Name: double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00
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Os autores reconhecem com gratidão Donald Weber e Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) para fornecer BMSB e HB para experimentação e manter as colônias; e Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) e Jackie L. Metz (Universidade da Flórida, Fort Pierce, FL) para manutenção da colônia, preparação de amostras e análises.

1. BMSB criação
<ol><li>Traseira BMSB insetos como por prática de laboratório padrão e descrito anteriormente63.</li>
	<li>Levante os insetos ACP (d. citri) em Citrus macrophylla em uma estufa (22 ° C) e a luz natural. Uso adulto ACP, em aproximadamente 5-7 dias pós eclosão.</li>
</ol>2. seleção de Gene regiões e síntese In Vitro de dsRNA
<ol><li>Selecione os genes específicos para BMSB publicados anteriormente transcriptome perfi...

RNAi tem provado para ser uma importante ferramenta para explorar a função biológica do gene e o regulamento, com grande potencial para ser utilizado para a gestão de pragas19,68,69,70, 71. o projeto e a seleção de um genes apropriados para silenciar em uma determinada espécie de inseto e o método de entrega de dsRNA(s) o correspondente para o inseto ...

Hemipteran insetos compõem algumas das pragas mais economicamente importantes do agriculturebecause de sua capacidade para atingir o crescimento populacional elevado e espalhar doenças em plantas. O BMSB, H. Hális Stål, é uma praga invasora que foi introduzida acidentalmente no hemisfério ocidental em Allentown, Pensilvânia da Ásia (China, Taiwan, Coreia e Japão) com o primeiro avistamento relatado em 19961. Desde a sua introdução, o BMSB foi detectada em 43 Estados, com as populações mais altas no meio do Atlântico (DE, MD, PA, NJ, VA e WV), bem como no Canadá e Europa e representa uma ameaça potencial para a agricultura2. Como uma praga polífaga, BMSB pode instigar danos para aproximadamente 300 hosts de plantas identificadas, incluindo culturas de alto valor, tais como maçãs, uvas, plantas ornamentais, oleaginosas, soja e milho. Dano é causado principalmente devido ao modo de alimentação conhecido como lacerate e nivelado, onde o animal atravessa a cultura do anfitrião com seu estilete da agulha para obter acesso aos nutrientes do tecidos vasculares2,3. BMSB também é um interior de pragas que podem encontrar residência em áreas vivas, tais como escolas e casas durante o outono até o inverno de2. Produtos químicos e aeroallergens lançadas pela BMSB foram relatadas como ilícita reação alérgica em trabalhadores de colheita de frutas. BMSB também pode contribuir para doença alérgica levando a dermatite de contato, conjuntivite e rinite em indivíduos sensíveis4,5. Outro inseto hemipteran, o ACP, d. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), é uma séria Praga de frutas cítricas e transmite a bactéria limitada no floema (Candidatus Liberibacter asiaticus) causando Huanglongbing (HLB), mais conhecido como cítricas greening doença6,7. HLB foi primeiramente relatada do Sul da China e se espalhou para 40 diferentes asiático, África, Oceania, Sul e norte-americano países7. Cítrica greening é um problema mundial com ameaça de perdas económicas e financeiras devido à perda de citrinos; Portanto, gestão da ACP é considerada de suma importância para prevenir e controlar o HLB.
Medidas para o controle efetivo destas pragas de insetos geralmente requer a aplicação de pesticidas químicos que são relativamente curto viveu. Estratégias de controle químico insecticida muitas vezes faltam de estratégias de gestão ambiental segura ou diminuíram a susceptibilidade devido à resistência de pesticidas em populações de pragas8,9. Portanto, o controle biológico de pragas com biopesticidas moleculares é uma alternativa potencial, mas seu uso permanece globalmente modesto, e várias espécies de parasitoides (por exemplo, Trisolcus japonicus) podem também ser eficazes como biológico natural controles. RNAi é um potencial de tecnologia para o gerenciamento de pragas invasoras com biopesticidas molecular10emergente. RNAi é um mecanismo regulatório de gene bem descrito que facilita o silenciamento de genes posttranscriptional eficaz de endógenos bem como invadir dsRNAs de maneira sequência-específicos, que eventualmente leva a regulação da expressão do gene no mRNA nível11,12. Brevemente, quando dsRNA exógeno é internalizado em uma célula, que ele é processado em siRNAs por um membro da superfamília de RNase III nuclease bidentado, chamado Dicer, que é conservado evolutivamente em moscas, vermes, plantas, fungos e mamíferos13, 14 , 15. estes duplex de siRNA 21-25 nucleotídeos são então desenrolados e integrados no complexo RNA-induced silencioso (RISC) como guia de RNAs. Este complexo RISC-RNA permite o pareamento de Watson-Crick base para o complementar destino mRNA; eventualmente, isto leva a clivagem pela proteína Argonaute, uma proteína de multi domínio que contém um domínio de H-como RNase, que degrada o mRNA correspondente e reduz a tradução da proteína, levando assim ao silenciamento16 do gene posttranscriptional , 17 , 18.
RNAi para gestão de pragas requer a introdução do dsRNA na vivo para silenciar o gene de interesse, ativando assim o percurso de siRNA. Diversos métodos que foram usados para dsRNA entrega aos insetos e células de inseto para induzir RNAi sistêmica incluem alimentação10,19,20,21, microinjeção22, portadores de imersão como lipossomas 23e outras técnicas de24. RNAi foi primeiro demonstrado em elegans de Caenorhabditis para silenciar a expressão de gene unc-22 pelo fogo e Mello25, seguido por nocaute na expressão dos genes em Drosophila melanogaster26crespos. Os estudos funcionais iniciais utilizaram microinjeção para entregar dsRNA em insetos, como Apis mellifera22,27, piolho pisum28, Blattella germanica29, H. Hális30e insetos lepidópteros (revistos por Terenius et al 31). microinjection é vantajosa para entregar uma dose exata e precisa para o site de interesse no inseto. Embora tais puncturas sépticas podem eliciar a expressão de genes relacionados imunes devido a trauma32, portanto, descartando sua praticidade em desenvolvimento agrícola biopesticidas.
Outro método de entrega de dsRNA na vivo é por imersão, que envolve ingestão ou absorção do dsRNA por suspensão de animais ou células geralmente no meio extracelular, contendo dsRNA. Imersão foi usado para induzir eficientemente RNAi em células de cultura de tecidos de drosófila S2 para inibir a jusante-de-Raf1 (DSOR1) o mitogen-ativado proteína quinase quinase (MAPKK)20, assim como em c. elegans para silenciar o pos-1 gene33. No entanto, dsRNA entregado usando imersão é menos eficiente para induzir RNAi comparado a microinjeção20. RNAi mediada silenciar em um inseto mastigação era primeiro mostrado no repele milho (RPT) (Diabrotica virgifera virgifera) infundindo o dsRNA em uma dieta de ágar artificial10. Relatórios anteriores tem resumido métodos para entregar dsRNA infundido em dietas naturais específicas para artrópodes34. Esses métodos de entrega foram ainda mais determinados a ser comparavelmente eficazes meios artificiais de entrega; Como é o caso da mosca tsé-tsé (Glossina morsitans morsitans), onde "knockdown" igual de um gene imune-relacionados foi observado quando dsRNA foi entregue por meio de farinha de sangue ou microinjected35. Da mesma forma, a entrega do dsRNA através de gotículas no apple marrom luz traça (Epiphyas postvittana)36, diamondback moth (Plutella plutella) larvas37, bem como as abelhas de mel38,39 induzida por RNAi eficiente. Experimentos de RNAi mais eficazes em hemipteran têm utilizado a injeção do dsRNA40 porque entrega oral do dsRNA em insetos hemipteran é árdua, já que ele deve ser entregue através de tecidos vasculares da planta hospedeira. RNAi eficaz também foi observada em ACP e Cicadellidae atirador-de-asa-vítreo (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA foi entregue através de citros e as videiras que tinham absorvido os tecidos vasculares através de embebe de raiz, foliar dsRNA pulverizadores, injeções de tronco ou absorção por estacas41,42,,43,44,45,46. Isto também resultou na primeira patente para dsRNA contra o ACP (2016, nos 20170211082 A1). Entrega de siRNA e dsRNA usando as transportadoras como nanopartículas e lipossomas transmite estabilidade, e aumento da eficácia do dsRNA entregues rapidamente está surgindo23,,47,48,49 ,50. Uma nova classe de veículos de entrega baseados em nanopartículas de ácidos nucleicos para in vitro e em vivo que foi resumida especificamente para aplicações terapêuticas podem dar imenso potencial como vectores de entrega adequada51. Nanopartículas como um veículo de entrega para dsRNA podem ter desvantagens incluindo solubilidade, hidrofobicidade ou limitada bioacumulação52, mas uma entrega ajudando polímero apropriado pode compensar estas desvantagens. Desenvolvimento e uso de auto entrega de nucleotídeos emergem também chamados 'oligonucleotides antisentido', que são o único encalhado RNA/DNA duplex46.
Vitelogênese nos Artrópodes é uma chave de processo de controle de reprodução e regulado pelo hormônio juvenil (JH) ou isoinokosterone, que são as chaves indutores da síntese de Vg pela gordura corporal; o Vg é eventualmente ocupado pelo oócito em desenvolvimento através de de endocitose receptor mediado Vg53. VG é um grupo de polipeptídeos sintetizados extraovarially, que é essencial para o desenvolvimento da proteína de gema de ovo grande, vitelina54,55, e portanto, é importante na reprodução e envelhecimento56. VG foi silenciada com êxito em nematoides57 , bem como em abelhas (Apis mellifera) onde RNAi mediada por esgotamento de Vg foi observada em adultos e ovos22. RNAi mediada silenciamento posttranscriptional de Vg foi testado porque pensava que seu esgotamento conduziria a um efeito fenotípico observável como reduzida fertilidade e fecundidade, potencialmente ajudar no controle BMSB. O gene JHAMT que codifica a S-adenosyl-L-metionina (SAM)-dependente JH ácido O-Metiltransferase, catalisa a etapa final da biossíntese JH via58. Neste caminho Farnesil pirofosfato (FPP) sequencialmente é transformado de farnesol, ao ácido farnesoic, seguido por conversão de metil farnesoate JH por JHAMT. Esta via é conservada em insetos e artrópodes especificamente para a metamorfose, um processo que mentalmente é regulamentado por hormônios59,60,61. Em b. mori, expressão do gene JHAMT e a atividade biossintética de JH na Corpora allata sugerem que a supressão transcricional do gene JHAMT é crucial para a rescisão de JH biossíntese58. Portanto, os genes JHAMT e Vg foram selecionados para esgotamento alvo usando RNAi. RNAi também foi testado em árvores de citrinos para controle da ACP e GWSS. Árvores cítricas foram tratadas com dsRNA através de embebe de raiz, da haste da torneira (injeções de tronco), assim como pulverizações foliares com dsRNAs contra inseto específico arginina quinase (AK) transcrições42,44. A aplicação tópica de dsRNA foi detectada na Copa das árvores de citrinos, indicando uma entrega eficiente através dos tecidos vasculares de plantas e resultou em aumento da mortalidade em ACP e GWSS41,42, 45.
No estudo atual, nós identificamos um método de entrega de dieta natural para tratamentos como dsRNA. Esta técnica recentemente desenvolvida foi posteriormente usada para silenciar o JHAMT e o Vg mRNA usando o gene específico dsRNAs em ninfas BMSB como demonstrado anteriormente62. Estes novos protocolos de entrega demonstrados aqui substituem sistemas convencionais da entrega do RNA que usar sprays tópicos ou microinjeções. Legumes e frutas, haste da torneira, encharcando o solo e absorventes de argila em podem ser utilizados para entrega de dsRNA, que é fundamental para o desenvolvimento contínuo de Biopesticida gestão de pragas e patógenos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BMSB (H. halys) insects&#160;</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACP (D. citri) insects&#160;</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">organic green beans</td>
			<td style="width:176px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citrus plants</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hypochlorite solution</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">green food coloring&#160;</td>
			<td>McCormick &#38; Co., Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Forma chambers&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magenta vessel (Culture)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers&#160;</td>
			<td style="width:176px;">IDT DNA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SensiMix SYBR</td>
			<td style="width:176px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">qPCR ABI 7500</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spray bottle</td>
			<td style="width:176px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td>American Can Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TaKaRa Ex Taq</td>
			<td style="width:176px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick</td>
			<td style="width:176px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects

Floema e planta seiva alimentação insetos invadem a integridade das culturas e frutas para recuperar nutrientes, no processo de danificar as culturas alimentares. Hemipteran insetos são responsáveis por uma série de pragas economicamente substanciais de plantas que causam danos a culturas alimentando na seiva do floema. O marrom marmorated percevejo (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) e os asiáticos citrinos psilídeos (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) são pragas hemipteran introduzidas na América do Norte, onde eles são uma praga agrícola invasiva da especialidade de alto valor, linha e culturas descontínuas e frutas cítricas, bem como uma praga de incômodo quando eles agregam dentro de casa. Resistência de inseticida em muitas espécies tem levado ao desenvolvimento de métodos alternativos de estratégias de manejo de pragas. Double-stranded do RNA (dsRNA)-mediada de RNA de interferência (RNAi) é um mecanismo para estudos de genômicos funcionais que tem aplicações potenciais como uma ferramenta para o manejo de insetos-praga de silenciamento do gene. DsRNA exogenamente sintetizado ou RNA de interferência pequeno (siRNA) pode desencadear silenciamento de genes altamente eficiente através da degradação do RNA endógeno, que é homólogo ao apresentado. Utilização eficaz e ambiental de RNAi como biopesticidas moleculares para biocontrole de insetos hemipteran exige a entrega na vivo de dsRNAs através da alimentação. Aqui podemos demonstrar métodos para a entrega do dsRNA aos insetos: carregamento do dsRNA em feijão verde por imersão e absorção de dsRNA gene-específico com entrega oral através da ingestão. Descrevemos também plantas não-transgênicas entrega abordagens utilizando pulverizadores foliares, embebe de raiz, injeções de tronco, bem como grânulos de argila, que pode ser essencial para liberação sustentada do dsRNA. Entrega eficiente por dsRNA ingerida por via oral foi confirmada como uma dosagem eficaz para induzir uma redução significativa na expressão de genes alvo, tais como o hormônio juvenil ácido O-Metiltransferase (JHAMT) e vitellogenin (Vg). Estes métodos inovadores representam estratégias para entrega do dsRNA para uso em proteção de cultivos e superar os desafios ambientais para a gestão de pragas.

Entrega de vegetais dsRNA mediada através da alimentação em BMSB 4th ínstar ninfas foi testada para o desenvolvimento de biopesticidas moleculares usando RNAi para pragas invasoras. BMSBs alimentação usando seus estiletes de agulha através de um mecanismo conhecido como dilacerar e flush, que provoca danos consideráveis para as culturas. Delgados feijão verde orgânico, p. vulgaris L., foram usado para testar se a nutrientes ou dsRNA pôde ser entregue na ...

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Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Métodos de entrega Double-stranded RNA Oral para induzir a interferência do RNA no floema e insetos Hemipteran planta-sap-alimentação

Este artigo demonstra novas técnicas desenvolvidas para entrega oral de RNA double-stranded (dsRNA) através dos tecidos vasculares das plantas para o RNA de interferência (RNAi) na seiva do floema alimentação de insetos.

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

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