Name: double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00
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Los autores reconocen agradecidos Donald Weber y Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) para proporcionar BMSB y HB para la experimentación y el mantenimiento de las colonias; y Maria T. Gonzalez, Salvador P. López, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) y Jackie L. Metz (Universidad de Florida, Fort Pierce, FL) para el mantenimiento de la Colonia, preparación de muestras y análisis.

1. BMSB de cría
<ol><li>Trasero BMSB insectos según descrita63y la práctica de laboratorio estándar.</li>
	<li>Criar insectos ACP (D. citri) sobre Citrus macrophylla en un invernadero (22 ° C) y luz natural. Uso adulto ACP, en aproximadamente 5-7 días post eclosión.</li>
</ol>2. selección de las regiones de genes y síntesis In Vitro de dsRNA
<ol><li>Seleccionar genes específicos para BMSB de transcriptoma previamente publicado perfil...

Arni ha demostrado para ser una herramienta importante para explorar la función biológica de genes y regulación, con gran potencial para ser utilizados para el manejo de plagas19,68,69,70, 71. el diseño y selección de un apropiado genes para silenciamiento de una determinada especie de insecto y el método de la entrega de la correspondiente dsRNA(s) al ...

Hemipteran insectos incluyen algunas de las plagas económicamente más importantes del agriculturebecause de su capacidad para lograr un crecimiento elevado de la población y enfermedades en plantas. BMSB, H. halys Stål, es una plaga invasora que accidentalmente se introdujo en el hemisferio occidental en Allentown, Pennsylvania de Asia (China, Taiwán, Corea y Japón) con el primer avistamiento reportado en 19961. Desde su introducción, BMSB se ha detectado en 43 Estados, con las poblaciones más altas en el mediados de-Atlántico (DE, MD, PA, NJ, Virginia y WV), así como en Canadá y Europa y representa una amenaza potencial para la agricultura2. Como una plaga polífaga, BMSB puede propiciar daños a aproximadamente 300 anfitriones de la planta identificada como cultivos de alto valor tales como manzanas, uvas, plantas ornamentales, cultivos de semillas, soja y maíz. Daño es causado principalmente por el modo de alimentación conocido como lacerar y al ras cuando el animal atraviesa el cultivo del anfitrión con su estilete de la aguja para acceder a los nutrientes de los tejidos vasculares de2,3. BMSB es también una plaga interior como puede encontrar la residencia en áreas de la vida tales como escuelas y casas durante otoño invierno2. Productos químicos y aeroalérgenos lanzados por BMSB reportaron reacción alérgica ilícita en trabajadores de cultivos de frutas. BMSB también pueden contribuir a enfermedad alérgica a dermatitis por contacto, conjuntivitis y rinitis en personas sensibles4,5. Otro insecto hemipteran, la ACP, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), es una grave plaga de cítricos y transmite la bacteria de la líber-limited (Candidatus Liberibacter asiaticus) causante de Huanglongbing (HLB), mejor conocido como el enverdecimiento de los cítricos la enfermedad6,7. HLB primero fue divulgado del sur de China y se ha extendido a 40 diferentes Asia, África, Oceanía, sur y América del norte países7. Enverdecimiento de los cítricos es un problema mundial con amenaza de pérdidas económicas y financieras debido a la pérdida de la fruta cítrica; por lo tanto, gestión de la ACP se considera de suma importancia para la prevención y control de HLB.
Medidas para el efectivo control de estas plagas de insectos requiere, generalmente, vivió de la aplicación de pesticidas químicos que son relativamente cortos. Estrategias de control insecticida químico a menudo carecen de estrategias de gestión ambiental segura o han disminuido la susceptibilidad debido a la resistencia a plaguicidas en las poblaciones de plagas8,9. Por lo tanto, el control biológico de plagas con bioplaguicidas molecular es una alternativa posible, pero su uso a nivel mundial sigue siendo modesto y varias especies de parasitoides (p. ej., Trisolcus japonicus) también pueden ser eficaces como natural biológica controles. RNAi es un potencial emergente tecnología para la gestión de plagas de insectos invasores con bioplaguicidas molecular10. RNAi es un mecanismo regulador del gen descrito bien que facilita el silenciamiento del gen postranscripcional eficaz de endógeno así como invadir dsRNAs de manera específica de secuencia, que finalmente lleva a la regulación de la expresión génica en el mRNA nivel11,12. Brevemente, cuando dsRNA exógeno es interiorizado en una celda que se procesa en siRNAs por un miembro de la superfamilia Rnasa III de nucleasa bidentados, llamada Dicer, que evolutivamente se conserva en gusanos, moscas, plantas, hongos y mamíferos13, 14 , 15. estos dúplex de 21-25 nucleótidos siRNA es desenrollado e integrado en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) como guía RNAs. Este complejo RISC-RNA permite el emparejamiento de Watson-Crick base para el complementario objetivo mRNA; Esto conduce eventual a escote por el Argonaute proteína, un multi dominio que contiene un Rnasa H-como dominio, que degrada el ARNm correspondientes y reduce la traducción de la proteína, lo lleva a16 el silenciamiento postranscripcional del gen , 17 , 18.
ARNi para manejo de plagas requiere la introducción de dsARN en vivo para silenciar el gen de interés, activando la vía de siRNA. Diversos métodos que se han utilizado para la entrega de dsRNA a insectos y células de los insectos para inducir RNAi sistémica incluyen alimentación10,19, remojo de20,21, microinyección22, portadores tales como liposomas 23y otras técnicas24. RNAi era primer demostrado en Caenorhabditis elegans para silenciar la expresión del gen unc-22 por incendio y Mello25, seguido por la caída en la expresión de los genes encrespados en Drosophila melanogaster26. Estudios funcionales iniciales utilizan microinyección para ofrecer dsARN en insectos, como Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, Halys H.30y los insectos lepidópteros (revisados por Terenius et al. 31). microinyección es ventajoso para entregar una dosis exacta y precisa en el sitio de interés en el insecto. Aunque tales pinchazos sépticos pueden provocar expresión de genes relacionados inmunes debido a trauma32, por lo tanto, descartando su practicidad en el desarrollo agrícola biopesticidas.
Otro método de entrega de dsARN en vivo es por inmersión, que consiste en la ingestión o absorción de dsARN por suspensión de células o animales generalmente en el medio extracelular que contiene dsARN. Remojo se ha utilizado eficientemente inducir RNAi en células de cultivo de tejidos de Drosophila S2 para inhibir Downstream de Raf1 (DSOR1) mitógeno-activada proteína kinasa kinasa (MAPKK)20, así como en C. elegans para silenciar a la POS-1 gen33. Sin embargo, es menos eficiente para inducir RNAi en comparación con microinyección20dsARN entregado mediante remojo. RNAi mediado silenciar en un insecto masticación era primer demostrado en el rootworm occidental del maíz (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) por infundir el dsRNA en un agar artificial dieta10. Informes anteriores han resumido métodos para entregar dsARN infundido en dietas naturales específicas de artrópodos34. Estos métodos de entrega fueron determinados más eficaz comparable a medios artificiales de la entrega; como en el caso de la mosca tsetsé (Glossina morsitans morsitans), donde observó caída igual de un gen relacionado con inmune cuando dsARN fue entregado a través de la harina de sangre o microinyectados35. Del mismo modo, entrega de dsRNA a través de gotitas de luz marrón manzana polilla (postvittana de Epiphyas)36, larvas de polilla del diamondback (xylostella de Plutella)37, así como las abejas de miel38,39 inducida por ARNi eficiente. Más eficaces experimentos de RNAi en hemipteran han utilizado la inyección de dsRNA40 porque entrega oral de dsARN en insectos hemipteran es ardua ya que deben ser entregado a través de los tejidos vasculares de la planta huésped. Arni eficaz también fue observado en ACP y saltahojas de la Chicharrita de alas cristalinas (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsARN fue entregado a través de cítricos y vides que habían absorbido dsARN en los tejidos vasculares a través de la raíz para lavar los ojos, foliar aerosoles, las inyecciones de tronco o absorción por cortes41,42,43,44,45,46. Esto también dio lugar a la primera patente de dsRNA contra el ACP (2016, nos 20170211082 A1). Entrega de siRNA y dsRNA utilizando portadores tales como nanopartículas y liposomas imparte estabilidad y aumentos en la eficacia de dsARN entregados están surgiendo rápidamente23,47,48,49 ,50. Una nueva clase de vehículos de entrega basados en nanopartículas para los ácidos nucleicos para in vitro y en vivo que fue específicamente para aplicaciones terapéuticas pueden impartir inmenso potencial como vectores de entrega adecuado51. Nanopartículas como un vehículo de entrega para el dsRNA pueden tener desventajas incluyendo solubilidad, hidrofobicidad o bioacumulación limitada52, pero una entrega ayudar a polímero adecuado puede compensar estas desventajas. Desarrollo y uso de la entrega de nucleótidos están surgiendo también llamados 'oligonucleótidos antisentidos', que son solo trenzados RNA/DNA dúplex46.
Vitelogénesis en los artrópodos es un proceso de control de reproducción y regulada por la hormona juvenil (JH) o ecdisona, que son los principales inductores de Vg síntesis de la grasa corporal; el Vg se toma finalmente por el ovocito en desarrollo via Vg de endocitosis mediada por receptores53. VG es un grupo de polipéptidos sintetizados extraovarially, que es esencial para el desarrollo de la proteína de yema de huevo grandes, vitelino54,55, y por lo tanto, es importante en la reproducción y envejecimiento56. VG ha sido silenciado con éxito en nematodos57 , así como en miel de abeja (Apis mellifera) donde RNAi mediado agotamiento de Vg se observa en adultos y huevos22. Arni silenciamiento génico postranscripcional mediada del Vg fue probado porque se pensaba que su disminución provocaría un efecto fenotípico observable tales como reduce la fertilidad y la fecundidad, para potencialmente ayudar en el control de BMSB. El gen JHAMT que codifica la S-adenosil-L-metionina (SAM)-dependiente JH ácido O-metiltransferasa, cataliza el paso final de la JH biosíntesis camino58. En esta vía farnesil pirofosfato (FPP) se transforma secuencialmente de farnesol, farnesoic ácido seguido por la conversión de farnesoate metílico a JH por JHAMT. Esta vía se conserva en insectos y artrópodos específicamente para metamorfosis, un proceso de desarrollo está regulado por hormonas59,60,61. De B. mori, expresión de genes JHAMT y la actividad biosintética de JH en la Corpora allata sugieren que la supresión transcripcional del gen JHAMT es crucial para la terminación de JH biosíntesis58. Por lo tanto, los genes JHAMT y Vg se seleccionaron para agotamiento objetivo utilizando RNAi. RNAi también se probó en cítricos para el control de la ACP y GWSS. Árboles de cítricos fueron tratados con el dsRNA mediante aspersión de raíz, tallo tap (las inyecciones de tronco), así como aplicaciones foliares con dsRNAs contra insectos específicos arginina quinasa (AK) transcripciones42,44. La aplicación tópica de dsARN se detectó en las copas de los árboles, indicando una entrega eficiente a través de los tejidos vasculares de las plantas y resultó en aumento de la mortalidad en el ACP y GWSS41,42, 45.
En el estudio actual, hemos identificado un método de entrega de dieta natural para tratamientos como el dsRNA. Esta técnica recién desarrollada fue utilizada posteriormente para silenciar la JHAMT y Vg mRNA usando dsARNs específicos gene en ninfas BMSB como demostrado anterior62. Estos nuevos protocolos de entrega demostrados aquí reemplazan RNA entrega los sistemas convencionales que utilizan aerosoles tópicos o microinyecciones. Verduras y frutas, madre grifo, tierra mojada y absorbentes de la arcilla en pueden utilizarse para la administración de dsRNA, que es fundamental para el desarrollo de la gestión de plagas y patógenos de bioplaguicida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BMSB (H. halys) insects&#160;</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACP (D. citri) insects&#160;</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">organic green beans</td>
			<td style="width:176px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citrus plants</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hypochlorite solution</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">green food coloring&#160;</td>
			<td>McCormick &#38; Co., Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Forma chambers&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magenta vessel (Culture)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers&#160;</td>
			<td style="width:176px;">IDT DNA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SensiMix SYBR</td>
			<td style="width:176px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">qPCR ABI 7500</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spray bottle</td>
			<td style="width:176px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td>American Can Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TaKaRa Ex Taq</td>
			<td style="width:176px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick</td>
			<td style="width:176px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects

Floema y planta sap alimentación insectos invaden la integridad de los cultivos y frutas para recuperar nutrientes, en el proceso de daños en los cultivos de alimentos. Hemipteran insectos representan un número de plagas económicamente importantes de plantas que causan daños a las cosechas al alimentarse de la savia del floema. El marrón apestosa chinche (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) y el psílido asiático de los cítricos (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) son insectos hemipteran introducidos en América del norte, donde se son una plaga invasiva agrícola de alto valor especiales, fila y cultivos básicos y cítricos, así como una plaga de molestia cuando agregan en el interior. Resistencia a los insecticidas en muchas especies ha llevado al desarrollo de métodos alternativos de estrategias de manejo de plagas. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediada por ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo para estudios de genómica funcional que tiene aplicaciones potenciales como una herramienta para la gestión de plagas de insectos el silenciamiento del gen. DsRNA exógeno sintetizada o ARN interferente pequeño (siRNA) puede desencadenar silenciamiento altamente eficiente a través de la degradación de ARN endógeno, que es homólogo al que se presentó. Uso eficaz y ambiental de RNAi como molecular bioplaguicidas para control biológico de insectos hemipteran requiere la entrega en vivo de dsRNAs mediante la alimentación. Aquí demostramos métodos para entrega de dsRNA a insectos: carga de dsARN en judías verdes por inmersión y absorción de dsRNA gene-específico con administración oral a través de la ingestión. También hemos esbozado enfoques de entrega de planta no transgénica mediante aplicaciones foliares, alto flujo de raíz, las inyecciones de tronco, así como gránulos de arcilla, que puede ser esencial para la liberación sostenida de dsRNA. Entrega eficiente de dsARN oral injerida se confirmó como una dosis efectiva para inducir una disminución significativa en la expresión de genes específicos, como la hormona juvenil el ácido O-metiltransferasa (JHAMT) y vitelogenina (Vg). Estos métodos innovadores representan estrategias para la administración de dsRNA a utilizar en la protección de cultivos y superar retos ambientales para el manejo de plagas.

Entrega de verduras dsARN mediada a través de la alimentación en ninfas de instar BMSB 4th fue probada para el desarrollo de bioplaguicidas molecular utilizando RNAi para plagas invasoras. Alimentación de BMSBs con sus estiletes de aguja por un mecanismo conocido como lacerar y enjuague, que causa daños considerables a los cultivos. Ejotes orgánicos delgados, p. vulgaris L., se utilizaron para probar si nutrientes o dsRNA podría ser entregado en vivo en ...

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Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Double-stranded RNA Oral entrega métodos para inducir la interferencia de ARN en floema e insectos Hemipteran alimentación planta de sap

Este artículo muestra nuevas técnicas desarrolladas para la entrega oral de ARN bicatenario (dsRNA) a través de los tejidos vasculares de las plantas para ARN de interferencia (ARNi) en la savia del floema insectos.

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

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