Name: long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel
Uploaded: 2018-05-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel at JoVE.com

AFB, МАВ и NJG хотели бы поблагодарить Райан Quinton для комментариев на рукописи и Адриан Салическая для конструкции TDRFP-NLS. AFB и МАВ финансируются NIGMS биомолекулярных фармакологии обучения Грант 5T32GM008541. NJG является членом Шамин и Ашраф Даходе груди Рак научно-исследовательских лабораторий и поддерживается NIH грантов GM117150 и CA-154531, Карин Грюнебаум фонд, Смит семьи награды программа, программа ученых Searle и меланома исследований Альянс.

Этот протокол фокусируется на использование-трансформированных хромосомно стабильной сетчатки пигментированной эпителиальных (ПЭС-1) клетки линии и для визуализации клеток экспериментов. Однако этот протокол может быть адаптирована к любой адэрентных клеток линии до тех пор, пока кл...

Наиболее важным аспектом долгосрочной клеток изображений является обеспечение здоровья изображаемого ячейки. Важно, что клетки подвергаться минимальным посторонних экологических раздражители, такие нестандартные условия относительно температуры, влажности или CO2 уровней. Та?...

Анти митотическая препараты давно используется в химиотерапевтического лечения различных видов твердых опухолей и часто показывают большую эффективность1,2,3. Механически, эти препараты нарушить нормальный митотическая прогрессии и содействовать митотическая арест в быстро размножающихся клеток рака. Однако судьба клеток в ответ на арест митотическая сильно варьируется: в то время как часть клеток проходит смерти клетки непосредственно из митоза, другие выйти из митоза и вернуться к межфазное как тетраплоидные клетки (процесс называется митотическая проскальзывания)4, 5,6,,78. Эти клетки межфазной можно выполнять апоптоза, проходят постоянное клеточного цикла арест или даже повторно войти клеточного цикла4,5,6,,78,9 ,10,11. Клетки, которые уклониться от митотическая клеточной смерти, попадают в интерфазе, только для того, чтобы повторно войти клеточного цикла, после удаления наркотиков, поэтому могут способствовать появление рака клеточных популяций. Кроме того клетки, что скольжения от митоз тетраплоидные, и tetraploidy, как известно, содействовать нестабильности хромосомы, что диски опухоли рецидив12,13,14,15. Определение факторов, определяющих судьбу клеток в ответ на анти митотическая медикаментозного лечения поэтому является критически важным для оптимизации текущей терапии.
В этом протоколе мы описываем методы непосредственно наблюдать и изучать судьбу клеток, которые подвергаются длительной митотическая арест в ответ на паклитаксел анти митотическая наркотиков. Паклитаксел является установленным терапевтических в клинике и оказался весьма эффективным во многих типах опухолей, в том числе груди, яичников и легких16,,1718,19, 20. паклитаксел, который является завод алкалоид, полученный из коры Тисового дерева, стабилизирует микротрубочек и таким образом предотвращает их dynamicity21,22. Хотя увлажняющий микротрубочек динамики, паклитаксел не влияет на клеточный цикл прогрессии от1 G до G2, препарат привести к постоянной активации во время митоза шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускного пункта, препятствуя Кинетохор микротрубочек вложений (обзор в глубине здесь23,24)25. Как следствие начала анафазе предотвращается паклитаксел лечение клетки и приводит к продолжительной митотическая ареста.
Этот протокол будет сначала описаны подходы к идентификации митотическая клетки в клеток экспериментов и изображений. Митоз могут быть визуализированы в клетках адэрентных культуры ткани из-за двух биологические изменения заметны клеток. Во-первых хромосомы стать весьма конденсированных непосредственно перед ядерная оболочка пробоя. Хотя часто обнаруживаемых стандартных фазово контрастной микроскопии, конденсация хромосом могут быть более четко обнаруженные с помощью флуоресцентных Теги что лейбл хромосом (например дневно меченых гистоны). Во-вторых, митотическая клетки может быть идентифицирован драматических морфологические изменения, происходящие от клеток округления.
Этот протокол будет затем демонстрируется использование клеток изображений подходы для отслеживания судьбы клеток наблюдается длительное митотическая ареста. Арестован в митозе клетки проходят один из трех различных судьбы. Во-первых клетки могут пройти смерти клетки во время митоза. Это явление легко визуализируется на световой микроскопии, как умирающие клетки наблюдаются сжатия, пузырь, и/или разрыв. Во-вторых клетки могут выйти из митоза и вернуться обратно к межфазное без хромосома сегрегации или цитокинез, процесс называется митотическая проскальзывания. Decondensation хромосом и/или уплощение митотическая клеток легко идентифицирует этот процесс. Клетки, которые скольжения от митоз также часто отображения неправильная, дольчатая несколькими ядрами и часто гавани несколько микроядер5. В-третьих арестован в митозе клетки могут инициировать остановку анафазы и продолжите митоз после длительной задержки. Хотя редко при более высоких концентрациях наркотиков, это поведение предлагает что арестованных клетки могут удовлетворены шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускной пункт, или контрольно-пропускном пункте Ассамблея шпинделя частично ослабленные или дефектных. Анафазе начала могут быть визуализированы на хромосоме сегрегации и последующие цитокинез с использованием клеток.
Будут также описаны клеток изображений методы, чтобы отслеживать судьбу клеток, которые уклониться от митотическая клеточной смерти, претерпевает митотическая проскальзывания. Клетки, которые проходят митотическая проскальзывания умереть в последующих интерфазе, вызвать прочный арест клеточного цикла1 G или повторно ввести клеточного цикла, начать новый раунд клеточного деления4. Будет описан подход с использованием системы FUCCI (флуоресцентные на основе ubiquitination клеточного цикла индикатор) чтобы определить долю клеток, которые повторно войти клеточного цикла, после митотическая проскальзывания. FUCCI позволяет для прямого визуализации перехода/s1G и может использоваться в сочетании с долгосрочным клеток изображений как in vitro и in vivo26,27. Система FUCCI использует два дневно обозначенные белков, усеченной формы hCdt1 (лицензирование хроматина и репликацию ДНК фактор 1) и hGeminin, уровни которых колеблются на основе позиции клеточного цикла. hCdt1 (сливается с красного флуоресцирующего белка) присутствует на высоком уровне во время фазы1 G, где действует лицензировать ДНК для репликации, но убиквитинированных на E3 убиквитин лигаза SCFSkp2 и деградированных этапах S/G/m2для предотвращения Повторная репликация ДНК26. Напротив, hGeminin (сливается с Зеленый флуоресцирующий белок), является ингибитором hCdt1, вершина которого уровни во время S/G2/м, но это убиквитинированных на E3 убиквитин лигаза APCCdh1 и деградации в конце, митоз и всей G1 26. Следовательно, FUCCI обеспечивает простой флуоресценции индикация фазы клеточного цикла, как клетки экспонат красной флуоресценцией во время G1 и зеленая Флуоресценция во время S/G2/м. FUCCI система является значительным шагом вперед над другие подходы (например Бромдезоксиуридин окрашивание) для идентификации пролиферативной клетки, потому что он не требует фиксации клетки и позволяет для одной ячейки изображений без необходимости использования дополнительных фармакологической лечение для синхронизации клеточных популяций. Хотя не обсуждаются в настоящем Протоколе, дополнительные датчики клеток также были разработаны для визуализации прогрессии клеточного цикла, включая helicase B датчик G128, ДНК лигаза RFP29 и30 датчиков PCDNA-GFP S-фазе, и последние FUCCI-4-датчик, который обнаруживает всех стадиях клеточного цикла31.
Наконец будут описаны клеток изображений способ обнаружить разрыв ядерная оболочка. Недавние исследования показали, что конверты ядерных клеток рака нестабильной и склонной к разрывным, тем самым позволяя содержимое нуклеоплазмы и цитоплазме перемешивают. Это явление называется ядерного разрыва, могут способствовать повреждение ДНК и стимуляции врожденный иммунный ответ32,33,34,,3536,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. Хотя первопричины ядерной разрыв по-прежнему неполно характеризуется, как известно, что деформаций в ядерной структуре коррелирует с увеличением числа ядерных разрыв42. Один известный эффект лечения паклитаксел это поколение поразительно аномальные ядерных структур после митоз; Таким образом метод с использованием клеток изображений для количественного определения ядерного разрыва будут описаны, а также изучает, если паклитаксел лечения увеличивает частоту событий ядерного разрыва. Ядерного разрыва могут быть обнаружены наблюдаемых утечки ядерной таргетингом флуоресцентного белка в цитоплазме (например димер тандеме повторить из ППП, сливается с ядерной локализации сигнал, TDRFP-NLS). Эта утечка отчетливо видна на глаз, что позволяет простой количественный разрыв событий.
Этот протокол требует widefield эпифлуоресцентного микроскопа, который оснащен закодированные стадии и автофокусировки программного обеспечения. Закодированное этап позволяет точное автоматизированное движение для определенных координат X-Y, в то время как автофокусом программное обеспечение поддерживает клеток в центре внимания в течение периода обработки изображений. Кроме того, этот протокол требует оборудования для поддержания клеток при 37 ° C с увлажняется 5% CO2 атмосфера. Это может быть достигнуто, заключив весь Микроскоп в пределах температуры и атмосфера контролируемых корпус, или с помощью устройств этап топ, локально поддерживает температуру и окружающей среды. Цель фазово контрастной, используемые в настоящем Протоколе является план Флуор 10 x с числовой апертуры 0,30. Однако 20 X целей также являются достаточными для выявления как округлые митотическая и уплощенная межфазной клетки в одной фокальной плоскости. При фазово контрастной визуализации (как описано в этом методе), крышка может быть стекла или пластика. Если используется дифференциальной помехи микроскопия контраста (ОПК), крайне важно использовать стеклянную крышку для предотвращения деполяризации света.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>phenol red-free, DMEM:F12 media</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3027202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>50-753-3104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well glass bottomed imaging dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P12-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>TSZ Chem</td>
			<td>RS036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NC0215085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Chamber</td>
			<td>In Vivo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Z03NI7432000201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm polystyrene tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5804R 15 amp Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>97007-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 microliters Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 microliters Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette Tips</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>p1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette Tips</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Galaxy 170S</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO17011005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Boy</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>500-H117P1N4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>500-H31XYZE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Digital Camera</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>D10NLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS Elements AR Software</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MQS31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA LED Illuminator for Fluorescence</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>SOLA-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>Ti-IVS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEP59391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-C System Condenser Turret</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEL51000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEL56200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te-C LWD Ph1 Module</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEH41100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MRH10101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel

Клеток – это мощный метод, который может использоваться непосредственно визуализировать биологические явления в одиночных клетках более продолжительных периодов времени. За последнее десятилетие новые и новаторские технологии значительно расширили практичности клеток. Клетки теперь могут храниться в фокусе и непрерывно отображаемого в течение нескольких дней, пока поддерживается при 37 °C и 5% CO2 условий культуры клеток. Кроме того несколько полей зрения, представляющие различные экспериментальные условия могут быть приобретены одновременно, обеспечивая тем самым высок объём экспериментальных данных. Клеток обеспечивает значительное преимущество над-клеточной изображений, позволяя для прямой визуализации и височной количественный динамических сотовой событий. Клеток можно также определить различия в поведении одиночных камер, которые бы в противном случае были пропущены с использованием демографических анализов. Здесь мы описываем клеток изображений протоколы для оценки решения судьбы клеток после лечения с анти митотическая наркотиков паклитаксел. Мы демонстрируем, что методы, чтобы визуализировать ли mitotically арестован клетки умирают прямо из митоз или скольжения обратно в интерфазе. Мы также обсудим, как люминесцентные на основе ubiquitination клеточного цикла индикатор (FUCCI) система может использоваться для оценки доли межфазной клеток родился митотическая проскальзывания, которые способны повторного ввода клеточного цикла. Наконец мы описываем клеток изображений метод идентификации ядерная оболочка разрыв события.

Используя протокол, описанных выше, ПЭС-1 клетки, выражая H2B-ГФП были относиться с анти митотическая или транспортного средства управления (ДМСО) и анализируемой клеток. Анализ показал, что 100% контроля митотическая ПЭС-1 клеток инициировал остановку анафазы в среднем 22 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel at JoVE.com

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Клеток обеспечивает большой объем информации на отдельные ячейки или целые группы населения, которые недостижима, фиксированные ячейки изображений в одиночку. Здесь жить клеточной изображений протоколы для оценки решения судьбы клеток после лечения с анти митотическая наркотиков паклитаксел описаны.

Долгосрочный клеток изображений для оценки судьбу клеток в ответ на паклитаксел

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Долгосрочный высокого разрешения Прижизненные микроскопии в легких с помощью вакуумного стабилизированный визуализации окна

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Трансплантация опухолей головного мозга у детей в мозг в иммунокомпетентные хозяева для долгосрочного изучения поведения опухолевых клеток и лекарственного ответа

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Живой клетки изображений TGF-β/Smad3 сигнализируя Pathway In Vitro и In Vivo с помощью системы репортер аденовирус

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Assays клеток опухоли стволовых клеток глиобластомы мозга исследования миграции и вторжения

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Создание линий клеток, экспрессирующих DR3 оценить ответ Apoptotic анти митотическая терапии

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Продольная интравитальная визуализация поведения опухолевых клеток головного мозга в ответ на инвазивную хирургическую биопсию

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Многопараметрический скрининг опухолевых органоидных препаратов с использованием широкоугольной визуализации живых клеток для объемного и одноорганоидного анализа

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Оптимизация эксплуатационных параметров анализа длины теломер TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Ovarian Cancer Organoid Passaging and Cryopreservation for Long-Term Organoid Cultivation

Пассирование органоидов при раке яичников и криоконсервация для долгосрочного культивирования органоидов