Name: long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel
Uploaded: 2018-05-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel at JoVE.com

AFB, MAV og NJG ønsker å takke Ryan Quinton for kommentarer på manuskriptet og Adrian Saliske for den TDRFP-NLS-konstruksjonen. AFB og MAV er finansiert av NIGMS Biomolecular farmakologi trening Grant 5T32GM008541. NJG er medlem av Shamim og Ashraf Dahod Breast Cancer Research Laboratories og støttes av NIH tilskudd GM117150 og CA-154531, Karin Grunebaum Foundation, Smith familie Awards programmet, programmet Searle forskere og melanom forskning Alliansen.

Denne protokollen fokuserer på bruk av ikke-transformert og chromosomally stabile retinal pigmentert epiteliale (RPE-1) cellen linjen for live-celle tenkelig eksperimenter. Men kan denne protokollen tilpasses alle tilhenger celle linje så lenge cellen oppdrettsforholdene justeres etter behov. Alle prosedyrer må overholde institusjonelle biosikkerhet og etiske retningslinjer og regler.
1. klargjør celler for Live-celle Imaging
<ol><li>
Bruke fersk tinte og tidlig passering RPE-1 c...

Det viktigste aspektet av langsiktig live-celle imaging er å sikre helsen til cellene blir fotografert. Det er viktig at celler bli utsatt for minimalt overflødig miljø stressorer, som substandard forhold vedrørende temperatur, fuktighet eller CO2 -nivåer. Det er også viktig å begrense photodamage fra fluorescerende eksitasjon belysning, som imaging stress er kjent for å påvirke celle atferd50. Begrense photodamage kan oppnås på flere måter som beskrevet andre steder<sup cla...

Anti-mitotisk narkotika har lenge vært brukt i de chemotherapeutic regimer av ulike typer solide svulster og ofte viser stor effekt1,2,3. Mechanistically, disse stoffene forstyrre normal mitotisk progresjon og fremme mitotisk arrestasjon i raskt voksende kreftceller. Men cellen skjebne svar mitotisk arrestasjonen er svært variabel: mens en brøkdel av cellene gjennomgår celledød direkte fra mitose, andre avslutte mitose og gå tilbake til interphase som tetraploid celler (en prosess kalt mitotisk glidning)4, 5,6,7,8. Disse interphase cellene kan utføre apoptose, gjennomgå permanente celle syklus arrestasjon eller selv re-Enter celle syklus4,5,6,7,8,9 ,10,11. Celler som unngå mitotisk celledød ved slipping i interphase, bare å skrive inn celle syklus etter narkotika, derfor bidra til re-fremveksten av kreft celle populasjoner. Videre tilbakefall celler at slip fra mitose er tetraploid, og tetraploidy er kjent for å fremme kromosom ustabilitet som driver svulst12,13,14,15. Definere faktorer som kontrollerer celle skjebne svar på anti-mitotisk medikamentelle behandlinger er derfor viktig å optimalisere gjeldende therapeutics.
I denne protokollen beskriver vi metoder for å direkte observere og studere skjebnen til celler som gjennomgår langvarig mitotisk arrestasjonen svar på anti-mitotisk stoffet paklitaxel. Paklitaxel er en etablert terapeutiske i klinikken og har vist seg svært effektiv i mange svulster typer, inkludert de av bryst, eggstokker og lungene16,17,18,19, 20. paklitaxel, som er en plante alkaloid fra Barken av barlind treet, stabiliserer piskehale som henger og dermed hindrer deres dynamicity21,22. Mens dempe av microtubule dynamikk av paklitaxel ikke påvirker cellen syklus progresjon fra G1 -G2, fører stoffet til vedvarende aktivering av spindelen montering sjekkpunkt under mitose ved å hindre kinetochore-microtubule vedlegg (omtalt i dybden her23,24)25. Som en konsekvens, deaktiveres anaphase utbruddet i paklitaxel-behandlet celler og resultater i en langvarig mitotisk arrestasjon.
Denne protokollen først beskrive tilnærminger identifisere mitotisk celler i live-celle tenkelig eksperimenter. Mitose kan visualiseres i tilhenger vev kultur celler på grunn av to merkbare celle biologiske endringer. Først bli kromosomene svært kondensert umiddelbart før kjernefysiske konvolutten sammenbrudd. Mens ofte oppdages av standard kontrast mikroskopi, kan kromosom kondens klarere oppdages bruke fluorescerende tags at etiketten kromosomene (f.eks fluorescently-merket histone proteiner). Andre, mitotisk celler kan også bli identifisert av de dramatiske morfologiske endringene som følge av cellen avrunding.
Denne protokollen vil deretter demonstrere hvordan bruke live-celle tenkelig tilnærminger følge skjebnene til celler opplever langvarig mitotisk arrestasjon. Celler arrestert i mitose gjennomgå en av tre forskjellige skjebne. Først kan celler gjennomgå celledød under mitose. Dette fenomenet er lett visualisert ved * lys, døende celler er observert å krympe, bleb, brudd. Andre celler kan avslutte mitose og tilbake tilbake til interphase uten kromosom segregering eller cytokinesis, en prosess kalt mitotisk glidning. Decondensation av kromosomer og/eller flatere mitotisk cellen lett identifiserer denne prosessen. Celler som sett fra mitose også ofte vise uregelmessig, multi lobed kjerner og ofte havn flere mikronuklei5. Tredje kan celler arrestert i mitose starte anaphase og Fortsett gjennom mitose etter forsinkelser. Mens uvanlig på høyere narkotika konsentrasjoner, antyder dette at de arresterte cellene kan har oppfylt spindelen montering sjekkpunkt, eller at spindelen montering kontrollpunktet er delvis svekket eller defekt. Anaphase utbruddet kan visualiseres kromosom segregering og påfølgende cytokinesis med live-celle imaging.
Live-celle tenkelig metoder for å spore skjebnen til celler som unngå mitotisk celledød ved gjennomgår mitotisk glidning også beskrives. Celler som gjennomgår mitotisk glidning enten dø i den påfølgende interphase, utløse en holdbar G1 celle syklus arrestasjon eller re-gå inn i cellen syklus for å starte en ny runde med celledeling4. En tilnærming som bruker FUCCI (fluorescerende ubiquitination-baserte celle syklus indikator) systemet til å bestemme brøkdel av celler som re-Enter cellen syklus etter mitotisk glidning vil bli beskrevet. FUCCI tillater direkte visualisering av G1/S overgangen og kan brukes sammen med langsiktige live-celle imaging både i vitro og vivo26,27. FUCCI systemet utnytter to fluorescently merket proteiner, avkortet former for hCdt1 (chromatin lisensiering og utryddelse faktor 1) og hGeminin, som nivåer svinge basert på celle syklus posisjon. hCdt1 (smeltet en rød fluorescerende protein) er tilstede på høye nivåer under G1 fase hvor det fungerer for å lisensiere DNA for replikering, men er ubiquitinated av E3 ubiquitin ligase SCFSkp2 og degradert S/G2/M faser å hindre Re replikering av DNA26. Derimot hGeminin (smeltet en grønn fluorescerende protein), er en inhibitor av hCdt1 hvis nivåer topp under S/G2/m, men er ubiquitinated av E3 ubiquitin ligase APCCdh1 og degradert på slutten av mitose og hele G1 26. derfor FUCCI leverer en grei fluorescens avlesning av cellen syklus fase, som cellene viser rød fluorescens under G1, og grønn fluorescens under S/G2/M. FUCCI systemet er en betydelig fordel over andre tilnærminger (for eksempel bromodeoxyuridine farging) til å identifisere proliferativ celler, fordi det krever ikke cellen fiksering og gir enkelt celle tenkelig uten behov for ekstra farmakologiske behandlinger for å synkronisere celle populasjoner. Om ikke omtalt i denne protokollen, har ekstra live-celle sensorer også blitt utviklet for å visualisere celle syklus progresjon, inkludert en helicase B sensor G128, DNA ligase-RFP29 og PCDNA-GFP30 sensorer S-fase, og siste FUCCI-4 sensoren, som oppdager alle stadier av celle syklus31.
Til slutt, en live-celle bildebehandling metode til å gjenkjenne kjernefysiske konvolutten ruptur beskrives. Nyere studier har avdekket at kjernefysisk konvoluttene av kreftceller er ustabil og utsatt for sprekker, og dermed slik at innholdet i nucleoplasm og cytoplasma å intermix. Dette fenomenet er kalt kjernefysiske brudd, kan fremme DNA skade og stimulering av medfødte immunforsvaret32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. mens de underliggende årsakene til kjernefysiske ruptur fortsatt ufullstendig preget, det er kjent at deformasjoner kjernefysiske struktur korrelerer med økt forekomst av kjernefysiske ruptur42. En velkjent effekten av paklitaxel behandling er generasjon av påfallende unormal kjernefysiske strukturer etter mitose; slik beskrives metode ved hjelp av live-celle imaging for å kvantifisere kjernefysiske ruptur, mens også utforske paklitaxel behandling øker frekvensen av kjernefysiske ruptur hendelser. Kjernefysisk brudd kan oppdages av observerte lekkasje av et kjernefysisk målrettede fluorescerende protein i cytoplasma (f.eks en tandem dimer gjenta av RFP smeltet til et kjernefysisk lokalisering signal, TDRFP-NLS). Denne lekkasje er tydelig synlig av øyet, som muliggjør enkel kvantifisering av brudd hendelser.
Denne protokollen krever widefield epifluorescence mikroskop som er utstyrt med en kodet scenen og autofokusering programvare. Kodet scenen gir presis automatiserte bevegelsen til definerte X-og Y-koordinater, mens autofokus programvaren opprettholder celler i fokus for varigheten av tenkelig perioden. I tillegg denne protokollen krever utstyr å opprettholde fuktet cellene på 37 ° C med 5% CO2 atmosfære. Dette kan oppnås ved å sette hele mikroskopet innenfor en temperatur og atmosfære kontrollert kabinett, eller ved hjelp av scenen-top-enheter som lokalt opprettholder temperatur og miljø. Kontrast målet i denne protokollen er en plan fluor 10 x med en numerisk blenderåpning av 0,30. 20 X mål er imidlertid også nok til å identifisere både avrundet mitotisk og flat interphase celler i en enkelt fokalplanet. Hvis utfører kontrast kan imaging (som beskrevet i denne metoden), dekselet være enten glass eller plast. Hvis differensial forstyrrelser kontrast (DIC) mikroskopi brukes, er det viktig å bruke en glass cover for å hindre depolarization av lys.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>phenol red-free, DMEM:F12 media</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3027202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>50-753-3104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well glass bottomed imaging dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P12-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>TSZ Chem</td>
			<td>RS036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NC0215085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Chamber</td>
			<td>In Vivo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Z03NI7432000201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm polystyrene tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5804R 15 amp Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>97007-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 microliters Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 microliters Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette Tips</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>p1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette Tips</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Galaxy 170S</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO17011005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Boy</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>500-H117P1N4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>500-H31XYZE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Digital Camera</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>D10NLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS Elements AR Software</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MQS31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA LED Illuminator for Fluorescence</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>SOLA-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>Ti-IVS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEP59391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-C System Condenser Turret</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEL51000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEL56200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te-C LWD Ph1 Module</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEH41100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MRH10101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel

Live-celle imaging er en kraftfull teknikk som kan brukes direkte visualisere biologiske fenomener i enkeltceller over lengre tid. Det siste tiåret, har nye og innovative teknologier kraftig forbedret praktisk bruk av live-celle bildebehandling. Celler kan nå holdes i fokus og kontinuerlig avbildes over flere dager mens opprettholdes under 37 °C og 5% CO2 celle kultur forhold. Dessuten kan flere synsfelt som representerer ulike eksperimentelle forhold skaffes samtidig gir høy gjennomstrømming eksperimentelle data. Live-celle imaging gir en betydelig fordel over fast-celle bildebehandling ved at for direkte visualisering og tidsmessige kvantifisering av dynamiske mobilnettet hendelser. Live-celle bildebehandling kan også identifisere variasjon i virkemåten for enkeltceller som ville ellers mangler ved hjelp av befolkningen-baserte analyser. Her beskriver vi live-celle tenkelig protokoller for å vurdere celle skjebne beslutninger etter behandling med anti-mitotisk stoffet paklitaxel. Vi viser metoder å visualisere om mitotically arrestert celler dør direkte fra mitose eller gli tilbake i interphase. Vi beskriver også hvordan fluorescerende ubiquitination-baserte celle syklus indikator (FUCCI) systemet kan brukes til å vurdere brøkdel av interphase celler født fra mitotisk glidning som er i stand til å skrive inn celle syklus. Til slutt, beskriver vi en live-celle bildebehandling metode for å identifisere kjernefysiske konvolutten ruptur hendelser.

Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, ble RPE-1 celler uttrykke H2B-GFP behandlet med en anti-mitotisk eller kjøretøy kontroll (DMSO) og analysert av live-celle tenkelig. Analysen avdekket at 100% av kontroll mitotisk RPE-1 celler initiert anaphase gjennomsnittlig 22 min etter inn mitose (figur 1A, 1 D). I motsetning utstilt RPE-1-cellene behandles med paklitaxel en dyp mitotisk arrestasjonen varer flere timer (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel at JoVE.com

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-celle imaging gir et vell av informasjon på enkeltceller eller hele befolkninger som er uoppnåelig av fast celle imaging alene. Her beskrives live-celle tenkelig protokoller for å vurdere celle skjebne beslutninger etter behandling med anti-mitotisk stoffet paklitaxel.

Langsiktig Live-celle Imaging for å vurdere celle skjebne som svar på paklitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Langsiktig høy oppløsning intraMikros i Lung med et vakuum Stabilisert Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantasjon av Zebrafish Pediatric Brain Tumors til Immun-kompetente verter for langvarig studie av Tumor Cell Behavior og Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live celle avbildning av den TGF-β/Smad3 signalnettverk Pathway In Vitro og i Vivo bruker en Adenovirus Reporter System

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Etablere linjer Overexpressing DR3 å vurdere apoptotisk svaret anti-mitotisk Therapeutics

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Langsgående Intravital Imaging av Brain tumor Cell atferd som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Multiparametrisk tumor organoid narkotika screening ved hjelp av Widefield Live-Cell Imaging for bulk og single-organoid analyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimalisering av ytelsesparametere for TAGGG-telomerlengdeanalysen

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Ovarian Cancer Organoid Passaging and Cryopreservation for Long-Term Organoid Cultivation

Eggstokkreft Organoid Passaging og kryopreservering for langsiktig organoid dyrking