Name: long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel
Uploaded: 2018-05-14T13:00:00
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AFB, MAV e NJG vorrei ringraziare Ryan Quinton per commenti sul manoscritto e Adrian spera per il costrutto TDRFP-NLS. AFB e MAV sono finanziate con il 5T32GM008541 di NIGMS biomolecolari farmacologia Training Grant. NJG è un membro del Shamim e laboratori di ricerca di Ashraf davil seno cancro ed è supportato da sovvenzioni NIH GM117150 e CA-154531, la Karin Grunebaum Foundation, il programma di premi famiglia Smith, il programma di studiosi di Searle e la ricerca di Melanoma Alliance.

Questo protocollo si concentra sull'utilizzo la non trasformate e cromosomicamente stabile retinico pigmentato epiteliale (RPE-1) linea cellulare per imaging esperimenti cellule vive. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato a qualsiasi linea di cellulari aderenti, purché le condizioni di coltura delle cellule vengono regolati secondo necessità. Tutte le procedure devono rispettare istituzionale biosicurezza e orientamenti etici e regolamenti.
1. preparare le celle per Live cell Imagin...

L'aspetto più critico di formazione immagine di cellule vive a lungo termine è garantire la salute delle cellule essere imaged. È essenziale che le cellule esposte al minimo stress ambientali estranei, quali condizioni scadenti per quanto riguarda la temperatura, umidità e/o livelli di CO2 . È anche importante limitare photodamage da illuminazione fluorescente eccitazione, come lo stress di imaging è conosciuto per interessare cella comportamento50. Limitando photodamage può avve...

Farmaci anti-mitotici lungamente sono stati usati nei regimi chemioterapeutici di vari tipi di tumori solidi e spesso mostrano grande efficacia1,2,3. Meccanicistico, queste droghe perturbare la normale progressione mitotica e promuovere arresto mitotico in rapidamente di proliferazione delle cellule tumorali. Tuttavia, il destino delle cellule in risposta all'arresto mitotico è altamente variabile: mentre una frazione delle cellule subisce la morte delle cellule direttamente dalla mitosi, altri uscire dalla mitosi e tornare a interfase come cellule tetraploidi (un processo definito slittamento mitotico)4, 5,6,7,8. Queste cellule di interfase possono eseguire apoptosi, subire l'arresto del ciclo cellulare permanente o anche immettere nuovamente il ciclo cellulare4,5,6,7,8,9 ,10,11. Cellule che eludere la morte delle cellule mitotiche scivolando nell'interfase, solo di inserire nuovamente il ciclo cellulare dopo la rimozione del farmaco, pertanto possono contribuire per il re-emergence di popolazioni di cellule di cancro. Inoltre, cellule che slittamento da mitosi sono tetraploide e tetraploidy è conosciuta per promuovere l'instabilità del cromosoma che spinge tumore ricadono12,13,14,15. Definire i fattori che controllano il destino delle cellule in risposta ai trattamenti farmacologici anti-mitotico è quindi fondamentale per ottimizzare terapeutica corrente.
In questo protocollo, descriviamo i metodi per direttamente osservare e studiare il destino delle cellule che subiscono prolungato arresto mitotico in risposta al paclitaxel della droga anti-mitotico. Paclitaxel è un consolidato terapeutico nella clinica e si è dimostrato altamente efficace in molti tipi di tumori, compresi quelli del seno, delle ovaie e polmoni16,17,18,19, 20. Paclitaxel, che è un alcaloide vegetale derivato dalla corteccia dell'albero del Yew, stabilizza i microtubuli e quindi impedisce la loro dinamicità21,22. Mentre la bagnatura della dinamica dei microtubuli da paclitaxel non influisce la progressione del ciclo cellulare da G1 e G2, la droga portano alla attivazione sostenuta del checkpoint montaggio mandrino durante la mitosi ostacolando allegato microtubulo-cinetocore (rivisto in profondità qui23,24)25. Di conseguenza, inizio anafase è impedito in cellule trattate con paclitaxel e risultati in un prolungato arresto mitotico.
Questo protocollo descriverà primi approcci per identificare cellule mitotiche in cellule vive imaging esperimenti. Mitosi possono essere visualizzati in cellule di coltura del tessuto aderente a causa di due cambiamenti biologici evidente delle cellule. In primo luogo, i cromosomi diventano altamente condensati immediatamente prima della ripartizione busta nucleare. Mentre spesso rilevabile da microscopia di contrasto di fase standard, condensazione del cromosoma può essere più chiaramente rilevato usando fluorescente Tag che cromosomi di etichetta (ad esempio alle proteine istoniche fluorescente etichettati). In secondo luogo, mitotiche cellule possono essere identificate anche dai drammatici cambiamenti morfologici risultanti dall'arrotondamento delle cellule.
Questo protocollo quindi dimostrerà come utilizzare approcci di imaging di cellule vive per tenere traccia i destini delle cellule vivendo prolungato arresto mitotico. Arrestato in mitosi le cellule subiscono una delle tre Parche distinti. In primo luogo, le cellule possono subire la morte delle cellule durante la mitosi. Questo fenomeno è visualizzato prontamente da microscopia chiara, come le cellule morte sono osservate per termoretraibile, vescichetta, e/o rottura. In secondo luogo, le cellule possono uscire dalla mitosi e ritorna alla interfase senza segregazione cromosomica o citochinesi, un processo definito slittamento mitotico. La decondensazione dei cromosomi e/o l'appiattimento della cella mitotica prontamente identifica questo processo. Le cellule che scivolare dalla mitosi spesso anche visualizzare i nuclei irregolari, multi-lobi e frequentemente harbor diversi micronuclei5. In terzo luogo, cellule arrestate nella mitosi possono avviare anafase e procedere attraverso mitosi dopo un lungo ritardo. Mentre raro alle più alte concentrazioni di farmaco, questo comportamento suggerisce che le cellule arrestate potrebbero hanno soddisfatto il checkpoint di montaggio del mandrino, o che il checkpoint di montaggio del mandrino è parzialmente indebolito o difettoso. Insorgenza di anafase possa essere visualizzata da segregazione del cromosoma e citochinesi successiva usando la formazione immagine di cellule vive.
Metodi di formazione immagine di cellule vive per tenere traccia il destino delle cellule che eludere la morte delle cellule mitotiche subendo lo slittamento mitotic inoltre saranno descritto. Cellule che subiscono lo slittamento mitotico muoiono nel interphase successivo, innescano un arresto del ciclo cellulare di1 G durevole o immettere nuovamente il ciclo cellulare per avviare un nuovo ciclo di divisione cellulare4. Verrà descritto un approccio utilizzando il sistema FUCCI (indicatore fluorescente ciclo cellulare basato su ubiquitinazione) a determinare la frazione di cellule che immettere nuovamente il ciclo cellulare seguendo lo slittamento mitotico. FUCCI consente la visualizzazione diretta della transizione G1/s e può essere utilizzato in combinazione con-vivere-cella a lungo termine sia in vitro che in vivo26,27di imaging. Il sistema FUCCI si avvale di due proteine fluorescente contrassegnati, troncate forme di hCdt1 (replicazione del DNA e della cromatina licenze factor 1) e hGeminin, i cui livelli oscillano basato sulla posizione del ciclo cellulare. hCdt1 (fuso a una proteina fluorescente rossa) è presente a livelli elevati durante la fase di1 G dove agisce per ottenere la licenza per la replica del DNA, ma viene ubiquitinata da E3 ubiquitina ligasi SCFSkp2 e degradati durante fasi / m2S/G per prevenire ri-replica del DNA26. Al contrario, hGeminin (fuso a una proteina fluorescente verde), è un inibitore della hCdt1 cui livella il picco durante S/G2/m, ma viene ubiquitinata da E3 ubiquitina ligasi APCCdh1 e degradato alla fine della mitosi e in tutto G1 26. di conseguenza, FUCCI offre una lettura semplice fluorescenza della fase del ciclo cellulare, come le cellule presentano fluorescenza rossa durante la fluorescenza di1 e verde di G durante S/G2/m. Il sistema FUCCI è un progresso significativo sopra altri approcci (come la bromodeossiuridina colorazione) per identificare cellule proliferative, perché non richiede fissazione delle cellule e permette per l'imaging di singola cellula senza la necessità di ulteriore farmacologico trattamenti per sincronizzare le popolazioni delle cellule. Anche se non discussi in questo protocollo, sensori aggiuntivi di cellule vive sono stati sviluppati anche per prevedere la progressione del ciclo cellulare, tra cui un sensore di helicase B per G128, DNA ligasi-RFP29 e PCDNA-GFP30 sensori per la fase S e il recente sensore di FUCCI-4, che rileva tutte le fasi del ciclo cellulare31.
Infine, sarà descritto un metodo di imaging di cellule vive di rilevare la rottura involucro nucleare. Recenti studi hanno rivelato che le buste di nucleare delle cellule di cancro sono instabile e soggetta a rottura, consentendo in tal modo il contenuto del nucleoplasma e citoplasma di combinare. Questo fenomeno, chiamato nucleare rottura, può promuovere il danno del DNA e la stimolazione della risposta immunitaria innata32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. mentre le cause di rottura nucleare rimangono in modo incompleto caratterizzate, è noto che le deformazioni nella struttura nucleare correlano con un'aumentata incidenza di rottura nucleare42. Un effetto ben noto di trattamento del paclitaxel è la generazione di strutture nucleari in maniera sconvolgente anormali seguendo la mitosi; come tale, sarà descritto un metodo che utilizza cellule vive di imaging nucleare rottura di quantificare, esplorando anche se il trattamento del paclitaxel aumenta la frequenza degli eventi di rottura nucleare. Nucleare rottura può essere rilevata tramite la perdita osservata di una proteina fluorescente nucleare-mirati nel citoplasma (ad es. un dimero di tandem ripetere di RFP fusa ad un segnale di localizzazione nucleare, TDRFP-NLS). Questa perdita è distintamente visibile dall'occhio, che consente la semplice quantificazione degli eventi di rottura.
Questo protocollo richiede un microscopio a epifluorescenza widefield che è dotato di un palco codificato e il software di messa a fuoco automatica. La fase di codificato permette per movimento preciso automatizzato a definite le coordinate X-Y, mentre il software di messa a fuoco automatica mantiene le cellule a fuoco per tutta la durata del periodo di formazione immagine. Inoltre, questo protocollo richiede attrezzature per mantenere le cellule a 37 ° C con umidificati 5% CO2 ambiente. Ciò può essere ottenuto racchiudendo l'intero microscopio all'interno una temperatura e atmosfera controllata recinzione, o mediante dispositivi di palcoscenico-top che localmente mantiene temperatura e ambiente. L'obiettivo di contrasto di fase utilizzato in questo protocollo è un piano fluor 10 x con un'apertura numerica di 0,30. Tuttavia, 20 X obiettivi sono anche sufficienti a identificare sia cellule arrotondate interfase mitotic e appiattita in un unico piano focale. Se eseguendo il contrasto di fase di imaging (come descritto in questo metodo), il coperchio può essere in vetro o in plastica. Se viene utilizzata la microscopia di contrasto (DIC) di differenziale di interferenza, è imperativo utilizzare un coperchio di vetro per impedire la depolarizzazione della luce.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>phenol red-free, DMEM:F12 media</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3027202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>50-753-3104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well glass bottomed imaging dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P12-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>TSZ Chem</td>
			<td>RS036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NC0215085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Chamber</td>
			<td>In Vivo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Z03NI7432000201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm polystyrene tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5804R 15 amp Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>97007-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 microliters Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 microliters Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette Tips</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>p1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette Tips</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Galaxy 170S</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO17011005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Boy</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>500-H117P1N4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>500-H31XYZE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Digital Camera</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>D10NLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS Elements AR Software</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MQS31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA LED Illuminator for Fluorescence</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>SOLA-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>Ti-IVS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEP59391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-C System Condenser Turret</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEL51000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEL56200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te-C LWD Ph1 Module</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEH41100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MRH10101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel

Cellule vive imaging è una tecnica potente che può essere utilizzata per visualizzare direttamente i fenomeni biologici in singole cellule per lunghi periodi di tempo. Nell'ultimo decennio, nuove ed innovative tecnologie notevolmente hanno aumentato la praticità dell'imaging di cellule vive. Le cellule possono ora essere tenute a fuoco e continuamente immaginata durante diversi giorni mentre tenute sotto 37 °C e 5% CO2 condizioni di coltura delle cellule. Inoltre, molteplici campi di vista che rappresentano diverse condizioni sperimentali possono essere acquisite contemporaneamente, così fornendo dati sperimentali ad alta velocità. Formazione immagine della vivere-cella fornisce un vantaggio significativo rispetto formazione immagine fissa-cella, consentendo la visualizzazione diretta e la quantificazione temporale degli eventi cellulari dinamici. Formazione immagine della vivere-cella può anche identificare variazioni nel comportamento di singole cellule che sarebbe altrimenti stato perso utilizzando dosaggi basati sulla popolazione. Qui, descriviamo protocolli di imaging di cellule vive per valutare le decisioni di destino delle cellule dopo il trattamento con il paclitaxel della droga anti-mitotico. Dimostriamo di metodi per visualizzare se mitotically arrestato le cellule muoiono direttamente dalla mitosi o scivolare indietro in interfase. Inoltre descriviamo come il sistema di indicatori (FUCCI) fluorescente ubiquitinazione ciclo cellulare può essere utilizzato per valutare la frazione di cellule di interfase Nato da slittamento mitotic che sono in grado di immettere nuovamente il ciclo cellulare. Infine, descriviamo un metodo di imaging di cellule vive per identificare gli eventi di rottura involucro nucleare.

Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, cellule RPE-1 esprimendo H2B-GFP sono state trattate con un controllo anti-mitotico o veicolo (DMSO) e analizzate da formazione immagine di cellule vive. L'analisi ha rivelato che 100% di cellule RPE-1 mitotic controllo avviato anafase una media di 22 min dopo aver inserito la mitosi (Figura 1A, 1D). Al contrario, le cellule RPE-1 trattate con paclitaxel ha esibito un arresto mitotico profond...

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Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Formazione immagine della vivere-cella fornisce una ricchezza di informazioni su singole cellule o di intere popolazioni che è irraggiungibile da cella fissa imaging da solo. Qui, i protocolli di imaging di cellule vive per valutare le decisioni di destino delle cellule dopo il trattamento con il paclitaxel della droga anti-mitotico sono descritti.

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