Name: testing the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance
Uploaded: 2018-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Instituto de Salud Carlos III (Plan Estatal de ich + D + ich 2013-2016): gewährt CP15-00012, PI16-00860 und CIBER (CB06/02/0053), kofinanziert durch den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung '' einen Weg, um Europa zu erreichen"(EFRE). JAE wird unterstützt durch das Atracción de Talento -Programm der Regierung der Region Madrid (2016-T1/BIO-1105) und die I + D Shmeissani von das spanische Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM wird unterstützt durch ein Miguel Servet Stipendium vom Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) kofinanziert durch den Europäischen Sozialfonds "Investition in Ihre Zukunft" (ESF) und EFRE.

1. Aufbau des experimentellen Systems Codierung Antibiotikaresistenz-gen
Hinweis: Hier E. Coli MG1655 diente als der Empfänger Belastung der Antibiotikaresistenz-gen Plasmid oder Chromosom kodiert. Antibiotikaresistenz-gen ist das Chromosom oder ein multicopy Plasmid in eine ansonsten isogene Sorte (Abbildung 1) kodiert.
<ol><li>
Einfügen von Antibiotikaresistenz-gen in der λ Phage Integration Website (AttB)20...

<ol>
	<li>Neill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TACKLING+DRUG-RESISTANT+INFECTIONS+GLOBALLY:+FINAL+REPORT+AND+RECOMMENDATIONS.">TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS.</a> Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).</li><li>Palmer, A. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding,+predicting+and+manipulating+the+genotypic+evolution+of+antibiotic+resistance.">Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance.</a> Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).</li><li>MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+population+genetics+of+antibiotic+resistance:+integrating+molecular+mechanisms+and+treatment+contexts.">The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts.</a> Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).</li><li>Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Beagle+in+a+bottle.">The Beagle in a bottle.</a> Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).</li><li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+dynamics+during+experimental+evolution.">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).</li><li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+experiments+with+microorganisms:+The+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation.">Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).</li><li>Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Experimental+Evolution+in+Escherichia+coli.+I.+Adaptation+and+Divergence+During+2,000+Generations.">Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations.</a> The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).</li><li>Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+in+response+to+high-temperature+selection.">Rapid evolution in response to high-temperature selection.</a> Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).</li><li>Bell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+rescue+and+the+limits+of+adaptation.">Evolutionary rescue and the limits of adaptation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).</li><li>Bell, G., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+and+Evolutionary+Rescue+in+Metapopulations+Experiencing+Environmental+Deterioration.">Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration.</a> Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).</li><li>Bell, G., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+rescue+can+prevent+extinction+following+environmental+change.">Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change.</a> Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).</li><li>San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicopy+plasmids+potentiate+the+evolution+of+antibiotic+resistance+in+bacteria.">Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1, 0010 (2016).</li><li>Alekshun, M. N., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+antibacterial+multidrug+resistance.">Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance.</a> Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).</li><li>Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+gene+transfer+and+the+nature+of+bacterial+innovation.">Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation.</a> Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).</li><li>Carattoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+and+the+spread+of+resistance.">Plasmids and the spread of resistance.</a> Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).</li><li>Smillie, C., Garcill&#225;n-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+plasmids.">Mobility of plasmids.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).</li><li>San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+epistasis+between+co-infecting+plasmids+promotes+plasmid+survival+in+bacterial+populations.">Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations.</a> ISME J. , (2013).</li><li>Stoesser, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+History+of+the+Global+Emergence+of+the+Escherichia+coli+Epidemic+Clone+ST131.">Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131.</a> MBio. 7 (2), (2016).</li><li>San Millan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiresistance+in+Pasteurella+multocida+is+mediated+by+coexistence+of+small+plasmids.">Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids.</a> Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).</li><li>Escudero, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+the+ancestral+activity+of+integron+integrases+reveals+a+smooth+evolutionary+transition+during+functional+innovation.">Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation.</a> Nat Commun. 7, 10937 (2016).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+efficient+gene+replacement+in+the+filamentous+fungus+Aspergillus+nidulans.">A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans.</a> Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).</li><li>Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+Vibrio+splendidus+mutant+lacking+the+metalloprotease+gene+vsm+by+use+of+a+novel+counterselectable+suicide+vector.">Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , (2009).</li><li>Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+rescue+from+extinction+is+contingent+on+a+lower+rate+of+environmental+change.">Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change.</a> Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).</li><li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq.">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li><li>Barrick, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+structural+variation+in+haploid+microbial+genomes+from+short-read+resequencing+data+using+breseq.">Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq.</a> BMC Genomics. 15, 1039 (2014).</li><li>Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+evolution+of+TEM-1+&#946;-lactamase:+experimental+reconstruction+and+clinical+relevance.">Natural evolution of TEM-1 &#946;-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance.</a> FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).</li><li>Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycoside+modifying+enzymes.">Aminoglycoside modifying enzymes.</a> Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).</li><li>Jerison, E. R., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+investigations+of+evolutionary+dynamics+and+epistasis+in+microbial+evolution+experiments.">Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 35, 33-39 (2015).</li><li>Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Basis+of+Evolutionary+Innovation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).</li></ol>

Wir präsentieren ein neues Protokoll, die Kombination von Molekulare Biologie, experimentelle Evolution und tiefen DNA-Sequenzierung, die entworfen, um die Rolle des multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen bei Bakterien zu untersuchen. Obwohl dieses Protokoll Techniken aus verschiedenen Bereichen verbindet, alle Methoden zu entwickeln sind einfach und in einem regelmäßigen Mikrobiologie-Labor durchgeführt werden können. Die wichtigsten Schritte im Protokoll sind wahrscheinlich den Bau von M...

Antibiotika-Resistenz bei Bakterien ist ein großes gesundheitliches Problem1. Auf einer grundlegenden Ebene ist die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen bei pathogenen Bakterien ein einfaches Beispiel der Evolution durch natürliche Selektion2,3. Einfach ausgedrückt, generiert die Anwendung von Antibiotika Auswahl für resistente Stämme. Ein zentrales Problem in der Evolutionsbiologie, deshalb, um die Faktoren zu verstehen, die Einfluss auf die Fähigkeit der Bakterienpopulationen zu Resistenzen gegen Antibiotika entwickeln. Auswahl Experimente entstanden als ein sehr mächtiges Werkzeug um die Evolutionsbiologie von Bakterien zu untersuchen hat, und dieses Feld unglaubliche Einblicke in eine Vielzahl von evolutionären Probleme4,5,6. In experimentelle Evolution sind seriell Bakterienpopulationen initiiert von einem einzigen elterlichen Belastung unter definierten und streng kontrollierten Bedingungen passagiert. Einige Mutationen, die während des Wachstums dieser Kulturen auftreten bakterieller Fitness steigern und diese zu verbreiten durch die Kulturen durch natürliche Selektion. Während des Experiments sind Proben der Bevölkerungen in regelmäßigen Abständen tiefkalt beibehalten, um nicht weiterentwickelnden gefrorenen fossilen aufzuzeichnen. Eine Vielzahl von Ansätzen lässt sich entwickelnden Bakterienpopulationen zu charakterisieren, aber die zwei am häufigsten verwendeten Methoden sind Fitness-Assays, die messen die Fähigkeit der weiterentwickelten Bakterien konkurrieren gegen ihre Vorfahren und kompletten Genoms, das ist verwendet, um den genetischen Veränderungen, dass Laufwerk Anpassung identifizieren. Nach Pionierarbeit von Richard Lenski und Kollegen7,8, der Standardansatz in experimentelle Evolution wurde gegen eine relativ kleine Anzahl von replizieren Bevölkerungen (in der Regel < 10) mit der Anpassung an eine neue umweltpolitische Herausforderung, wie neue Kohlenstoffquellen, Temperatur oder eine räuberische Phagen.
Infektionen durch Antibiotika-resistente Bakterien werden ein großes Problem, wenn Widerstand hoch genug ist, dass es nicht möglich, Antibiotika-Konzentrationen zu tödlichen Niveaus in Patienten Gewebe zu erhöhen. Ärzte sind daher interessiert was ermöglicht Bakterien Resistenz gegen hohe Dosen von Antibiotika zu entwickeln, die über diese Antibiotika Grenzkonzentration, der klinischen Haltepunkt liegen. Wie um dies experimentell zu studieren? Wenn eine kleine Anzahl von Bakterienpopulationen mit einer hohen Dosis des Antibiotikums herausgefordert werden, wie in einem Lenski-Stil Experiment, dann das wahrscheinlichste Ergebnis ist, dass das Antibiotikum alle Bevölkerungen zum Aussterben führen wird. Zur gleichen Zeit wenn die Dosis des Antibiotikums, die verwendet wird niedrig, unterhalb der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) des elterlichen Stammes ist ist dann es unwahrscheinlich, dass sich die Bakterienpopulationen klinisch relevante Ebenen des Widerstandes, vor allem, wenn Widerstand trägt eine große Kosten. Ein Kompromiss zwischen diesen beiden Szenarien ist eine "evolutionäre Rettung" Experiment9,10,11zu verwenden. Dieser Ansatz bietet eine sehr große Anzahl von Kulturen (in der Regel > 40) ist mit Dosen von Antibiotika, die im Laufe der Zeit in der Regel erhöhen durch eine Verdoppelung der Antibiotika Konzentration jeden Tag12gefordert. Das Markenzeichen dieses Experiments ist, dass eine Bevölkerung, die nicht erhöhten Resistenz entwickelt zum Aussterben getrieben wird. Die meisten Populationen, die auf diese Weise in Frage gestellt werden werden ausgestorben getrieben, aber eine kleine Minderheit bleibt bestehen, durch die sich verändernden hohes Maß an Widerstand. In diesem Beitrag zeigen wir Verwendung von dieser Versuchsanordnung multicopy Plasmid Beitrag zur Evolution des Widerstands zu untersuchen.
Bakterien resistent gegen Antibiotika durch zwei Hauptrouten, chromosomalen Mutationen und Akquisition von mobile genetische Elemente, vor allem Plasmide13. Plasmide spielen eine Schlüsselrolle in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen, weil sie sich Resistenzgene zwischen Bakterien durch Konjugation14,15übertragen können. Plasmide können in zwei Gruppen entsprechend ihrer Größe und Biologie unterteilt werden: "klein", mit hohen Kopienzahl pro Bakterienzelle und "large", mit niedrigen kopieren Nummer16,17. Die Rolle der großen Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen ist ausführlich dokumentiert worden, weil sie konjugative Plasmide enthalten die wichtigsten Triebkräfte für die Verbreitung der Resistenz und Multi-Resistenz Bakterien15sind. Kleinen multicopy Plasmide sind ebenfalls sehr häufig in Bakterien17,18, und sie oft code für Antibiotika-Resistenz-Gene-19. Allerdings ist die Rolle des kleinen multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen in geringerem Umfang untersucht worden.
In einer neueren Arbeit haben wir vorgeschlagen, multicopy Plasmide die Entwicklung der Gene tragen sie durch die Erhöhung gen Mutationsraten aufgrund der höheren gen Kopienzahl pro Zelle12beschleunigen könnte. Mit einem experimentellen Modell mit E. Coli -Stamm MG1655 und β-Lactamase-gen BlaTEM-1 zeigte sich, dass multicopy Plasmide beschleunigt die Rate des Auftretens von TEM-1 Mutationen verleihen Resistenz gegen die dritte generation Cephalosporin Ceftazidim. Diese Ergebnisse zeigten, dass multicopy Plasmide eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen spielen könnte.
Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung der Methode wir entwickelt haben, um die multicopy Plasmid-vermittelten Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen zu untersuchen. Diese Methode hat drei Stufen: Erstens Einfügen des Gens untersuchten in einem multicopy Plasmid oder das Chromosom des Bakteriums Host. Zweitens der experimentelle Evolution (evolutionäre Rettung) verwenden Sie, um das Potenzial der verschiedenen Stämme zur Anpassung an den Selektionsdruck zu beurteilen. Und drittens, Bestimmung der molekularen Grundlagen Plasmid-vermittelten Evolution mit der DNA Sequenzierung und die Rekonstruktion der vermuteten Mutationen einzeln in das elterliche Erbgut zugrunde.
Schließlich, obwohl das hier beschriebene Protokoll entwickelt wurde, um die Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen zu untersuchen, kann man argumentieren, dass diese Methode in der Regel sinnvoll, die Entwicklung von Innovationen, die durch Mutationen in jedem Multicopy erworben zu analysieren sein könnte Plasmid-kodierte gen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:167px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">C1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electroporator</td>
			<td style="width:167px;">BiorRad</td>
			<td style="width:119px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z706078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td>Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:167px;">Memmert</td>
			<td style="width:119px;">UF1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator (shaker)</td>
			<td style="width:167px;">Cole-Parmer Ltd</td>
			<td style="width:119px;">SI500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electrophoresis power supply</td>
			<td style="width:167px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1645070</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electrophoresis chamber</td>
			<td style="width:167px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1704405</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pippettes</td>
			<td style="width:167px;">Biohit</td>
			<td style="width:119px;">725020, 725050, 725060, 725070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Multi-channel pippetes</td>
			<td style="width:167px;">Biohit</td>
			<td style="width:119px;">728220, 728230, 
			728240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plate reader Synergy HTX</td>
			<td style="width:167px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">BTS1LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inoculating loops</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I8388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well plates</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB</td>
			<td style="width:167px;">BD Difco</td>
			<td style="width:119px;">DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB agar</td>
			<td style="width:167px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion Polymerase</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F533S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Gibson Assembly</td>
			<td style="width:167px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Resctriction enzymes</td>
			<td style="width:167px;">Fermentas FastDigest</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:167px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td>Plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:167px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1120</td>
			<td>gDNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td style="width:167px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">69506</td>
			<td>gDNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z706078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryotubes</td>
			<td style="width:167px;">ClearLine</td>
			<td style="width:119px;">390701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well plates (-80&#186;C storage)</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">249945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td style="width:167px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2670</td>
			<td>Quantification of DNA concentartion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1613100</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50x TAE buffer</td>
			<td style="width:167px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610743</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EK0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EL0014</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance

Multicopy Plasmide sind sehr reichlich in Prokaryoten, aber ihre Rolle in der bakteriellen Evolution bleibt schlecht verstanden. Vor kurzem zeigten wir, dass der Anstieg gen Kopienzahl pro Zelle von multicopy Plasmide zur Verfügung gestellt die Entwicklung der Plasmid-kodierte Gene beschleunigen könnte. In dieser Arbeit präsentieren wir ein experimentelles System um zu testen, die Fähigkeit des multicopy Plasmide gen Entwicklung zu fördern. Mit einfachen molekularbiologische Methoden, errichteten wir ein Modellsystem, wo eine Antibiotika-Resistenz-Gen in Escherichia coli MG1655, in das Chromosom oder auf ein multicopy Plasmid eingefügt werden können. Wir verwenden einen experimentelle Evolution Ansatz, um die verschiedenen Stämme unter steigenden Konzentrationen von Antibiotika zu propagieren und Überleben der Bakterienpopulationen im Laufe der Zeit messen. Die Wahl der Antibiotika Molekül und die Resistenz-Gen ist, dass das Gen nur Widerstand durch den Erwerb von Mutationen verleihen kann. Dieser "evolutionären Rettung" Ansatz bietet eine einfache Methode um zu testen, das Potenzial des multicopy Plasmide, die Übernahme von Antibiotika-Resistenzen zu fördern. Im nächsten Schritt des experimentellen Systems zeichnen sich die molekularen Grundlagen der Antibiotika-Resistenz. Um Mutationen zu identifizieren verantwortlich für den Erwerb von Antibiotika-Resistenzen verwenden wir Tiefe DNA-Sequenzierung von Proben aus ganzer Bevölkerungen und Klone. Schließlich, um die Rolle der Mutationen im Gen unter Studie zu bestätigen, wir im elterlichen Hintergrund zu rekonstruieren und Widerstand Phänotyp der daraus resultierenden Belastungen zu testen.

In unserer bisherigen Arbeit wurde die Entwicklung der β-Lactamase-gen BlaTEM-1 in Richtung verleiht Resistenz gegen die dritte Generation Cephalosporin Ceftazidim12 untersucht. Dieses Gen wurde ausgewählt, weil obwohl TEM-1 keine Resistenz gegenüber Ceftazidim verleihen, Mutationen im BlaTEM-1 Aktivität von TEM-1, Cephalosporine wie Ceftazidim29hydrolyseneigung erweitern können. Mutationen im Ant...

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Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Hier präsentieren wir eine experimentelle Methode, um die Rolle des multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen zu testen.

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

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SCIENTISTS IN ACTION

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

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Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Verfahren für Adaptive Labor Entwicklung von Mikroorganismen Mit einem Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Verwendung von Sniper-Cas9, Off-Target Auswirkungen von CRISPR-Cas9 ohne den Verlust der Zielaktivität durch gerichtete Evolution

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halbleitersequenzierung für Präimplantationsgenetische Tests für Aneuploidie

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Untersuchung der Transkriptionsrolle eines RUNX1 Intronic Schalldämpfers durch CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in akuten myeloischen Leukämiezellen

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Quantifizierung der Plasmid-vermittelten Antibiotikaresistenz in einem experimentellen Evolutionsansatz

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...