaxel er en etableret terapeutiske i klinikken og har vist sig meget effektiv i mange typer af tumorer, herunder dem i bryst, æggestokke og lunger16,17,18,19, 20. Paclitaxel, som er en plante alkaloid stammer fra bark af Yew tree, stabiliserer mikrotubuli og dermed forhindrer deres dynamik21,22. Mens dæmpning af mikrotubulus dynamics af paclitaxel ikke påvirker cellecyklus progression fra G1 til G2, fører stoffet til vedvarende aktivering af spindel forsamling checkpoint under mitosen af hindrer kinetochore-mikrotubulus vedhæftet fil (gennemgået i dybden her23,24)25. Som følge heraf hindres anaphase debut med paclitaxel-behandlede celler og resulterer i en langvarig mitotiske anholdelse.
Denne protokol vil først beskrive tilgange for at identificere mitotiske celler i live-celle imaging eksperimenter. Mitose kan visualiseres i vedhængende væv kultur celler på grund af to mærkbar celle biologiske ændringer. Først, kromosomer blive meget kondenseret umiddelbart før nuklear kuvert opdeling. Mens ofte påvises ved standard fasekontrast mikroskopi, kan kromosom kondens mere tydeligt påvises ved hjælp af fluorescerende tags at etiketten kromosomer (f.eks. fluorescently mærket Histon proteiner). Andet, mitotiske celler kan også identificeres ved de dramatiske morfologiske ændringer, der skyldes celle afrunding.
Denne protokol vil så vise, hvordan live-celle Billeddannende metoder til at spore skæbner af celler oplever langvarig mitotiske anholdelse. Celler anholdt i mitosen undergår en af tre forskellige skæbner. Første kan celler gennemgå celledød under mitosen. Dette fænomen er let visualiseres ved lysmikroskopi, som døende celler er observeret at skrumpe, bleb, og/eller brud. For det andet celler kan forlade mitosen og vende tilbage tilbage til interphase uden kromosom segregation eller cytokinesis, en proces, der kaldes mitotiske skred. Decondensation af kromosomer og/eller udfladning af cellen mitotiske let identificerer denne proces. Celler, der glider fra mitose også ofte vise uregelmæssig, multi fliget kerner og ofte harbor adskillige mikronukleus5. For det tredje kan celler anholdt i mitosen indlede anaphase og fortsætte gennem mitosen efter en lang forsinkelse. Mens ualmindeligt i højere koncentrationer, stof, antyder denne adfærd at de anholdte celler kan have opfyldt spindel forsamling checkpoint, eller at spindel forsamling checkpoint er delvist svækket eller defekt. Anaphase debut kan visualiseres ved kromosom adskillelse og efterfølgende cytokinesis ved hjælp af live-celle billeddannelse.
Live-celle Billeddannende metoder til at spore skæbnen af celler, der unddrager sig mitotiske celledød af gennemgår mitotiske skred vil også blive beskrevet. Celler, der undergår mitotiske skred enten dø i den efterfølgende interfase, udløse et holdbart G1 celle cyklus anholdelse, eller genindtræde den celle cyklus for at igangsætte en ny runde af celledeling4. Fremgangsmåde ved hjælp af FUCCI (fluorescerende ubiquitination-baserede cellecyklus indikator) system til at bestemme brøkdel af celler, der igen indtaste celle cyklus efter mitotiske skred vil blive beskrevet. FUCCI giver mulighed for direkte visualisering af G1/S overgang og kan bruges sammen med langsigtede live-celle imaging både in vitro- og i vivo26,27. FUCCI-systemet tager fordel af to fluorescently mærket proteiner, afkortet former for hCdt1 (kromatin licenser og DNA-replikation faktor 1) og hGeminin, hvis niveauet svinger baseret på celle cyklus holdning. hCdt1 (smeltet til en rød fluorescerende proteiner) er til stede i høje niveauer i G1 fase hvor det virker til at licensere DNA til replikering, men er ubiquitinated ved E3 ubiquitin ligase SCFSkp2 og forringet under S/G2/M faser at forhindre re replikation af DNA26. Derimod hGeminin (smeltet til en grøn fluorescerende proteiner), er en hæmmer af hCdt1 hvis niveauer peak under S/G2/m, men er ubiquitinated ved E3 ubiquitin ligase APCCdh1 og nedbrudt i slutningen af mitosen og hele G1 26. Følgelig FUCCI leverer en ligetil fluorescens udlæsning af cellecyklus fase, som cellerne udviser rød fluorescens under G1, og grøn fluorescens under S/G2/m. FUCCI systemet er et betydeligt fremskridt over andre metoder (f.eks. bromodeoxyuridine farvning) at identificere proliferativ celler, fordi det ikke kræver celle fiksering og giver mulighed for enkelt celle tænkelig uden behov for yderligere farmakologiske behandlinger til at synkronisere cellepopulationer. Selvom ikke drøftet i denne protokol, er yderligere live-celle sensorer også blevet udviklet for at visualisere cellecyklus progression, herunder en helicase B sensor for G128, DNA ligase-RFP29 og PCDNA-NGL30 sensorer for S-fase, og den seneste FUCCI-4 sensor, som registrerer alle faser i cellecyklus31.
Endelig, en live-celle billedmetoden til at opdage nukleare kuvert brud vil blive beskrevet. Nylige undersøgelser har afsløret, at de nukleare konvolutter af kræftceller er ustabil og udsat for brister, hvorved indholdet af nukleoplasmaet og cytoplasma at intermix. Dette fænomen, såkaldte nukleare brud, kan fremme DNA-skader og stimulation af det medfødte immunforsvar32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. mens de underliggende årsager til nukleare brud forblive ufuldstændigt karakteriseret, er det kendt at deformationer i nukleare struktur korrelerer med en øget forekomst af nukleare brud42. En velkendt effekt af paclitaxel behandling er generation af påfaldende unormal nukleare strukturer efter mitosen; som sådan er vil en metode, ved hjælp af live-celle imaging til at opgøre nukleare brud blive beskrevet, samtidig med at udforske hvis paclitaxel behandling øger hyppigheden af nukleare brud begivenheder. Nukleare brud kan påvises ved den observerede lækage af en nuklear-målrettet fluorescerende proteiner i cytoplasma (f.eks. en tandem dimer gentage af RFP smeltet til en nuklear lokalisering signal, TDRFP-NLS). Denne lækage er tydeligt synlige med det blotte øje, som giver mulighed for enkel kvantitering af brud begivenheder.
Denne protokol kræver en widefield epifluorescensmikroskop, der er udstyret med et kodet Stadium og autofokus software. Den indkodede tidspunkt giver mulighed for præcis automatiserede bevægelse defineret X-Y koordinaterne, mens autofokus software fastholder celler i fokus for varigheden af perioden billeddannelse. Derudover denne protokol kræver udstyr at opretholde celler ved 37 ° C med fugtet 5% CO2 atmosfære. Dette kan opnås ved omslutter hele mikroskop i en temperatur og atmosfære kontrolleret kabinet, eller ved hjælp af fase-top enheder der lokalt fastholder temperatur og miljø. Fasekontrast målet anvendes i denne protokol er en plan fluor 10 x med en numerisk blænde på 0,30. 20 X mål er imidlertid også tilstrækkelige til at identificere både afrundede mitotiske og fladtrykte interphase celler i en enkelt fokalplan. Hvis udfører fasekontrast kan imaging (som beskrevet i denne metode), dækslet være enten glas eller plastik. Differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi anvendes, er det bydende nødvendigt at bruge et glas dækning til at forhindre depolarisering af lys.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>phenol red-free, DMEM:F12 media</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3027202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>50-753-3104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well glass bottomed imaging dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P12-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>TSZ Chem</td>
			<td>RS036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NC0215085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Chamber</td>
			<td>In Vivo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Z03NI7432000201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm polystyrene tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5804R 15 amp Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>97007-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 microliters Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 microliters Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette Tips</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>p1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette Tips</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Galaxy 170S</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO17011005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Boy</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>500-H117P1N4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>500-H31XYZE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Digital Camera</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>D10NLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS Elements AR Software</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MQS31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA LED Illuminator for Fluorescence</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>SOLA-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>Ti-IVS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEP59391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-C System Condenser Turret</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEL51000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEL56200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te-C LWD Ph1 Module</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEH41100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MRH10101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel

Live-celle imaging er en kraftfuld teknik, der kan bruges til direkte visualisere biologiske fænomener i enkelt celler over længere perioder. I det sidste årti, har nye og innovative teknologier stærkt forbedret den praktiske gennemførlighed af live-celle billeddannelse. Celler kan nu holdes i fokus og løbende afbildet over flere dage, mens vedligeholdt under 37 °C og 5% CO2 celle kultur betingelser. Desuden kan flere felter i visningen repræsenterer forskellige eksperimentelle betingelser erhverves samtidig, hvilket giver høj overførselshastighed eksperimentelle data. Live-celle imaging giver en betydelig fordel over fast-celle billeddannelse ved at tillade direkte visualisering og tidsmæssige kvantitering af dynamiske cellulære begivenheder. Live-celle imaging kan også identificere variation i adfærden af enkelt celler, der ville ellers have været savnet ved hjælp af befolkningen-baserede assays. Her beskriver vi live-celle imaging protokoller for at vurdere celle skæbne afgørelser efter behandling med anti-mitotiske drug paclitaxel. Vi demonstrere, metoder til at visualisere om mitotically arresteret celler dør direkte fra mitose eller glide tilbage ind i interfasen. Vi beskriver også, hvordan fluorescerende ubiquitination-baserede cellecyklus indikator (FUCCI) systemet kan bruges til at vurdere brøkdel af interphase celler født fra mitotiske skred, der er i stand til at re-indtastning af cellecyklus. Endelig, vi beskriver en live-celle tænkelig metode til at identificere nukleare kuvert brud begivenheder.

Ved hjælp af protokollen, der er beskrevet ovenfor, var RPE-1 celler udtrykker H2B-normal god landbrugspraksis behandlet med en anti-mitotiske eller køretøjet kontrol (DMSO) og analyseres af live-celle billeddannelse. Analysen viste, at 100% af kontrol mitotiske ÅV-1 celler indledt anaphase gennemsnitligt 22 min. efter indtastning mitosen (figur 1A, 1 D). Derimod udstillet ÅV-1 celler behandles med paclitaxel en dyb mitotiske arrestordre...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel at JoVE.com

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-celle imaging giver et væld af oplysninger om enkelt celler eller hele befolkninger der er uopnåelig af faste celle imaging alene. Her, er live-celle imaging protokoller at vurdere celle skæbne beslutninger efter behandling med anti-mitotiske drug paclitaxel beskrevet.

Langsigtet Live-celle Imaging for at vurdere celle skæbne i svar til Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Langsigtet High-Resolution Intravital Mikroskopi i Lung med en Vacuum Stabiliseret Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation af zebrafisk-pædiatriske hjernetumorer til immunkompetente værter til langvarig undersøgelse af tumorcelleradfærd og lægemiddelrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live celle billeddannelse af den TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro og In Vivo ved hjælp af en Adenovirus Reporter System

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Oprettelse af cellelinjer overekspression DR3 for at vurdere den apoptotiske reaktion på anti-mitotiske Therapeutics

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinel Intravital Imaging af hjerne tumor celle adfærd som reaktion på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Multiparametrisk tumororganoid lægemiddelscreening ved hjælp af widefield levende cellebilleddannelse til bulk- og enkeltorganoidanalyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimering af ydeevneparametre for TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Ovarian Cancer Organoid Passaging and Cryopreservation for Long-Term Organoid Cultivation

Ovariecancer organoid forbikørsel og kryopræservering til langsigtet organoid dyrkning