Name: double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects at JoVE.com

Forfatterne erkjenner takknemlig Donald Weber og Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) gir BMSB og HB for eksperimentering og opprettholde koloniene; og Maria T. Gonzalez Salvador P. Lopez (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) og Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) for kolonien vedlikehold, prøve forberedelse og analyser.

1. BMSB bakside
<ol><li>Bak BMSB insekter som standard lab praksis og beskrevet tidligere63.</li>
	<li>Øke ACP (D. citri) insekter på sitrus macrophylla i en glasshouse (22 ° C) og naturlig lys. Bruk voksen ACP, på ca 5-7 dager legge eclosion.</li>
</ol>2. valg av Gene regioner og I Vitro syntese av dsRNA
<ol><li>Velg gener gjelder BMSB fra tidligere publiserte transcriptome profiler32.</li>
	<li>Sikre regionene run...

RNAi har vist seg for å være et viktig verktøy for å utforske gen biologisk funksjon og regulering, med stort potensial til å brukes til behandling av insekt skadedyr19,68,69,70, 71. design og valg av en passende gene(s) for å stanse i insekt artene og metode for levering av det tilsvarende dsRNA(s) til insekt er av største betydning. Den optimale meto...

Hemipteran insekter omfatter noen av økonomisk betydelige skadedyr av agriculturebecause evne å oppnå opphøyet befolkningsvekst og spre sykdommer i planter. BMSB, H. halys Stål, er en invasiv pest som tilfeldigvis ble innført i den vestlige halvkulen i Allentown, Pennsylvania fra Asia (Kina, Taiwan, Korea og Japan) med den første sighting i 19961. Siden introduksjonen, BMSB påvist i 43 stater, med høyeste befolkningen i midtatlantiske (DE, MD, PA, NJ, VA, og WV), som i Canada og Europa, og representerer en potensiell trussel mot landbruket2. Som en Plantesugere pest, kan BMSB bringe skade på ca 300 identifiserte anlegget verter inkludert høy verdi avlinger som epler, druer, dekorative planter, frø avlinger, soyabønner og mais. Skaden skyldes hovedsakelig skyldes modus for fôring kjent som lacerate og flush der dyr gjennomborer vert avlingen med sin nål som stylet å få tilgang til næringsstoffer fra vaskulær vev2,3. BMSB er også et innendørs pest som de kan finne bolig i levende områder som skoler og hus i løpet av høsten gjennom vinteren2. Kjemikalier og aeroallergens befridd av BMSB ble rapportert til illegale allergisk reaksjon i frukt beskjære arbeidere. BMSB kan også bidra til allergiske sykdommen fører til kontakteksem, konjunktivitt og rhinitt i følsomme individer4,5. En annen hemipteran insekt, den ACP, D. citri Kuwayama (Nebbmunner: Liviidae) er en alvorlig pest av sitrusfrukter og overfører phloem-begrenset bakterier (Candidatus Liberibacter asiaticus) forårsaker Huanglongbing (HLB), bedre kjent sitrus greening sykdom6,7. HLB ble først rapportert fra Sør-Kina og har spredt seg til 40 forskjellige asiatiske, afrikanske, Oceanian, Sør og Nord-amerikanske land7. Sitrus greening er et verdensomspennende problem med truende økonomiske og finansielle tap som følge av sitrusfrukter tap; dermed regnes styring av ACP av største betydning å forebygge og kontrollere HLB.
Tiltak for effektiv kontroll over disse insekt skadedyr vanligvis krever bruk av kjemiske plantevernmidler som er relativt korte bodde. Kjemisk insektmiddel kontroll strategier ofte mangler trygt miljøledelse strategier eller har avtatt mottakelighet på grunn av plantevernmidler motstand i pest bestander8,9. Derfor biologisk kontroll av skadedyr med molekylær biopesticides er et potensielt alternativ, men bruk er fortsatt globalt beskjedne, og ulike arter av parasitoider (f.eks Trisolcus japonicus) kan også være effektiv som naturlig biologisk Kontroller. RNAi er potensielt en kommende teknologi for håndtering av invasiv insekt skadedyr med molekylær biopesticides10. RNAi er en godt beskrevet genet regulatoriske mekanisme som muliggjør effektive posttranscriptional gene silencing av endogene samt invaderende dsRNAs i en sekvens-spesifikk måte, som til slutt fører til regulering av genuttrykk på mRNA nivå11,12. Kort, når eksogene dsRNA er internalisert i en celle det behandles i siRNAs av et medlem av bidentate nuclease RNase III gruppe, kalt Dicer, som er evolutionarily bevart i ormer, fluer, planter, sopp og pattedyr13, 14 , 15. disse 21-25 nucleotide siRNA duplexes deretter avviklet og integrert i RNA-indusert stanse komplekset (RISC) som guide RNAs. RISC-RNA komplekset kan Watson-Crick base sammenkobling til den supplerende målrette mRNA; Dette fører til slutt til spalting av Argonaute protein, en multi domene protein inneholder et RNase H-lignende domene, som forringer den tilsvarende mRNA og reduserer protein oversettelsen, og dermed fører til posttranscriptional gene stanse16 , 17 , 18.
RNAi for pest administrasjon krever innføring av dsRNA i vivo til taushet genet av interesse, og dermed aktivere siRNA veien. Ulike metoder som har blitt brukt for dsRNA levering til insekter og insekt celler for å indusere systemisk RNAi inkluderer fôring10,19, soaking20,21, microinjection22, bærere som liposomer 23og andre teknikker24. RNAi var første i Caenorhabditis elegans til taushet unc-22 genuttrykk av brann og Mello25, etterfulgt av knockdown i uttrykket av frizzled genene i Drosophila melanogaster26. Første funksjonelle studier utnyttet microinjection å levere dsRNA i insekter, som APIene mellifera22,27, Acyrthosiphon erter28, Blattella germanica29, H. halys30og Lepidoptera insekter (anmeldt av Terenius et al. 31). microinjection er en fordel å gi en nøyaktig og presis dose til området av interesse i insekt. Men slike septisk punkteringer kan framprovosere uttrykket av immun beslektede gener på grunn av traumer32, derfor utelukker praktiske sin i landbruket biopesticides utvikling.
En annen metoden å levere dsRNA i vivo er soaking, som innebærer inntak eller absorpsjon av dsRNA av suspensjon av dyr eller celler generelt i ekstracellulære medium som inneholder dsRNA. Soaking er brukt til å indusere effektivt RNAi i Drosophila S2 vev kultur celler å hemme Downstream-av-Raf1 (DSOR1) mitogen-aktivert protein kinase kinase (MAPKK)20og C. elegans å slå POS-1 gene33. DsRNA leveres ved hjelp av soaking er imidlertid mindre effektiv å indusere RNAi forhold til microinjection20. RNAi formidlet stanse i et tygge insekt ble først vist i vestlige mais rootworm (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) av infusjonen dsRNA i en kunstig agar kosthold10. Tidligere rapporter har oppsummert metoder for å levere dsRNA infundert i natural dietter gjelder leddyr34. Disse leveringsmåter var mer bestemt å være sammenlignbare effektivt å kunstig mulighet levering; som i tilfelle av tsetse fly (Glossina morsitans morsitans), der lik knockdown av en immun-relaterte genet ble observert når dsRNA ble levert enten gjennom blod måltid eller microinjected35. Tilsvarende levering av dsRNA gjennom dråper i lys brun apple møll (Epiphyas postvittana)36, diamondback møll (Plutella xylostella) Larvene37, samt honning bier38,39 indusert effektiv RNAi. Mest effektive RNAi eksperimenter i hemipteran har utnyttet injeksjon av dsRNA40 fordi muntlig levering av dsRNA i hemipteran insekter er vanskelige siden det skal leveres gjennom verten anlegget vaskulær vev. Effektiv RNAi ble også observert i ACP og glassaktig vanlig sharpshooter leafhopper (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA ble levert gjennom sitrus og vinranker som hadde absorbert dsRNA i vaskulær vev gjennom roten skyll, foliar spray, trunk injeksjoner eller av borekaks41,42,43,44,45,46. Dette resulterte også i første patentet for dsRNA mot ACP (2016, oss 20170211082 A1). SiRNA og dsRNA med bærere som nanopartikler og liposomer formidler stabilitet, og øker i leverte dsRNA effekt er raskt voksende23,47,48,49 ,50. En ny klasse av hydrogenion basert levering biler for nukleinsyrer i vitro og i vivo som var oppsummert spesielt for terapeutiske programmer kan formidle enorme potensial som passer levering vektorer51. Nanopartikler som en levering kjøretøy for dsRNA kan ha ulemper inkludert løselighet, hydrophobicity eller begrenset bioakkumulering52, men en passende polymer hjelpe levering kan kompensere disse ulempene. Utvikling og bruk av selv levere nukleotider dukker også kalt "antisense oligonucleotides", som enkelt strandet RNA/DNA duplexes46.
Vitellogenesis i leddyr er en nøkkel-prosess kontroll reproduksjon og regulert av juvenile hormon (JH) eller isoinokosterone, som er de viktigste indusere av Vg syntese av kroppsfett; Vg er til slutt tatt opp av den utvikle oocyte via Vg reseptor-mediert endocytose53. VG er en gruppe av polypeptides syntetisert extraovarially, som er avgjørende for utvikling av store egg eggeplomme protein, vitellin54,55, og derfor er det viktig for reproduksjon og aldring56. VG har vært vellykket forstummet i nematoder57 samt honningbie (APIene mellifera) der RNAi mediert uttømming av Vg ble observert i voksne og egg22. RNAi formidlet posttranscriptional gene stanse Vg ble testet fordi det ble antatt sin uttømming ville føre til en observerbar fenotypiske effekt som redusert fruktbarhet og fruktbarhet, å hjelpe BMSB kontroll. JHAMT genet som kodes i S-adenosyl-L-metionin (SAM)-avhengige JH syre O-methyltransferase, gir det siste trinnet av JH biosyntesen sti58. I denne veien farnesyl er pyrophosphate (FPP) sekvensielt forvandlet fra farnesol, til farnesoic syre etterfulgt av konvertering av metyl farnesoate til JH av JHAMT. Denne veien er bevart i insekter og leddyr spesielt for metamorfose, en prosess som er developmentally regulert av hormoner59,60,61. I B. moriforeslår JHAMT genuttrykk og JH biosyntetiske aktiviteten i Corpora allata at transcriptional undertrykkelse av JHAMT genet er avgjørende for avslutning av JH biosyntesen58. Derfor ble JHAMT og Vg genene valgt for målrettet uttømming bruker RNAi. RNAi ble også testet i sitrustrær for kontroll av ACP og GWSS. Sitrus trær ble behandlet med dsRNA gjennom roten skyll, stammer trykk (bagasjerommet injeksjoner), samt foliar spray med dsRNAs mot insekt bestemt arginine kinase (AK) transkripsjoner42,44. Aktuell anvendelse av dsRNA ble oppdaget over kalesjen av sitrustrær, indikerer effektiv levering gjennom planter vaskulær vev, og resulterte i økte dødeligheten i ACP og GWSS41,42, 45.
I denne studien, har vi identifisert en naturlig kosten Leveringsmetode for behandlinger som dsRNA. Denne nyutviklet teknikken ble brukt for å stanse JHAMT og Vg mRNA bruke genet bestemte dsRNAs i BMSB nymfer som vist tidligere62. Disse nye levering protokoller demonstrert her erstatter konvensjonelle RNA leveringssystemer som bruker aktuell spray eller microinjections. Grønnsaker og frukt, stilk trykk, jord gjennomvåt og leire Absorpsjonsmidler i kan bli brukt for levering av dsRNA, som er avgjørende for videreutvikling av biopesticide pest og patogen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BMSB (H. halys) insects&#160;</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACP (D. citri) insects&#160;</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">organic green beans</td>
			<td style="width:176px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citrus plants</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hypochlorite solution</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">green food coloring&#160;</td>
			<td>McCormick &#38; Co., Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Forma chambers&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magenta vessel (Culture)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers&#160;</td>
			<td style="width:176px;">IDT DNA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SensiMix SYBR</td>
			<td style="width:176px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">qPCR ABI 7500</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spray bottle</td>
			<td style="width:176px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td>American Can Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TaKaRa Ex Taq</td>
			<td style="width:176px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick</td>
			<td style="width:176px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects

Phloem og anlegg sap fôring insekter invadere integriteten til avlinger og frukt hente næringsstoffer, i prosessen skade matavlinger. Hemipteran insekter konto for en rekke økonomisk betydelige skadedyr planter som skade avlinger av fôring på phloem sap. Brun marmorated stinker feilen (BMSB), Halyomorpha halys (Teger: Pentatomidae) og den asiatisk sitrus psyllid (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Nebbmunner: Liviidae) er hemipteran insekt skadedyr introdusert i Nord-Amerika, hvor de er en invasiv landbruket pest av høy verdi spesialitet, rad og stifte avlinger og sitrusfrukter, samt en ordensforstyrrelser plage når de samle innendørs. Insektmiddel motstand i mange arter har ført til utviklingen av alternative metoder for pest management strategier. Double-strandet RNA (dsRNA)-mediert RNA-interferens (RNAi) er et gen stanse mekanisme for funksjonell genomisk studier som har potensielle anvendelser som et verktøy for styring av insekt skadedyr. Exogenously syntetisert dsRNA eller lite forstyrrende RNA (siRNA) kan utløse høyeffektive genet stanse gjennom nedbrytning av endogene er svært følsomt som presenteres. Effektiv og miljømessige bruk av RNAi som molekylær biopesticides for biocontrol av hemipteran krever i vivo levering av dsRNAs gjennom fôring. Her viser vi metoder for levering av dsRNA til insekter: lasting av dsRNA i grønne bønner ved nedsenkning og absorberende av gen-spesifikke dsRNA med oral levering gjennom inntak. Vi har også skissert ikke-transgene plante levering tilnærminger med foliar spray, rot skyll, trunk injeksjoner samt leire korn, som kan være avgjørende for vedvarende utgivelsen av dsRNA. Effektiv levering av muntlig ingested dsRNA bekreftet som en effektiv dose å indusere en betydelig reduksjon i uttrykk for målrettet gener, som yngel hormon syre O-methyltransferase (JHAMT) og vitellogenin (Vg). Disse innovative metoder representerer strategier for levering av dsRNA til bruk i avlingsvern og overvinne miljøutfordringer for pest management.

Vegetabilsk mediert dsRNA levering gjennom fôring i BMSB 4th skikkelsen nymfer ble testet for utvikling av molekylære biopesticides bruker RNAi for invasiv insekt skadedyr. BMSBs feed ved hjelp av deres inntil stylets av en mekanisme som kalles lacerate og flush, som forårsaker betydelig skade på avlinger. Slank organiske grønne bønner, P. vulgaris L., ble brukt til å teste om næringsstoffer eller dsRNA kan leveres i vivo til BMSB gjennom fôring<sup c...

Watch this Scientific Journal Video about Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects at JoVE.com

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Double-strandet RNA Oral leveringsmåter å indusere RNA-interferens i Phloem og anlegg-sap-fôring Hemipteran insekter

Denne artikkelen viser romanen teknikker utviklet oral levering av double-strandet RNA (dsRNA) gjennom vaskulær vev av planter for RNA-interferens (RNAi) i phloem sap fôring insekter.

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Research

JoVE Journal

Environment

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimalisere Røykgass Innstillinger for å fremme Mikroalger Vekst i fotobioreaktorer via datasimulering

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Et nytt program av det elektriske Penetration Graph (EPG) for Anskaffelse og måling av elektriske signaler i barken Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Samtidig DNA-RNA Utvinning fra Kyst Sedimenter og kvantifisering av 16S rRNA gener og transkripsjoner av Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Metoder for Soil Omsampling å overvåke endringer i den kjemiske Konsentrasjoner av skogsjord

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

Databehandling metoder for 3D seismikk av undergrunnen vulkaner: programmer Tarim flom Basalt

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Metodikk for å utvikle livet tabeller for fastsittende insekter i feltet ved hjelp av Whitefly, Bemisia tabaci, i bomull som et modellsystem

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Experimental Methods of Dust Charging and Mobilization on Surfaces with Exposure to Ultraviolet Radiation or Plasmas

Eksperimentelle metoder for støv lading og mobilisering på overflater med eksponering for ultrafiolett stråling eller Plasmas

Electrostatic dust transport has been hypothesized to explain a number of observations of unusual planetary phenomena. Here, it is demonstrated using ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Høsting gift giftstoffer fra Assassin Bugs og andre Heteropteran insekter

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Sammensetning og distribusjon analyse av Bioaerosols Under ulike miljøforhold

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Leaf Area index estimering bruke tre distinkte metoder i Pure løvskog stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...