Name: long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel
Uploaded: 2018-05-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel at JoVE.com

AFB, MAV och NJG vill tacka Ryan Quinton för synpunkter på manuskriptet och Adrian Salic för den TDRFP-NLS konstruktion. AFB och MAV finansieras av den NIGMS Biomolekylär farmakologi utbildning Grant 5T32GM008541. NJG är medlem av Shamim och Ashraf Dahod Breast Cancer Research Laboratories och stöds av NIH grants GM117150 och CA-154531, Karin Grunebaum Foundation, Smith familj utmärkelser programmet, till Searle Scholars-programmet och melanom forskningen Alliance.

Detta protokoll fokuserar på att använda icke-omvandlad och kromosomalt stabil retinal pigmenterade epitelceller (RPE-1) cell linjen för live-cell imaging experiment. Detta protokoll kan dock anpassas till eventuella vidhäftande cellinje så länge cellen odlingsbetingelser justeras vid behov. Alla förfaranden måste följa institutionella biosäkerhet och etiska riktlinjer och bestämmelser.
1. förbereda celler för Live-cell Imaging
<ol><li>
Använd färska tinade och tidig p...

Den mest kritiska aspekten av långsiktiga live-cell imaging är att säkerställa hälsan hos de celler som avbildas. Det är viktigt att cellerna utsättas för minimal yttre miljöfaktorer, såsom undermåliga förhållanden gällande temperatur, luftfuktighet, eller CO2 nivåer. Det är också viktigt att begränsa photodamage från fluorescerande excitation belysning, som imaging stress är kända för att påverka cell beteende50. Att begränsa photodamage kan uppnås på flera s?...

Anti mitotiska droger har länge använts i kemoterapiregimer av olika typer av solida tumörer och visar ofta bra effekt1,2,3. Slentrianmässigt, dessa läkemedel störa normala mitotiska progression och främja mitotiska gripandet i snabbt sprider sig cancerceller. Cell öde svar på mitotiska gripandet är dock mycket varierande: medan en bråkdel av celler genomgår celldöd direkt från Mitos, andra exit ur Mitos och återgå till interphase som gräsart celler (en process som kallas mitotiska slirning)4, 5,6,7,8. Dessa interphase celler kan köra apoptos, genomgå permanent cellcykelarrest eller ens åter in i cellcykeln4,5,6,7,8,9 ,10,11. Celler som undgå mitotiska celldöd genom glida ned i interphasen, bara för att återinträda på cellcykeln efter drogen borttagning, kan därför bidra till re-uppkomsten av cancer cellpopulationer. Dessutom återfall celler att glida från Mitos är gräsart, och tetraploidy är kända för att främja kromosom instabilitet som driver tumör12,13,14,15. Definiera de faktorer som styr cellen öde svar på anti mitotiska läkemedelsbehandlingar är därför avgörande att optimera aktuella therapeutics.
I detta protokoll beskriver vi metoder för att direkt observera och studera celler som genomgår långvarig mitotiska gripandet svar på anti mitotiska drog paklitaxel öde. Paklitaxel är en etablerad terapeutisk på kliniken och har visat sig vara mycket effektiv i många typer av tumörer, inklusive de av bröst, äggstockar och lungorna16,17,18,19, 20. paklitaxel, som är en växt alkaloid härrör från barken av trädet idegran, stabiliserar mikrotubuli och därmed hindrar deras dynamicity21,22. Medan dämpning av mikrotubuli dynamics av paklitaxel inte påverkar cellcykelns förlopp från G1 G2, leder drogen till ihållande aktivering av spindel montering checkpoint under Mitos av hindrar Kinetochor-mikrotubulära fastsättning (granskas på djupet här23,24)25. Följaktligen hindras Anaphasen debut i paklitaxel-behandlade celler och resulterar i en långvarig mitotiska gripandet.
Detta protokoll kommer först att beskriva metoder för att identifiera mitotiska celler i live-cell imaging experiment. Mitos kan visualiseras i vidhäftande vävnadsodling celler på grund av två märkbara cell biologiska förändringar. Först, kromosomer blir mycket kondenserat omedelbart före kärn kuvert uppdelning. Medan ofta upptäckas av standard fas-kontrast mikroskopi, kan kromosom kondens tydligare upptäckas med hjälp av fluorescerande Taggar att etiketten kromosomer (t.ex. fluorescently-märkt Histon proteiner). Andra, mitotiska celler kan också identifieras genom de dramatiska morfologiska förändringar som resulterar från cell avrundning.
Detta protokoll kommer sedan visar hur du använder live-cell bildgivande metoder för att spåra celler som upplever långvarig mitotiska gripande öden. Celler i Mitos genomgå en av tre skilda öden. Celler kan först genomgå celldöd under Mitos. Detta fenomen är lätt visualiseras genom ljusmikroskop, som döende celler observeras krympa, blåsa eller bristning. Andra celler kan avsluta från Mitos och återvända tillbaka till interphase utan kromosomsegregering eller cytokines, en process som kallas mitotiska slirning. Decondensation kromosomer eller en flackare mitotiska cellen lätt identifierar denna process. Celler som glida från Mitos visar också ofta oregelbundna, flera flikiga kärnor och ofta hyser flera mikrokärnor5. Det tredje kan celler greps i Mitos initiera Anaphasen och Fortsätt genom Mitos efter en lång fördröjning. Samtidigt ovanligt på högre läkemedelskoncentrationen, föreslår detta beteende att de arresterade cellerna kan ha nöjda spindel montering checkpoint, eller att spindel montering checkpoint är försvagad eller delvis defekt. Anaphasen debut kan visualiseras genom kromosomsegregering och efterföljande cytokines med hjälp av live-cell imaging.
Live-cell bildmedicinska metoder att spåra celler som kringgår mitotiska celldöd genom att genomgå mitotiska slirning öde kommer också att beskrivas. Celler som genomgår mitotiska slirning antingen dö i efterföljande interphasen, utlösa en slitstark G1 cellcykelarrest eller återinträda cellcykeln för att inleda en ny runda av cell division4. En metod som använder FUCCI (fluorescerande ubikvitinering-baserade cellcykeln indikator) systemet för att bestämma andelen av celler som återinträda cellcykeln efter mitotiska slirning kommer att beskrivas. FUCCI möjliggör direkt visualisering av G1/S övergången och kan användas i samband med långsiktiga live-cell imaging både in vitro- och in-vivo26,27. FUCCI systemet utnyttjar två fluorescently märkta proteiner, stympade former av hCdt1 (kromatin licensiering och DNA-replikation faktor 1) och hGeminin, vars nivåer pendlar baserat på cellcykelns position. hCdt1 (smält till en röd fluorescerande protein) är närvarande på höga nivåer under G1 fas där det agerar för att licensiera DNA för replikering, men är ubiquitineras av den E3 ubiquitin ligase SCFSkp2 och försämras under S/G2/M faser att förhindra Re replikering av DNA26. Däremot hGeminin (smält till ett grönt fluorescerande protein), är en hämmare av hCdt1 vars nivåer topp under S/G2/m, men är ubiquitineras av den E3 ubiquitin ligase APCCdh1 och försämras i slutet av Mitos och hela G1 26. Följaktligen FUCCI levererar en okomplicerad fluorescens avläsning av cellcykeln fas, som celler uppvisar röd fluorescens under G1, och grön fluorescens under S/G2/m. Systemets FUCCI är ett betydelsefullt framsteg över andra metoder (till exempel Bromdeoxiuridin färgning) att identifiera proliferativ celler, eftersom det kräver inte cell fixering och låter för enstaka cell avbildning utan behov av ytterligare farmakologiska behandlingar för att synkronisera cellpopulationer. Även om inte diskuteras i detta protokoll, har ytterligare live-cell sensorer också utvecklats för att visualisera cellcykelns förlopp, inklusive en helicase B sensor för G128, DNA-ligase Armeringsputs29 och PCDNA-GFP30 sensorer för S-fas, och nyligen FUCCI-4 sensorn, som identifierar alla faser av cellcykeln31.
Slutligen, en live-cell bildgivande metod att upptäcka kärn kuvert bristning kommer att beskrivas. Nyligen genomförda studier har visat att kärn kuverten av cancerceller är instabil och benägna att spricker, vilket innebär att innehållet i de nukleoplasman och cytoplasman att blanda. Detta fenomen kallas kärn bristning, kan främja DNA-skador och stimulering av medfödda immunsvar32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. medan de bakomliggande orsakerna till nukleära bristning förbli ofullständigt kännetecknas, det är känt att deformationer i nukleära struktur korrelerar med en ökad incidens av nukleära bristning42. En välkänd effekt av paklitaxel behandling är generation av påfallande avvikande nukleära strukturer efter Mitos; som sådan, kommer en metod där live-cell imaging för att kvantifiera nukleära bristning att beskrivas, samtidigt också undersöka om paklitaxel behandling ökar frekvensen av nukleära bristning händelser. Nukleära bristning kan upptäckas av observerade läckage av ett kärn-riktade fluorescerande protein in i cytoplasman (t.ex. en tandem dimer upprepa av RFP smält till en cellkärnelokalisering signal, TDRFP-NLS). Detta läckage är tydligt synliga för ögat, som möjliggör enkel kvantitering av bristning händelser.
Detta protokoll kräver en widefield epifluorescensmikroskop som är utrustad med en kodad scen och autofokusering programvara. Kodade scenen möjliggör exakta automatiserade rörelser till definierade X-Y-koordinater, medan autofokus programvara bibehåller celler i fokus under hela perioden imaging. Detta protokoll kräver dessutom utrustning för att upprätthålla celler vid 37 ° C med fuktad 5% CO2 atmosfär. Detta kan uppnås genom att bifoga hela mikroskopet inom en temperatur och atmosfär kontrollerade inhägnad, eller genom att använda scenen-top-enheter som lokalt upprätthåller temperatur och miljö. Faskontrast målet används i detta protokoll är en plan fluor 10 x med en numerisk bländare 0,30. 20 X mål är dock också tillräcklig för att identifiera både rundade mitotiska och tillplattad interphase celler i en enda fokalplan. Om utför faskontrast kan imaging (som beskrivs i denna metod), locket vara antingen glas eller plast. Om differential störningar kontrast (DIC) mikroskopi används, är det viktigt att använda en glaskupa för att förhindra depolarisation av ljus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>phenol red-free, DMEM:F12 media</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3027202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>50-753-3104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well glass bottomed imaging dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P12-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>TSZ Chem</td>
			<td>RS036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NC0215085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Chamber</td>
			<td>In Vivo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Z03NI7432000201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm polystyrene tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5804R 15 amp Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>97007-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 microliters Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 microliters Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette Tips</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>p1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette Tips</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Galaxy 170S</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO17011005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Boy</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>500-H117P1N4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>500-H31XYZE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Digital Camera</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>D10NLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS Elements AR Software</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MQS31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA LED Illuminator for Fluorescence</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>SOLA-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>Ti-IVS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEP59391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-C System Condenser Turret</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEL51000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEL56200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te-C LWD Ph1 Module</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEH41100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MRH10101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel

Live-cell bildbehandling är en kraftfull teknik som kan användas för att direkt visualisera biologiska fenomen i enstaka celler över längre tidsperioder. Under det senaste årtiondet, har ny och innovativ teknik förbättras avsevärt praktiskhet i live-cell imaging. Celler kan nu hållas i fokus och kontinuerligt avbildas under flera dagar medan underhållna under 37 °C och 5% CO2 cell odlingsbetingelser. Flera synfält som representerar olika experimentella förhållanden kan dessutom förvärvas samtidigt, vilket ger hög genomströmning experimentella data. Live-cell imaging ger en betydande fördel över fast-cell imaging genom att tillåta för direkt visualisering och temporal kvantitering av dynamiska cellulära händelser. Live-cell imaging kan också identifiera variation i beteende av enstaka celler som skulle annars ha missats använder populationsbaserade analyser. Här beskriver vi live-cell imaging protokoll för att bedöma cell öde beslut efter behandling med anti mitotiska drog paklitaxel. Vi demonstrera metoder för att visualisera om mitotiskt arresterade celler dör direkt från Mitos eller glida tillbaka in i interphasen. Vi beskriver också hur det fluorescerande ubikvitinering-baserade cellcykeln-indikatorsystemet (FUCCI) kan användas för att bedöma andelen interphase celler född från mitotiska slirning som klarar av att återinträda på cellcykeln. Slutligen beskriver vi en live-cell bildgivande metod för att identifiera kärn kuvert bristning händelser.

Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan, RPE-1-celler som uttrycker H2B-GFP behandlades med en anti mitotiska eller fordon kontroll (DMSO) och analyseras av live-cell imaging. Analysen visade att 100% av kontroll mitotiska RPE-1 celler inlett Anaphasen genomsnitt 22 min efter inresan Mitos (figur 1A, 1 D). RPE-1 celler behandlas med paklitaxel uppvisade däremot en djupgående mitotiska arresteringsorder som varar flera timmar (<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel at JoVE.com

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging ger mängder av information på enstaka celler eller hela befolkningar som är ouppnåelig genom fasta cell imaging ensam. Här beskrivs live-cell imaging protokoll att bedöma cell öde beslut efter behandling med anti mitotiska drog paklitaxel.

Långsiktiga Live-cell Imaging att bedöma Cell öde i svar till paklitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Långsiktig Högupplösta Intravital Mikroskopi i lungan med en vakuum Stabiliserad Imaging Fönster

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation av sebrafiskpediatriska hjärntumörer till immunkompetenta värdar för långvarig studie av tumörcellsbeteende och drogrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Levande cellen avbildning av TGF-β/Smad3 signalering utbildningsavsnitt i In Vitro och In Vivo använder ett Adenovirus Reporter System

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Att upprätta cellinjer överuttryck DR3 för att bedöma den apoptotiska svar på anti mitotiska Therapeutics

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinell Intravital avbildning av hjärntumör cell beteende som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Multiparametrisk tumörorganoid läkemedelsscreening med hjälp av Widefield Live-Cell Imaging för bulk- och enorganoidanalys

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimering av prestandaparametrar för TAGGG-telomerlängdanalysen

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Ovarian Cancer Organoid Passaging and Cryopreservation for Long-Term Organoid Cultivation

Organoidpassage och kryokonservering av äggstockscancer för långsiktig organoidodling