Name: double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00
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作者は感謝して実験のため BMSB と HB を提供し、植民地の維持のドナルド ・ ウェーバーとミーガン ハーリヒ (アルス ベルツヴィル, メリーランド、米国農務省) を認めるマリア ・ T ・ ゴンザレス、サルバドール p. ロペス、(米国農務省、アルス、フォート ピアス、フロリダ) と植民地維持、試料調製及び分析ジャッキー ・ l ・ メッツ (フロリダ大学、フォート ピアス、フロリダ)。

1. BMSB 飼育
<ol><li>標準的なラボ実習と説明した63あたりリア BMSB 昆虫。</li>
	<li>グラスハウス (22 ° C) と自然光で柑橘系のアジサイの ACP (黒点) 昆虫を上げます。大人の ACP を使用、約 5-7 日で羽化を投稿します。</li>
</ol>2. 各種遺伝子領域、dsRNAの試験管内合成
<ol><li>以前に発行されたトランスクリプトームのプロファイル...

RNAi は、遺伝子生物学的機能と規制の害虫19,68,69,70,の管理のために利用するための大きな可能性を探索するための重要なツールであること証明されています71. デザインおよび特定の昆虫種の虫に対応する dsRNA(s) の配信方法を黙らせるための適切な遺伝子の選択が最も重?...

半翅目の昆虫は、高い人口成長を達成し、植物の病気を広める能力を agriculturebecause の最も経済的に重要な害虫の一部を構成します。BMSB、 H. 越冬態は 1996年1で報告された最初の目撃にアジア (中国、台湾、韓国、および日本) からペンシルベニア州アレンタウンで西半球で偶然持ち込まれた外来の害虫です。導入以来、BMSB 43 の州で最高の人口だけでなく、カナダ、ヨーロッパ、大西洋 (デ、MD、ペンシルバニア、ニュージャージー州、バージニア、およびウェスト バージニア州) で検出されました、そして農業2へ潜在的な脅威を表します。食性の害虫として BMSB は、リンゴ、ブドウ、観賞植物、種子作物、大豆、トウモロコシなどの高付加価値の作物を含む約 300 の識別された植物ホストへの損傷をしかけることができ。主に動物と維管束組織2,3から栄養素にアクセスを得るために、針のようなスタイレット ホスト作物を貫き、裂くとフラッシュとして知られている餌のモードによる被害です。BMSB 学校など地域生活に住居を見つける可能性があります、また屋内害虫ではあり秋から冬2。化学物質やアレルゲン BMSB によってリリースは、果実収穫労働者の違法なアレルギー反応と報告されました。BMSB も接触性皮膚炎、結膜炎、および敏感な個人4,5で鼻炎をアレルギー疾患に貢献するかもしれない。他の半翅目昆虫、ACP、黒点桑山 (半翅目: Liviidae)、柑橘類の害虫である、師部限定細菌 (カンキツグリーニング病病原細菌うわさの花姫) カンキツグリーニング病 (HLB)、よく知られている原因を転送します。カンキツグリーニング病6,7。HLB は中国南部から最初に報告された、40 異なるアジア、アフリカ、オセアニア、南および北アメリカの国に7を広げています。柑橘類の緑化は柑橘系の果物の損失による経済・金融の損失の恐ろしい世界的な問題それ故に、ACP の管理は最も重要な予防と HLB のと見なされます。
これらの病害虫の効果的な管理のための措置は通常比較的短い化学農薬のアプリケーションが住んでいた必要があります。化学殺虫剤制御戦略頻繁に安全環境管理戦略の欠如や害虫個体群8,9の殺虫剤の抵抗のための感受性を減少しています。したがって、分子バイオ農薬での害虫の生物的防除は潜在的な代わりがその使用を世界的に控えめな、ままあり (例えば、 Trisolcus ミヤコグサ) 寄生蜂の様々 な種も自然な生物として有効かもしれない制御します。RNAi は潜在的な分子バイオ農薬10と侵襲的な害虫を管理するための技術を新興です。RNAi は mRNA 遺伝子表現の規制につながるシーケンス固有の方法で二本の侵入だけでなく、内因性の効果的な転写後の遺伝子サイレンシングを容易によく記載されている遺伝子調節機構レベル11,12。簡単に言えば、ダイサーは、ワーム、ハエ、植物、菌類、および哺乳類13,で保存されたと呼ばれる外因性 dsRNA は Sirna に二座ヌクレアーゼ RNase III スーパーファミリーのメンバーによって処理されるセルに内面化されます。14,15. これら 21-25 のヌクレオチド siRNA のデュプレックスがアンワインドし、Rna をガイドとして RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) に統合します。この RISC RNA 複合体により、ワトソン Crick の基本組み合わせ補色ターゲット mRNA;これは最終的にアルゴノート蛋白質、対応する mRNA が低下し、それにより転写後遺伝子サイレンシングで16につながるタンパク質翻訳を減らす RNase H のようなドメインを含むマルチ ドメイン蛋白質による胸の谷間につながります,17,18。
害虫管理のための RNAi は、siRNA 経路活性化に至る dsRNA体内の興味の遺伝子の沈黙の導入を必要とします。全身 RNAi を誘導するために昆虫および昆虫細胞への dsRNA 配信に使用されている様々 な方法は、10、19,20,21, マイクロインジェクション22, キャリアを沈めるリポソームなどを餌23、および他の技術の24。RNAi は線虫で示されて最初の火災によるunc 22遺伝子発現を沈黙とメロ25キイロショウジョウバエ26で焦がした遺伝子の発現の打撃に続いてだった初期の機能研究活用セイヨウミツバチ22,27、エンドウヒゲナガアブラムシ28、29チャバネゴキブリなどの昆虫に dsRNA を提供するマイクロインジェクションH. 戦って30と鱗翅目昆虫 (Tereniusらによって再検討されました31). マイクロインジェクションは有利な昆虫に興味のあるサイトに正確かつ正確な線量を提供します。とはいえ、そのような敗血症の穿刺は、農業バイオ農薬開発にその実用性を排除するため外傷32, したがって、免疫関連遺伝子の発現を引き出す可能性があります。
生体内でdsRNA を提供する別の方法は、浸漬による摂取や dsRNA を含む細胞外媒体で一般に動物または細胞の懸濁液による dsRNA の吸収を含みます。浸漬は RNAi のショウジョウバエS2 ティッシュ文化セル下流 Raf1 (DSOR1) マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのキナーゼ (MAPKK)20を阻害するだけでなく、の沈黙にc. の elegansを効率的に誘導するために使用されていますpos 1遺伝子33。ただし、浸漬使用して配信 dsRNA はマイクロインジェクション20に比べて RNAi を誘導するために非効率です。RNAi 仲介された咀嚼昆虫におけるサイレンシングは最初、人工寒天ダイエット10に dsRNA を注入することによって西部のトウモロコシ rootworm (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) に示されました。以前の報告書では、節足動物34に固有の自然な食事療法で注入された dsRNA を交付する方法をまとめています。これらの送付方法はさらに配信の人工的な手段に比較的有効であると判断されました。免疫関連遺伝子の等しいノックダウンが dsRNA の血液の食事または microinjected35に配信されたときが観察されたツェツェ バエ (体重) の場合。同様の光ライトブラウンアップル蛾 (Epiphyas postvittana)36(コナガ) コナガ幼虫37、蜂蜜ミツバチ38,39 で飛沫 dsRNA の配達効率的な RNAi を誘導します。ホスト植物の維管束組織を介して配信する必要がありますので、半翅目の昆虫における dsRNA の口頭配達は困難なので、翅の最も効果的な RNAi 実験は dsRNA40の注射を活用しています。効果的な RNAi も ACP ・ ガラス翼狙撃兵ツマグロヨコバイ (GWSS)、 Homalodisca vitripennisで観察された: dsRNA は柑橘類とルートの水薬、葉面散布による維管束組織に dsRNA を吸収したブドウを介して配信されました。スプレー、トランクの注射、あるいは挿し木41,42,43,44,45,46吸収。これはまた ACP (2016 年米国 20170211082 A1) に対して dsRNA の最初の特許になりました。SiRNA の dsRNA の微粒子やリポソームなどキャリアを使用して配信を与える安定性、および配信された dsRNA の有効性の増加が急速に台頭する23,47,48,49 ,50。体外と体内のその治療への応用は、適切な配信ベクトル51計り知れない潜在力を与えるかもしれないのために特別に要約された核酸ナノ粒子による配送車両の新しいクラスです。DsRNA の配信手段としてナノ粒子溶解性、疎水性、限られた濃縮52などの欠点がありますが、適したポリマー支援配信は、これらの欠点を補うこともあります。開発と自己実現のヌクレオチドの利用も浮上と呼ばれる 'アンチセンスオリゴヌクレオチド'、単一鎖 RNA/DNA 二重鎖46であるしています。
節足動物のキーである英領バージン諸島; 体脂肪合成のキーの誘導である複製を制御するプロセス、エクダイソンや幼若ホルモン (JH) による規制英領バージン諸島英領バージン諸島受容体を介したエンドサイトーシス53を介して発展途上卵母細胞によって最終的にとられます。英領バージン諸島はポリペプチドの合成 extraovarially、主要な卵卵黄タンパク質ビテリン54,55の開発のために不可欠である、したがって、再現性と加齢56が重要です。英領バージン諸島はミツバチ (セイヨウミツバチ) RNAi が英領バージン諸島の枯渇を介した成虫および卵の22で観察されたと同様、線虫57で正常に沈黙されています。その枯渇は観察可能な表現型効果につながるよう思って調べたの Vg を介した転写後遺伝子サイレンシング RNAi 減少不妊と多産、潜在的 BMSB コントロールを支援します。S-アデノシル-L-メチオニン (SAM) をエンコードする JHAMT 遺伝子-依存 JH 酸-o-メチルトランスフェラーゼ、58中学生合成経路の最終段階を触媒します。この経路ファルネシル、ファルネソールからは、ピロリン酸 (FPP) 順番に farnesoic 酸メチル farnesoate の JHAMT によって公団への変換後に変換されます。この経路は、昆虫や節足動物変身、ホルモン59,60,61によって規制されて発達プロセス用に保存されています。B. 森、JHAMT 遺伝子発現や、あらたに中学生合成活性は、 JHAMT遺伝子の転写抑制が中学生合成58の終了の重要な示唆されました。したがって、 JHAMT 英領バージン諸島の遺伝子は RNAi を用いた対象の枯渇のために選ばれました。RNAi は、ACP と GWSS の制御のための柑橘類の木でテストされています。ルートの水薬を dsRNA と扱われた柑橘類の木、昆虫の特定アルギニン キナーゼ (AK) 成績証明書42,44に対して二本の葉面散布だけでなく、タップ (トランク注射) を幹します。柑橘類の木々、植物の維管束組織を通じて効率的な配信を示す、ACP と GWSS41,42,の死亡率の増加の結果のキャノピー上すべて検出された dsRNA の塗布45。
現在の研究では、dsRNA など治療のための自然食配信方法を同定しました。この新しく開発された技術の JHAMT、英領バージン諸島を黙らせるために使用されました mRNA として BMSB ニンフの遺伝子特定の二本を使用して実証以前62。ここに示すこれらの新しい配信プロトコルには、外用スプレーまたは薬剤を使用する従来の RNA 配信システムが優先されます。野菜と果物、幹タップ、潅、・で粘土の吸着剤は、biopesticide 害虫や病原体の管理の継続的な発展に重要である dsRNA の配信のため使用する場合があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BMSB (H. halys) insects&#160;</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACP (D. citri) insects&#160;</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">organic green beans</td>
			<td style="width:176px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citrus plants</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hypochlorite solution</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">green food coloring&#160;</td>
			<td>McCormick &#38; Co., Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Forma chambers&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magenta vessel (Culture)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers&#160;</td>
			<td style="width:176px;">IDT DNA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SensiMix SYBR</td>
			<td style="width:176px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">qPCR ABI 7500</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spray bottle</td>
			<td style="width:176px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td>American Can Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TaKaRa Ex Taq</td>
			<td style="width:176px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick</td>
			<td style="width:176px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects

師部と植物の sap 餌昆虫は侵入作物、食用作物の損傷プロセスの栄養素を取得するために果物の整合性です。半翅目の昆虫は、経済的に相当な害虫植物師管液を摂食による農作物の被害を引き起こす可能性の数を占めています。クサギカメムシ (BMSB)、クサギカメムシ越冬(カメムシ亜目: カメムシ科) と、ミカンキジラミ (ACP)、ミカンキジラミ桑山 (半翅目: Liviidae) が北アメリカに導入された半翅目害虫、彼ら屋内では、柑橘系の果物と主食行、付加価値の高い専門の侵襲性の農業害虫として不快害虫が。多くの種の殺虫剤抵抗性は害虫管理戦略の代替法の開発につながっています。二本鎖 RNA (dsRNA)-仲介された RNA 干渉 (RNAi) はジーンサイレンシングの害虫の管理のためのツールは、潜在的なアプリケーション機能ゲノム研究機構。外因合成 dsRNA または小さい干渉の RNA (siRNA) は、非常に効率的な遺伝子サイレンシング提示に相同である内因性 RNA の分解を介してトリガーできます。RNAi の半翅目昆虫の生物的防除のための分子バイオ農薬として効果的かつ環境使用を介して供給二本鎖 rna の生体内で配信が必要です。昆虫への dsRNA の配信方法を示す: 浸漬、緑の豆に dsRNA の読み込みと摂取を介して口頭配達と遺伝子特異的 dsRNA の吸収します。我々 はまた粘土顆粒と同様、葉面散布、根の水薬、トランク注射 dsRNA の徐放に不可欠なすべての可能性がありますを使用して非遺伝子組換え植物配信アプローチを概説しました。経口摂取の dsRNA によって効率的な配信は、ターゲット遺伝子"幼若ホルモン酸-o-メチルトランスフェラーゼ"(JHAMT) と (vg) の発現低下を誘導するために効果的な投与量として確認されました。これらの革新的な方法を表す作物保護で使用し、害虫管理のための環境の課題を克服する dsRNA の配達のための戦略。

BMSB 4th齢幼虫の摂食による野菜の仲介された dsRNA 配信は侵襲的な害虫の RNAi を用いた分子バイオ農薬の開発のテストされました。BMSBs フィードと呼ばれるメカニズムによって、針のようなスタイレットを使用して裂くし、フラッシュ、作物にかなりの被害が発生します。細長い有機緑豆、 P. 尋常性L、栄養素や dsRNA が体内BMSB を通じて届け餌<sup c...

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Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の RNA 干渉を誘発する二本鎖 RNA の経口配信方法

この記事では、RNA 干渉 (RNAi) 昆虫を摂食する師管液中の植物の維管束組織を通して二本鎖 RNA (dsRNA) の口頭配達のために開発する手法を示します。

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