Name: double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects at JoVE.com

Författarna erkänna tacksamt Donald Weber och Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) för att tillhandahålla BMSB och HB för experiment och upprätthålla kolonierna; och Maria T. Gonzalez, Salvador s. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) och Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) för kolonin underhåll, provpreparering och analyser.

1. BMSB uppfödning
<ol><li>Bakre BMSB insekter enligt standard lab praxis och tidigare beskrivna63.</li>
	<li>Höja ACP (D. citri) insekter på Citrus macrophylla i ett växthus (22 ° C) och naturligt ljus. Användning vuxen AVS, på cirka 5-7 dagar efter eclosion.</li>
</ol>2. Val av genen regioner och In Vitro syntes av dsRNA
<ol><li>Välj specifika gener till BMSB från tidigare publicerade transkriptom profiler32....

RNAi har visat sig vara ett viktigt verktyg för att utforska genen biologisk funktion och reglering, med stor potential att utnyttjas för hantering av skadeinsekter19,68,69,70, 71. konstruktion och val av en lämplig gene(s) för ljuddämpning i en given insektsarter och metoden för leverans av de motsvarande dsRNA(s) till insekten är båda av yttersta vi...

Ditropis insekter utgör några av de ekonomiskt mest betydande skadedjur av agriculturebecause förmåga att uppnå förhöjda befolkningstillväxt och sprida sjukdomar i växter. BMSB, H. halys Stål, är en invasiv skadegörare som introducerades av misstag i den västra halvklotet i Allentown, Pennsylvania från Asien (Kina, Taiwan, Korea och Japan) med den första iakttagelsen rapporterade i 19961. Sedan introduktionen, BMSB har upptäckts i 43 stater, med den högsta befolkningen i mitten av Atlanten (DE, MD, PA, NJ, VA, och WV) samt i Kanada och Europa, och utgör ett potentiellt hot mot jordbruket2. Som en källor pest, kan BMSB anstiftar skador på cirka 300 identifierade växten varar värd inklusive värdefulla grödor såsom äpplen, druvor, prydnadsväxter, utsädesgrödorna, sojabönor och majs. Skador orsakas främst på grund av utfodring känd som text och färgdrag där djuret genomborrar värd grödan med dess nål-liknande mandrängen få tillgång till näringsämnen från kärlvävnader2,3. BMSB är också en inomhus skadegörare som de kan hitta residence i levande områden såsom skolor och hus under hösten och vintern2. Kemikalier och luftburna allergener släppt av BMSB rapporterades till olaglig allergisk reaktion i frukt gröda arbetstagare. BMSB kan också bidra till allergisk sjukdom leder till kontakteksem, konjunktivit och rinit hos känsliga individer4,5. En annan Ditropis insekt, den ACP, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) är en allvarlig skadegörare av citrusfrukter och överför phloem-begränsad bakterierna (Candidatus Liberibacter asiaticus) orsakar Huanglongbing (HLB), mer känd som citrus grönare sjukdom6,7. HLB rapporterades först från södra Kina och har spridit sig till 40 olika asiatiska, afrikanska, Oceanien, Syd och nordamerikanska länder7. Citrus grönare är ett världsomfattande problem med hotande ekonomiska och finansiella förluster på grund av citrusfrukter förlust; management av AVS-betraktas därför av yttersta vikt att förebygga och kontrollera HLB.
Åtgärder för effektiv kontroll av dessa skadeinsekter kräver oftast tillämpningen av kemiska bekämpningsmedel som är relativt korta bodde. Kemiska insektsmedel kontrollstrategier ofta saknar säker miljöledning strategier eller minskat känslighet på grund av bekämpningsmedel motstånd i pest populationer8,9. Därför den biologisk bekämpning av skadedjur med molekylär biopesticides ett potentiellt alternativ, men dess användning globalt sett fortfarande blygsam, och olika arter av parasiter (t.ex., Trisolcus japonicus) kan också vara effektivt som naturliga biologiska kontroller. RNAi är en potentiell ny teknik för att hantera invasiva skadeinsekter med molekylär biopesticides10. RNAi är en väl beskrivna gen reglerande mekanism som underlättar den effektiva postttransskriptionell nedtystning av endogena samt invaderar dsRNAs i en sekvens-specifika sätt, som så småningom leder till reglering av genuttryck på mRNA nivå11,12. Kort, när exogena dsRNA är internaliserad i en cell det bearbetas till siRNAs av en medlem av bidentate nuclease RNase III superfamiljen, kallas Dicer, som är evolutionärt bevarad i worms, flugor, växter, svampar och däggdjur13, 14 , 15. dessa 21-25 nukleotid siRNA duplex sedan utrullad och integrerade i RNA-inducerad ljuddämpningssystemet komplex (RISC) som guide RNAs. Detta RISC-RNA komplex tillåter Watson-Crick bas ihopkoppling att kompletterande rikta mRNA; Detta leder så småningom till klyvning av proteinet Argonaute, en multi-domän protein som innehåller en RNase H-liknande domän, vilket försämrar motsvarande mRNA och minskar protein översättning, vilket ledde till postttransskriptionell nedtystning16 , 17 , 18.
RNAi för växtskydd kräver införandet av dsRNA i vivo att tysta gen av intresse, att därmed aktiveras siRNA smittvägen. Olika metoder som har använts för dsRNA leverans till insekter och insekt celler för att inducera systemisk RNAi bland utfodring10,19, blötläggning20,21, Mikroskop22, transportörer såsom liposomer 23, och andra tekniker24. RNAi var första i Caenorhabditis elegans visat att tysta unc-22 genuttryck genom eld och Mello25, följt av knockdown i uttryck av frizzled generna i Drosophila melanogaster26. Inledande funktionella studier används Mikroskop för att leverera dsRNA i insekter, såsom Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, H. halys30och fjärilsarter insekter (Recenserad av Terenius o.a. 31). Mikroskop är fördelaktigt att leverera en korrekt och exakt dos till platsen av intresse i insekten. Om än sådana septisk punkteringar kan framkalla immuna relaterade genuttryck på grund av trauma32, därför utesluta dess praktiska jordbruket biopesticides utveckling.
En annan metod för att leverera dsRNA i vivo är genom blötläggning, som innebär intag eller absorption av dsRNA genom upphörande av djur eller celler generellt i extracellulär medium innehållande dsRNA. Blötläggning har använts effektivt inducera RNAi i Drosophila S2 vävnadsodling celler att hämma Downstream-av-Raf1 (DSOR1) mitogen-aktiverat protein kinase kinase (MAPKK)20samt i C. elegans att tysta POS-1 gen33. DsRNA levereras med hjälp av blötläggning är dock mindre effektiva att inducera RNAi jämfört med Mikroskop20. RNAi medierad tysta i en tugga insekt visades först i den västra havren rootworm (VCT) (Diabrotica virgifera virgifera) genom infusion av dsRNA in en konstgjord agar kost10. Tidigare rapporter har sammanfattat metoder för att leverera dsRNA infunderas i naturliga Dieter specifika för leddjur34. Dessa leveransmetoder fastställdes vidare att vara comparably effektiva att konstgjorda medel för leverans; såsom fallet av tsetseflugan (Glossina morsitans morsitans), där lika överväldigande av en immunrelaterade gen observerades när dsRNA levererades antingen genom blodmjöl eller microinjected35. Likaså, leverans av dsRNA via droppar i ljus brunt apple moth (Epiphyas postvittana)36, diamondback moth (Plutella xylostella) larver37, samt honung bin38,39 inducerad effektiv RNAi. Mest effektiva RNAi experiment i Ditropis har utnyttjat injektion av dsRNA40 eftersom muntliga leverans av dsRNA i Ditropis insekter är svåra eftersom det måste levereras genom värdväxts kärlvävnader. Effektiv RNAi observerades också i AVS-länderna och glasartade bevingade sharpshooter dvärgstritar (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA levererades genom citrus och vinrankor som hade absorberas dsRNA in vaskulära vävnader genom roten drench, blad sprayer, stammen injektioner eller absorption av sticklingar41,42,43,44,45,46. Detta resulterade också i det första patentet för dsRNA mot AVS-länderna (2016, oss 20170211082 A1). Leverans av siRNA och dsRNA använder bärare såsom nanopartiklar och liposomer förmedlar stabilitet, och ökningar av levererade dsRNA effekten framväxande snabbt23,47,48,49 ,50. En ny klass av nanopartiklar-baserade leveransfordon för nucleic syror för in vitro- och in-vivo som var sammanfattat speciellt för terapeutiska tillämpningar kan ge enorm potential som lämplig leverans vektorer51. Nanopartiklar som en leveransfordon för dsRNA kan ha nackdelar inklusive löslighet, vattenavvisande egenskaper eller begränsad bioackumulering52, men en lämplig polymer medhjälp leverans kan kompensera dessa nackdelar. Utveckling och användning av att själv leverera nukleotider framträder också kallas 'antisense oligonukleotider', som är enda stranded RNA/DNA duplex46.
Vitellogenesis i leddjur är en viktig process kontrollerande reproduktion och reglerade av juvenile hormon (JH) eller ecdysone, som är de viktigaste inducerare av Vg syntes av kroppsfett; Vg tas så småningom upp av den framkallande äggcellen via Vg receptor medierad endocytos53. VG är en grupp av polypeptider syntetiseras extraovarially, vilket är nödvändigt för utveckling av stora ägg äggula protein, vitellin54,55, och därför är det viktigt i reproduktion och åldrande56. VG har tystats framgångsrikt i nematoder57 samt i honungsbiet (Apis mellifera) där RNAi medierad utarmning av Vg observerades hos vuxna och ägg22. RNAi medierad postttransskriptionell nedtystning VG testades eftersom trodde dess utarmning skulle leda till en observerbar fenotypiska effekt såsom minskad fertilitet och fruktsamhet, till potentiellt stöd i BMSB kontroll. Den JHAMT genen som kodar den S-adenosyl-L-metionin (SAM)-beroende JH syra O-metyltransferas, katalyserar det sista steget av JH biosyntes vägen58. I denna väg farnesyl omvandlas pyrofosfat (FPP) sekventiellt från farnesol, till farnesoic syra följd av konvertering av metyl farnesoate till JH av JHAMT. Denna väg är bevarad i insekter och leddjur specifikt för metamorfos, en process som regleras utvecklingsmässigt hormoner59,60,61. I B. moriföreslår JHAMT genuttryck och JH biosyntetiska aktiviteten i de korpusar allata att transkriptionell undertryckandet av den JHAMT genen är avgörande för uppsägning av JH biosyntes58. Därför valdes JHAMT och Vg generna för riktade utarmning med hjälp av RNAi. RNAi testades också i citrus träd för kontroll av AVS-länderna och GWSS. Citrusträd behandlades med dsRNA genom roten drench, hejda tap (stammen injektioner), samt foliar sprayer med dsRNAs mot insekt specifika arginin kinase (AK) avskrifter42,44. Den lokal applicering av dsRNA upptäcktes över tak av citrusträd, som anger effektiv leverans genom växter vaskulära vävnaderna och resulterade i ökad dödlighet i AVS-länderna och GWSS41,42, 45.
I den aktuella studien har vi identifierat en naturlig kost leveransmetod för behandlingar såsom dsRNA. Denna nyutvecklade teknik användes därefter för ljuddämpning av JHAMT och Vg mRNA med gen specifika dsRNAs i BMSB nymfer som visat tidigare62. Dessa nya leverans protokoll visat här ersätter konventionella RNA leveranssystem som använder aktuell sprayer eller microinjections. Grönsaker och frukter, stem tap, jord dränkte och lera absorbenter i kan användas för leverans av dsRNA, vilket är avgörande för fortsatt utveckling av biopesticide pest och patogen management.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BMSB (H. halys) insects&#160;</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACP (D. citri) insects&#160;</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">organic green beans</td>
			<td style="width:176px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citrus plants</td>
			<td style="width:176px;">USDA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hypochlorite solution</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">green food coloring&#160;</td>
			<td>McCormick &#38; Co., Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Forma chambers&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magenta vessel (Culture)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers&#160;</td>
			<td style="width:176px;">IDT DNA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SensiMix SYBR</td>
			<td style="width:176px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">qPCR ABI 7500</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spray bottle</td>
			<td style="width:176px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td>American Can Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TaKaRa Ex Taq</td>
			<td style="width:176px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick</td>
			<td style="width:176px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects

Phloem och växt sap utfodring insekter invadera integritet grödor och frukter att hämta näringsämnen, i den process som skadar livsmedelsgrödor. Ditropis insekter konto för ett antal ekonomiskt betydande skadedjur av växter som orsakar skada på grödor genom att mata på phloem sap. Bärfisen brun marmorated (BMSB), Halyomorpha halys (halvvingar: Zicrona) och den asiatiska citrus psyllid (AVS), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) är Ditropis skadeinsekter införs i Nordamerika, där de är en invasiv jordbruks skadegörare av högt värde specialitet, rad, och häfta grödor och citrusfrukter, liksom en olägenhet pest när de samlade inomhus. Insektsmedel motstånd hos många arter har lett till utvecklingen av alternativa metoder för skadedjursbekämpning förvaltningsstrategier. Dubbelsträngat RNA (dsRNA)-medierad RNA-interferens (RNAi) är en nedtystning mekanism för funktionella genetiska studier som har potentiella tillämpningar som ett verktyg för hantering av skadeinsekter. Exogent syntetiserade dsRNA eller små störande RNA (siRNA) kan utlösa högeffektiva nedtystning genom nedbrytning av endogena RNA, som är homolog till att presenteras. Effektiv och miljömässig användning av RNAi som molekylär biopesticides för Agrilus Ditropis insekter kräver i vivo leveransen av dsRNAs genom utfodring. Här visar vi metoder för leverans av dsRNA till insekter: lastning av dsRNA till gröna bönor genom nedsänkning och absorberande av gen-specifika dsRNA med muntliga leverans genom förtäring. Vi har också beskrivit icke-transgena växter leverans metoder använder foliar sprayer, roten drench, stammen injektioner samt lergranulat, alla kan vara avgörande för frisättningen av dsRNA. Effektiv leverans av oralt intagna dsRNA bekräftades som en effektiv dosering att inducera en betydande minskning i uttryck av riktade gener, såsom juvenil hormon syra O-metyltransferas (JHAMT) och vitellogenin (Vg). Dessa innovativa metoder representerar strategier för leverans av dsRNA att använda i växtskydd och övervinna miljömässiga utmaningar för växtskydd.

Vegetabiliska medierad dsRNA leverans genom utfodring i BMSB 4th instar nymfer testades för utveckling av molekylära biopesticides med hjälp av RNAi för invasiv skadeinsekter. BMSBs foder med sin nål-liknande stylets genom en mekanism som kallas lacerate och spola, som orsakar betydande skador på grödor. Slanka ekologiska gröna bönor, P. vulgaris L., användes för att testa om näringsämnen eller dsRNA kunde levereras i vivo till BMSB genom utfodrin...

Watch this Scientific Journal Video about Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects at JoVE.com

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Dubbelsträngat RNA Oral leveransmetoder att framkalla RNA-interferens i floem och växt-sap-utfodring Ditropis insekter

Denna artikel visar nya tekniker utvecklas för muntliga leverans av dubbelsträngat RNA (dsRNA) genom vaskulära vävnader av växter för RNA-interferens (RNAi) i floem sap utfodring insekter.

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Research

JoVE Journal

Environment

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimera Rökgas inställningar för att främja Mikroalger Tillväxten i Photobioreactors via datorsimuleringar

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

En ny ansökan av elektriska penetration Graph (EPG) för att förvärva och mäta elektriska signaler i floem sikt Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Samtidig DNA-RNA-extraktion från kustsediment och kvantifiering av 16S rRNA gener och transkript av Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Metoder för mark Omsampling att övervaka förändringar i de kemiska koncentrationer av skogsmark

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

Data Processing metoder för 3D seismik avbildning av markytan vulkaner: program till den Tarim översvämning basalten

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Metod för att utveckla liv tabeller för fastsittande insekter i fält med hjälp av mjöllus, Bemisia tabaci, i bomull som ett modellsystem

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Experimental Methods of Dust Charging and Mobilization on Surfaces with Exposure to Ultraviolet Radiation or Plasmas

Experimentella metoder av damm laddning och mobilisering på ytor med exponering för ultraviolett strålning eller plasmor

Electrostatic dust transport has been hypothesized to explain a number of observations of unusual planetary phenomena. Here, it is demonstrated using ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Skörda Venom gifter från Assassin buggar och andra Heteropteran insekter

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Sammansättning och Distribution analys av bioaerosoler Under olika miljöförhållanden

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Blad areal index uppskattning med hjälp av tre distinkta metoder i rena lövfällande bestånd

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...