Name: double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects at JoVE.com

Forfatterne parlamentsarbejdet Donald Weber og Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) for at give BMSB og HB for eksperimenter og vedligeholde kolonier; og Maria T. Gonzalez Salvador P. Lopez (USDA, ARS, og Fort Pierce, FL), og Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) for kolonien vedligeholdelse, forberedelse af prøver og analyser.

1. BMSB opdræt
<ol><li>Bageste BMSB insekter som standard lab praksis og tidligere beskrevne63.</li>
	<li>Hæve ACP (D. citri) insekter på Citrus macrophylla i et drivhus (22 ° C) og naturligt lys. Brug adult AVS, på ca. 5-7 dage post eclosion.</li>
</ol>2. udvælgelse af genet regioner og In Vitro syntese af dsRNA
<ol><li>Vælg gener bestemt til BMSB fra tidligere udgivne transkriptom profiler32.</li>
	<li>Sikre re...

RNAi har vist sig for at være et vigtigt redskab til at udforske gen biologiske funktion og regulering, med stort potentiale til at blive udnyttet til styring af skadedyr19,68,69,70, 71. design og valget af en passende molekylærgenetisk for genhæmning i en given insektarter og metode til levering af den tilsvarende dsRNA(s) til insekt er begge af allerstø...

Hemipteran insekter omfatter nogle af de mest økonomisk betydningsfulde skadedyr af agriculturebecause af deres evne til nå forhøjede befolkningstilvækst og sprede sygdomme i planter. BMSB, H. halys Stål, er en invasiv skadedyr, der indførtes ved et uheld i den vestlige halvkugle i Allentown, Pennsylvania fra Asien (Kina, Taiwan, Korea og Japan) med den første observation rapporteret i 19961. Siden introduktionen, BMSB er blevet opdaget i 43 stater, med de højeste populationer i Midtatlanten (DE, MD, PA, NJ, VA, og WV) samt i Canada og Europa, og repræsenterer en potentiel trussel mod landbrug2. Som en polyphagous pest, kan BMSB tilskynde til skader på ca. 300 identificerede plante værter herunder høj værdi afgrøder såsom æbler, druer, prydplanter, frøafgrøder, sojabønner og majs. Skader skyldes primært skyldes tilstanden af fodring, kendt som lacerate og flush, hvor dyret gennemborer vært afgrøde med sit nål-lignende stylet til at få adgang til næringsstofferne fra kardiovaskulære væv2,3. BMSB er også en indendørs skadedyr, som de kan finde residence i levende områder såsom skoler og huse i løbet af efteråret-vinter2. Kemikalier og aeroallergens udgivet af BMSB blev rapporteret til ulovlig allergisk reaktion i frugt afgrøde arbejdstagere. BMSB kan også bidrage til allergisk sygdom fører til kontakteksem, konjunktivitis og rhinitis i følsomme individer4,5. En anden hemipteran insekt, ACP, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), er et alvorligt skadedyr af citrusfrugter og transmitterer phloem-limited bakterier (blev Liberibacter asiaticus) forårsager Huanglongbing (HLB), bedre kendt som citrus grønnere sygdom6,7. HLB blev først rapporteret fra det sydlige Kina og har spredt sig til 40 forskellige asiatiske, Afrika, Oceanien, syd- og nordamerikanske lande7. Citrus grønnere er et verdensomspændende problem med truende økonomiske og finansielle tab som følge af citrusfrugter tab; forvaltningen af AVS-anses derfor, af allerstørste betydning for forebyggelse og bekæmpelse af HLB.
Foranstaltninger til effektiv bekæmpelse af disse skadedyr normalt kræver anvendelse af kemiske pesticider, der er relativt korte levede. Kemiske insekticid kontrolstrategier ofte mangler sikkert miljøforvaltning strategier eller faldet modtagelighed af pesticid modstand i pest populationer8,9. Derfor, biologisk bekæmpelse af skadedyr med molekylær biopesticider er en potentiel alternativ, men dets brug forbliver globalt beskedent, og forskellige arter af parasitoider (f.eks. Trisolcus japonicus) kan også være effektive som naturlige biologiske kontrol. RNAi er en potentiel emerging teknologi til styring af invasive skadedyr med molekylær biopesticider10. RNAi er en godt beskrevet gen reguleringsmekanisme, der letter effektiv posttranskriptionelle genhæmning af endogene samt invaderer dsRNAs i en sekvens-specifikke måde, der i sidste ende fører til regulering af genekspression på mRNA niveau11,12. Kort, når eksogene dsRNA er internaliseret i en celle, det er forarbejdet til siRNAs af et medlem af bidentate nukleasen RNase III superfamilien, kaldet Dicer, som er evolutionært bevaret i worms, fluer, planter, svampe og pattedyr13, 14 , 15. disse 21-25 nukleotid siRNA dobbelthuse er derefter afvikles og integreret i RNA-induceret silencing complex (RISC) som guide RNA'er. Dette RISC-RNA kompleks tillader Watson-Crick base parring til den supplerende målrette mRNA; Dette fører i sidste ende til spaltning af Argonaute proteinet, en multi-domæne protein som indeholder et RNase H-lignende domæne, som nedbryder den tilsvarende mRNA og reducerer protein oversættelse, hvilket førte til posttranskriptionelle genhæmning16 , 17 , 18.
RNAi for Plantebeskyttelse og skadedyr kræver indførelse af dsRNA i vivo til tavshed gen af interesse, hvorved aktivering siRNA pathway. Forskellige metoder, der har været brugt i dsRNA levering til insekter og insekt celler til at fremkalde systemisk RNAi omfatter fodring10,19, iblødsætning20,21, mikroinjektion22, luftfartsselskaber som Liposomer 23, og andre teknikker24. RNAi blev først demonstreret i Caenorhabditis elegans til tavshed unc-22 genekspression af brand og Mello25, efterfulgt af knockdown i udtryk for de frizzled gener i Drosophila melanogaster26. Indledende funktionelle studier udnyttet mikroinjektion for at levere dsRNA i insekter, som Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, H. halys30, og Lepidoptera insekter (gennemgået af Terenius et al. 31). mikroinjektion er fordelagtigt at levere en nøjagtig og præcis dosis til webstedet af interesse i insektet. Omend sådanne septisk punkteringer kan fremkalde udtryk for immun relaterede gener på grund af traumer32, derfor udelukke dets praktiske i landbruget biopesticider udvikling.
En anden metode i levere dsRNA i vivo er ved opblødning, som indebærer indtagelse eller absorption af dsRNA ved inddragelse af dyr eller celler generelt i ekstracellulær medium indeholdende dsRNA. Iblødsætning har været anvendt til effektivt fremkalde RNAi i Drosophila S2 vævskultur celler til at hæmme Downstream-af-Raf1 (DSOR1) mitogen-aktiveret protein kinase kinase (MAPKK)20samt i C. elegans til tavshed i pos-1 gen33. Men dsRNA leveres ved hjælp af iblødsætning er mindre effektiv til at fremkalde RNAi sammenlignet med mikroinjektion20. RNAi medieret tavshed i en chewing insekt blev første gang vist i vestlige majs-rodorm (VIF) (Diabrotica virgifera virgifera) ved infusion af dsRNA i en kunstig agar kost10. Tidligere rapporter har opsummeret metoder til at levere dsRNA infunderes i naturlig kost specifikke for leddyr34. Disse leveringsmetoder blev yderligere fast besluttet på at være forholdsvis effektiv til kunstige midler til levering; som sagen om tsetsefluen (Glossina morsitans morsitans), hvor lig knockdown af en immun-relaterede gen blev observeret, da dsRNA blev leveret enten gennem blod måltid eller microinjected35. Ligeledes levering af dsRNA gennem dråberne i lys brun æble moth (Epiphyas postvittana)36, diamondback moth (Plutella xylostella) larver37, såvel som honning bier38,39 induceret effektiv RNAi. Mest effektive RNAi eksperimenter i hemipteran har udnyttet injektion af dsRNA40 , fordi oral levering af dsRNA i hemipteran insekter er vanskelig, da det skal være leveret gennem anlægget vært kardiovaskulære væv. Effektiv RNAi blev også observeret i AVS-landene og glasagtig-vinget skarpskytte leafhopper (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA blev leveret gennem citrus og vinstokke, der havde absorberet dsRNA i kardiovaskulære væv gennem rod gennembløde, bladgødning sprøjtemidler, trunk injektioner eller absorption af stiklinger41,42,43,44,45,46. Dette resulterede også i det første patent for dsRNA mod AVS-landene (2016, os 20170211082 A1). Levering af siRNA og dsRNA ved hjælp af luftfartsselskaber som nanopartikler og Liposomer bibringer stabilitet, og stigninger i leverede dsRNA effektivitet er hurtigt på vej23,47,48,49 ,50. En ny klasse af nanopartikler-baserede levering køretøjer til nukleinsyrer for in vitro- og i vivo der blev opsummeret specielt til terapeutiske applikationer kan give enorme potentiale som egnet levering vektorer51. Nanopartikler som fremføringsmiddel for dsRNA kan have ulemper herunder opløselighed, hydrophobicity eller begrænset bioakkumulering52, men en egnet polymer medvirken levering kan opveje disse ulemper. Udvikling og anvendelse af selvstændige levere nukleotider også nye kaldet 'antisense oligonukleotider', som er enkelt strandede RNA/DNA dobbelthuse46.
Vitellogenesen i leddyr er en nøglen proces kontrol reproduktion og reguleret af juvenile hormon (JH) eller ecdysone, som er de vigtigste induktorer af Vg syntese af kropsfedt; Vg tages i sidste ende op af den udvikle oocyt via Vg receptor medieret endocytose53. VG er en gruppe af polypeptider syntetiseret extraovarially, som er afgørende for udviklingen af store æg æggeblomme protein, vitellin54,55, og derfor er det vigtigt i reproduktion og aldring56. VG har været succesfuldt tavshed i nematoder57 samt i honningbi (Apis mellifera) hvor RNAi medieret nedbrydning af Vg blev observeret i voksne og æg22. RNAi medieret posttranskriptionelle genhæmning af Vg blev testet, fordi man troede dens udtynding ville føre til en observerbar fænotypiske effekt som nedsat fertilitet og frugtbarhed, potentielt støtte i BMSB kontrol. JHAMT genet, der koder til S-adenosyl-L-methionin (SAM)-afhængige JH syre O-methyltransferase, katalyserer det sidste trin af JH biosyntese pathway58. I denne vej farnesyl omdannes pyrofosfat (FPP) sekventielt fra farnesol, at farnesoic syre efterfulgt af konvertering af methyl farnesoate til JH af JHAMT. Denne vej er bevaret i insekter og leddyr specielt til forvandling, en proces, der reguleres udviklingshæmmede af hormoner59,60,61. I B. morityder JHAMT genekspression og JH biosyntetiske aktivitet i Corpora allata på, at det transkriptionel undertrykkelse af JHAMT -genet er afgørende for opsigelse af JH biosyntesen58. Derfor, JHAMT og Vg generne blev udvalgt til målrettede nedbrydningen ved hjælp af RNAi. RNAi blev også testet i citrus træer for kontrol af AVS- og GWSS. Citrus træer blev behandlet med dsRNA gennem rod gennembløde, dæmme op for hanen (trunk injektioner), samt blade spray med dsRNAs mod insekt specifikke arginin kinase (AK) udskrifter42,44. Den topikal applikation af dsRNA blev registreret over baldakinen af citrus træer, der angiver effektiv levering gennem planter kardiovaskulære væv, og resulterede i øget dødelighed i AVS-landene og GWSS41,42, 45.
I den aktuelle undersøgelse, har vi identificeret en naturlig kost leveringsmetode for behandlinger som dsRNA. Dette nyudviklede teknik blev senere brugt til silencing JHAMT og Vg mRNA ved hjælp af genet specifikke dsRNAs i BMSB nymfer som vist tidligere62. Disse nye levering protokoller demonstreret her erstatter konventionelle RNA leveringssystemer, der bruger aktuelt sprays eller microinjections. Grøntsager og frugter, stilken tap, jord drenching og ler absorptionsmidler i kan bruges til levering af dsRNA, som er afgørende for den fortsatte udvikling af biopesticide pest og patogen ledelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BMSB (H. halys) insects&#160;</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACP (D. citri) insects&#160;</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">organic green beans</td>
			<td style="width:176px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citrus plants</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hypochlorite solution</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">green food coloring&#160;</td>
			<td>McCormick &#38; Co., Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Forma chambers&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magenta vessel (Culture)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers&#160;</td>
			<td style="width:176px;">IDT DNA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SensiMix SYBR</td>
			<td style="width:176px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">qPCR ABI 7500</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spray bottle</td>
			<td style="width:176px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td>American Can Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TaKaRa Ex Taq</td>
			<td style="width:176px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick</td>
			<td style="width:176px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects

Phloem og plante sap fodring insekter invadere integriteten af afgrøder og frugter til at hente næringsstoffer, i at beskadige fødevareafgrøder. Hemipteran insekter tegner sig for en antallet af økonomisk betydelig skadegørere på planter, der forårsager skader på afgrøder ved at fodre på phloem sap. Brun marmorated stank bug (BMSB), Halyomorpha halys (tæger: Pentatomidae) og den asiatiske citrus psyllid (AVS), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) er hemipteran skadedyr indført i Nordamerika, hvor de er en invasiv landbrugs skadedyr af høj værdi speciale, træk, og korte afgrøder og citrusfrugter samt en gene skadedyr, når de samlede indendørs. Insekticidresistens hos mange arter har ført til udviklingen af alternative metoder til pest forvaltningsstrategier. Dobbelt-strenget RNA (dsRNA)-medieret RNA-interferens (RNAi) er en genhæmning mekanisme for funktionelle genomisk undersøgelser, der har potentielle anvendelsesmuligheder som et værktøj til styring af skadedyr. Eksogent syntetiserede dsRNA eller små interfererende RNA (siRNA) kan udløse højeffektive genhæmning gennem nedbrydningen af endogene RNA, som er homolog til der præsenteres. Effektiv og miljømæssig anvendelse af RNAi som Molekylær biopesticider for biocontrol af hemipteran insekter kræver i vivo levering af dsRNAs gennem fodring. Her vi vise metoder til levering af dsRNA til insekter: Ilægning af dsRNA i grønne bønner ved nedsænkning, og absorbere af gen-specifikke dsRNA med oral levering gennem indtagelse. Vi har også skitseret ikke-transgene planter levering metoder ved hjælp af Blandtegning sprays, roden gennembløde, trunk injektioner samt ler granulat, som kan være afgørende for vedvarende frigivelse af dsRNA. Effektiv levering af oralt indtaget dsRNA blev bekræftet som en effektiv dosis til at fremkalde et betydeligt fald i udtryk for målrettede gener, som unge hormon syre O-methyltransferase (JHAMT) og vitellogeninproduktion (Vg). Disse innovative metoder repræsenterer strategier for levering af dsRNA til brug i plantebeskyttelsesmidler og overvinde miljømæssige udfordringer for Plantebeskyttelse og skadedyr.

Vegetabilske medieret dsRNA levering gennem fodring i BMSB 4th instar nymfer blev testet for udvikling af molekylære biopesticider ved hjælp af RNAi for invasive skadedyr. BMSBs foder ved hjælp af deres nål-lignende stylets af en mekanisme, der er kendt som lacerate og skyl, som forårsager betydelig skade på afgrøder. Slank økologisk grønne bønner, P. vulgaris L., blev brugt til at teste, hvis næringsstoffer eller dsRNA kunne leveres i vivo til BMSB...

Watch this Scientific Journal Video about Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects at JoVE.com

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Dobbelt-strenget RNA Oral leveringsmetoder til at fremkalde RNA-interferens i Phloem og plante-sap-fodring Hemipteran insekter

Denne artikel viser romanen teknikker udviklet til oral levering af dobbelt-strenget RNA (dsRNA) gennem de kardiovaskulære væv af planter til RNA-interferens (RNAi) i phloem sap fodring insekter.

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Research

JoVE Journal

Environment

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimer Røggas indstillinger for at fremme mikroalger Vækst i fotobioreaktorer via computersimuleringer

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

En ny anvendelse af elektrisk Penetration Graph (EPG) for at erhverve og måling af elektriske signaler i Phloem Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Samtidig DNA-RNA-ekstraktion fra kystsedimenter og kvantificering af 16S rRNA-generne og udskrifter af Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Metoder til Soil Resampling at overvåge ændringer i de kemiske Koncentrationer af skovbundens

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

Databehandling metoder for 3D seismiske billeddannelse af undergrunden vulkaner: programmer til Tarim oversvømmelse Basalt

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Metode til udvikling af liv tabeller for siddende insekter i den felt ved hjælp af Whitefly, Bemisia tabaci, i bomuld som et modelsystem

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Experimental Methods of Dust Charging and Mobilization on Surfaces with Exposure to Ultraviolet Radiation or Plasmas

Eksperimentelle metoder til støv opladning og mobilisering på overflader med eksponering for Ultraviolet stråling eller plasmaer

Electrostatic dust transport has been hypothesized to explain a number of observations of unusual planetary phenomena. Here, it is demonstrated using ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Høst Venom toksiner fra Assassin Bugs og andre Heteropteran insekter

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Sammensætning og Distribution analyse af Bioaerosols Under forskellige miljøforhold

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Beregning af bladareal ved hjælp af tre forskellige metoder i rene løvfældende stande

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...