Name: adaptation of microelectrode array technology for the study of anesthesia-induced neurotoxicity in the intact piglet brain
Uploaded: 2018-05-12T14:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende bidragene fra University of Kentucky Center for mikroelektrode teknologi (CenMeT), og den Ohio State University laboratorium dyr ressource Center (CIRKULÆR).

Smågrise (Sus scrofa) er modtaget gennem en lokal gård forhåndsgodkendt af The Ohio State University (OSU) institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC). Efter godkendelse af protokollen, animalsk eksperimenter er udført i overensstemmelse med IACUC politik.
1. smågrise og Grisling håndtering
<ol><li>Udnytte mandlige og kvindelige smågrise i en systematisk og randomiseret måde at eliminere alle potentielle sex-baserede konfoundere efter ANKOMME retningslinjer19. Bemærk: Siden perioden af maksimal hjernens vækst er inden for 3-5 dage for Grisling fødsel, gøres forsøg udelukkende med smågrise 3-5 dage gammel.</li>
	<li>Sikre smågrise ankommer i vivarium mindst 24 timer før eksperimenter til at tillade akklimatisering til miljøet. Bemærk: Uddannet veterinær personale giver rutinemæssige pasning af dyr. Pattegrisene holdes i individuelt vedligeholdes af temperatur, løbende overvåget bure og modtage en ernæringsmæssigt komplet mælk mælkeerstatning ad libitum for at undgå hypoglykæmi. Pattegrisene holdes også uden mælk udskiftning (nul per os), i mindst 3 timer før anæstesi og leveres med tæpper og legetøj at sikre normale niveauer af stimulation. Hvis det er muligt, holde flere pattegrise i samme bur at tillade socialisering.</li>
</ol>2. udvikling og tilpasning af multilaterale miljøaftaler for AIN undersøgelser i en Grisling Model
Bemærk: Denne teknologi bruger enzym-baserede miljøaftaler, overfladebelagt med enzymet og galvaniseret med m-phenylendiamin dihydrochlorid (mPD). Elektroderne var skik, konstrueret med en 40-mm stive skaft og fremstillet til brug i smågrise (figur 1).
<ol><li>For at undgå afskedigelser, se venligst den detaljerede beskrivelse af MEA forberedelse og kalibrering som tidligere beskrevet15 (figur 2).</li>
</ol>3. anæstesi og brug af brugerdefinerede stereotaxisk apparatur til Grisling
<ol><li>Bedøver dyr ved hjælp af en anæstesi arbejdsstation med en passende ventilator og overvågning enheder og overvågning af fysiologiske parametre såsom pulsoximetri, non-invasiv blodtryk, Elektrokardiografi og temperatur i hele den helhed af eksperimentet som tidligere beskrevet19. Intubate og ventilere smågrise og administrere Sevofluran anæstesi på 1 minimum alveolær koncentration (MAC) (ca. 2,5-3%) til 3,5 h. sikre, at uddannede Bioanalytikere medlemmer er til stede for disse eksperimenter. Fur overliggende området kirurgisk fjernes ved hjælp af elektrisk trimming forud for udarbejdelsen af huden. Bemærk: Koncentrationen og varighed af anæstesi anvendes tillader eksperiment at simulere tidslængde af faktiske anæstesi eksponering under en kirurgisk procedure. Derudover er Sevofluran mest almindeligt udnyttet narkose i den pædiatriske befolkning gør undersøgelsen omkring sikkerheden af allerstørste betydning.</li>
	<li>Før placering i stereotaxisk rammen, starte en rocuronium lastning dosis på 2,5 mg/kg og en infusion af 1,5 mg/kg/h at forhindre dyrs bevægelse mens sikret i rammen.<ol>
<li>Sted Grisling i Grisling-specifikke stereotaxisk ramme, når en tilstrækkelig dybde af anæstesi er bekræftet af tå-knivspids.</li>
		<li>Give tilstrækkelig polstring i stereotaxisk rammen ved at placere pattegris på et tvunget luft opvarmning pad med ekstra polstring (fx, fluidiserede positioner) at forhindre tryksår.</li>
		<li>Placer tænderne af overnæbbet over tanden bar (figur 3). Bemærk: Baren tand skal være på et tilstrækkeligt niveau til at holde kraniet meget forsvarligt på plads.</li>
		<li>Rette og spænd de gennemtrængende øre barer inden for ørerne, at tage sig til at sikre, at Grisling er i positionen midterlinjen. Holdning de spidse tips af lateralt holder i øregangen og Indsæt øret stænger fast nok til at høre "pop" lyden forbundet med udbredelsen af trommehinden. Fast tillægger kraniet øre barer og indsætte til samme dybde på hver side for at forhindre bevægelse af kraniet under eksperimentet (figur 4bedømmelseskomite A). Bemærk: Det er meget vigtigt at holde Grisling varm (~ 37,8-38,6 ° C) og løbende overvåge temperaturen under hele proceduren for vedligeholdelse af normothermia. Dette kan være dygtig via et tæppe og/eller en varmelampe. Sørg for at anbringe varme lampen i en passende afstand til at undgå afbrænding af dyrets hud.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oprette en 4-6 cm midterlinjen indsnit langs kraniet med forsigtighed for at undgå scoring i kraniet med en skalpel. Når snittet er lavet, bruger blid retraktion og stumpe dissektion for at ophøje hovedbunden fra kraniet. Forsigtigt krat kranium med en gauze afrivningsblok hen til fjerne enhver bindevæv og udsætte suturen linjer (figur 4bedømmelseskomite B). Bemærk: Det er ikke nødvendigt at bevare steriliteten under ikke-overlevelse eksperimenter. Sterilitet skal imidlertid opretholdes under overlevelse eksperimenter.</li>
	<li>Yderligere afspejle hovedbunden, hvis det er nødvendigt, at afdække området af interesse og bestemme den tiltænkte placering for kraniotomi (figur 5bedømmelseskomite A). Bruge en kirurgisk boremaskine til at skabe et kraniotomi vindue af cirka 0,25 cm2 (kan være større eller mindre afhængig af eksperimentelle mål) overliggende struktur af interesse, ved hjælp af forsigtighed ikke for at såre dura eller den underliggende hjernen (figur 5 , Bedømmelseskomite B). Brug fine kirurgisk saks til punktafgifter dura overliggende hjernevæv (figur 5bedømmelseskomite C).</li>
	<li>Placer elektroden så lodret som muligt over bregma ved at sikre den metal arm af headstage til micromanipulator af Grisling stereotax. Lavere elektroden så meget som muligt uden at berøre overfladen af kraniet. Registrere koordinaterne for bregma (figur 6bedømmelseskomite A).<ol>
<li>Bestemme anterior-posterior og medial-lateral koordinater samt dybden af strukturen af interesse, som de vedrører bregma. Bestemme de stereotaxisk koordinater ved hjælp af en art og alder-passende stereotaxisk atlas. I dette tilfælde bruge en stereotaxisk atlas udviklet specielt til smågrise20.</li>
		<li>Flytte elektroden, således at det har den rigtige anterior-posterior og medial-lateral placering, sikre, at både mikroelektrode og apparatet er vinkelret på overfladen. Sted pseudo-referenceelektrode under hovedbunden, sikre kontakt med dyr (figur 6bedømmelseskomite B).</li>
		<li>Langsomt og forsigtigt, lavere elektrode til den passende dybde ind i hjernen, ved hjælp af stereotaxisk armen. For de sidste 2 mm, skal du bruge en hydraulisk microdrive til yderligere drev elektrode til den nøjagtige placering (figur 6bedømmelseskomite C). Bemærk: Den elektrode holdning bør ligger vinduet kraniotomi. Elektrode dybde varierer afhængigt af hjernens struktur af interesse. Det er ikke nødvendigt at lukke snit efter afslutningen af dataindsamlingen i ikke-overlevelse eksperimenter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. måling af ekstracellulære glutamat Under Sevofluran anæstesi
<ol><li>Sikre Grisling er under løbende fysiologisk overvågning overalt i hele denne procedure. Smågrise er bedøvede inhalationally (via ansigt kegle) som forberedelse til proceduren.</li>
	<li>Efter implantation af MEA, skal du vente 30 min at tillade elektrode at nå baseline for at sikre, at korrekte målinger vil blive opnået for 3 h (figur 7).</li>
	<li>0,25% bupivacaine (1 mL/kg) administreres subkutant i stedet for kirurgi til postoperativ smertebehandling. Derudover er vedvarende-release buprenorphin givet subkutant q72h efter behov.</li>
</ol>5. perfusion og offer
<ol><li>Udføre perfusion og hjernen væv samling procedurer som tidligere beskrevet21. For ikke-overlevelse operationer, er dyr aflives straks efter eksperimenter mens stadig under fuld narkose.</li>
	<li>Tag brutto tværsnit af hjernen, faste Grisling og bruge lysmikroskopi for at visualisere spor af elektrode som tidligere beskrevet22 at tillade kontrol af MEA placering, at sikre korrekt placering i området af interesse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hall, M. J., DeFrances, C. J., Williams, S. N., Golosinskiy, A., Schwartzman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+hospital+discharge+Survey:+2007+summary.">National hospital discharge Survey: 2007 summary.</a> Natl Health Stat Report. (29), 1-24 (2010).</li><li>Ikonomidou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+NMDA+receptors+and+apoptotic+neurodegeneration+in+the+developing+brain.">Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain.</a> Science. 283 (5398), 70-74 (1999).</li><li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+neurotrophic+factors+in+neuronal+plasticity+and+disease.">Glutamate and neurotrophic factors in neuronal plasticity and disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1144 (1), 97-112 (2008).</li><li>Atlante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+neurotoxicity,+oxidative+stress+and+mitochondria.">Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria.</a> FEBS Lett. 497 (1), 1-5 (2001).</li><li>Kavitha, J., Durga, P., Ramachandran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhalational+agents+in+anesthesia+induced+developmental+neurotoxicity+-+Recent+advances.">Inhalational agents in anesthesia induced developmental neurotoxicity - Recent advances.</a> Trends in Anaesthesia and Critical Care. 11 (1), 14-18 (2016).</li><li>Zanghi, C. N., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+holistic+approach+to+anesthesia-induced+neurotoxicity+and+its+implications+for+future+mechanistic+studies.">A holistic approach to anesthesia-induced neurotoxicity and its implications for future mechanistic studies.</a> Neurotoxicol Teratol. 60 (2), 24-32 (2017).</li><li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+real-time+monitoring+of+glutamate+and+electrophysiology+from+cortex+to+hippocampus+in+mice+based+on+a+microelectrode+array.">In situ real-time monitoring of glutamate and electrophysiology from cortex to hippocampus in mice based on a microelectrode array.</a> Sensors (Basel). 17 (1), 1-8 (2016).</li><li>Hinzman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+brain+injury+elevates+tonic+glutamate+levels+and+potassium-evoked+glutamate+release+in+discrete+brain+regions+at+two+days+post-injury:+an+enzyme-based+microelectrode+array+study.">Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study.</a> J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).</li><li>Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Str&#246;mberg, I., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+second-by-second+measures+of+L-glutamate+in+the+central+nervous+system+of+freely+moving+rats.">Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats.</a> J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).</li><li>Benveniste, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microdialysis.">Brain microdialysis.</a> J Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).</li><li>Kohno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+detection+of+changes+in+brain+extracellular+glutamate+levels.">An improved method for the detection of changes in brain extracellular glutamate levels.</a> J Neurosci Methods. 81 (1-2), 199-205 (1998).</li><li>Hascup, K. N., Hascup, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+techniques+for+subsecond+neurotransmitter+detection+in+live+rodents.">Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents.</a> Comp Med. 64 (4), 249-255 (2014).</li><li>Rooij, N. F., Koudelka-Hep, M., Frey, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+microprobe+array+for+in+vivo+monitoring+of+neurotransmitters.">Biosensor microprobe array for in vivo monitoring of neurotransmitters.</a> EPFL. , (2010).</li><li>Fan, X. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+glutamate+levels+decrease+in+a+non-human+primate+model+of+dopamine+deficiency.">Cortical glutamate levels decrease in a non-human primate model of dopamine deficiency.</a> Brain Res. 1552, 34-40 (2014).</li><li>Hunsberger, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+enzyme-based+biosensors+to+measure+tonic+and+phasic+glutamate+in+Alzheimer's+mouse+models.">Using enzyme-based biosensors to measure tonic and phasic glutamate in Alzheimer's mouse models.</a> J Vis Exp. (123), (2017).</li><li>Hill, A. J., Jones, N. A., Williams, C. M., Stephens, G. J., Whalley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+multi-electrode+array+screening+for+anticonvulsants+in+acute+rat+brain+slices.">Development of multi-electrode array screening for anticonvulsants in acute rat brain slices.</a> J Neurosci Methods. 185 (2), 246-256 (2010).</li><li>Defranchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+assessment+of+micro-electrode+chip+assay+as+a+method+of+detecting+neurotoxicity+in+vitro.">Feasibility assessment of micro-electrode chip assay as a method of detecting neurotoxicity in vitro.</a> Front Neuroeng. 4 (6), (2011).</li><li>Whitaker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+piglet+model+for+the+study+of+anesthetic-induced+developmental+neurotoxicity+(AIDN):+A+translational+neuroscience+approach.">Use of a piglet model for the study of anesthetic-induced developmental neurotoxicity (AIDN): A translational neuroscience approach.</a> J Vis Exp. (124), (2017).</li><li>Kilkenny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).</li><li>Salinas-Zeballos, M., Ceballos, G., Gootman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the developing swine (Sus scrofa) forebrain. , 887-906 (1986).</li><li>Whitaker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+clinically+relevant+use+of+a+piglet+model+to+study+the+effects+of+anesthetics+on+the+developing+brain.">A novel, clinically relevant use of a piglet model to study the effects of anesthetics on the developing brain.</a> Clin Transl Med. 5 (1), (2016).</li><li>Hascup, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+of+the+effects+of+chronic+implantation+of+ceramic-based+microelectrode+arrays+and+microdialysis+probes+in+rat+prefrontal+cortex.">Histological studies of the effects of chronic implantation of ceramic-based microelectrode arrays and microdialysis probes in rat prefrontal cortex.</a> Brain Res. , 12-20 (2009).</li><li>Hascup, K. N., Hascup, E. R., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-by-second+measures+of+L-Glutamate+and+other+neurotransmitters+using+enzyme-based+microelectrode+arrays.">Second-by-second measures of L-Glutamate and other neurotransmitters using enzyme-based microelectrode arrays.</a> The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 324 (2), 725-731 (2008).</li><li>Rice, M. E., Cragg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+spillover+after+quantal+release:+rethinking+dopamine+transmission+in+the+nigrostriatal+pathway.">Dopamine spillover after quantal release: rethinking dopamine transmission in the nigrostriatal pathway.</a> Brain Res Rev. 58 (2), 303-313 (2008).</li><li>Hascup, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microelectrode+measurements+and+the+origin+and+regulation+of+extracellular+glutamate+in+rat+prefrontal+cortex.">Rapid microelectrode measurements and the origin and regulation of extracellular glutamate in rat prefrontal cortex.</a> Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1608-1620 (2010).</li><li>Miele, M., Boutelle, M. G., Fillenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+source+of+physiologically+stimulated+glutamate+efflux+from+the+striatum+of+conscious+rats.">The source of physiologically stimulated glutamate efflux from the striatum of conscious rats.</a> J Physiol. 497 (Pt 3), 745-751 (1996).</li><li>Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+array+studies+of+basal+and+potassium-evoked+release+of+L-glutamate+in+the+anesthetized+rat+brain.">Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain.</a> J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).</li><li>Quintero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amperometric+measures+of+age-related+changes+in+glutamate+regulation+in+the+cortex+of+rhesus+monkeys.">Amperometric measures of age-related changes in glutamate regulation in the cortex of rhesus monkeys.</a> Exp Neurol. 208 (2), 238-246 (2007).</li><li>Stephens, M. L., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+glutamate+measurements+in+the+putamen+of+awake+rhesus+monkeys+using+an+enzyme-based+human+microelectrode+array+prototype.">Real-time glutamate measurements in the putamen of awake rhesus monkeys using an enzyme-based human microelectrode array prototype.</a> J Neurosci Methods. 185 (2), 264-272 (2010).</li><li>Kodama, T., Hikosaka, K., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+changes+in+glutamate+concentration+in+the+primate+prefrontal+cortex+during+spatial+delayed+alternation+and+sensory-guided+tasks.">Differential changes in glutamate concentration in the primate prefrontal cortex during spatial delayed alternation and sensory-guided tasks.</a> Exp Brain Res. 145 (2), 133-141 (2002).</li><li>Galvan, A., Smith, Y., Wichmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+intracerebral+glutamate+levels+in+awake+monkeys+using+microdialysis+and+enzyme+fluorometric+detection.">Continuous monitoring of intracerebral glutamate levels in awake monkeys using microdialysis and enzyme fluorometric detection.</a> J Neurosci Methods. 126 (2), 175-185 (2003).</li><li>During, M. J., Spencer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+hippocampal+glutamate+and+spontaneous+seizure+in+the+conscious+human+brain.">Extracellular hippocampal glutamate and spontaneous seizure in the conscious human brain.</a> Lancet. 341 (8861), 1607-1610 (1993).</li><li>Reinstrup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+microdialysis+in+clinical+practice:+baseline+values+for+chemical+markers+during+wakefulness,+anesthesia,+and+neurosurgery.">Intracerebral microdialysis in clinical practice: baseline values for chemical markers during wakefulness, anesthesia, and neurosurgery.</a> Neurosurgery. 47 (3), 701-710 (2000).</li><li>Cavus, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+metabolites+in+the+cortex+and+hippocampus+of+epileptic+patients.">Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients.</a> Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).</li></ol>

Greg Gerhardt er den vigtigste ejer af Quanteon LLC. Jorge Quintero og Jason Burmeister har fungeret som konsulenter til Quanteon LLC.

Fra starten af eksperimentet, skal Grislings fysiologiske homeostase vedligeholdes som beskrevet i denne lab forudgående offentliggørelse21. Minimal overvågningen bør omfatte pulsoximetri, Elektrokardiografi, capnography, non-invasiv blodtryk og temperatur. Uddannet efterforskere er påkrævet, så fysiologiske forstyrrelser (fx, hypo/hypertermi, hypoxi, hypotension, arytmi) kan korrigeres ordentligt.
Før induktion udføres in vitro- MEA kalibreringer for at etablere funktionalitet og selektivitet af MEA kendte betingelser. Kalibrering og klædningen af multilaterale miljøaftaler er kritisk for effektiv brug af teknologi. Der er mange potentielle fejl, der kan opstå under kalibreringen. Kalibreringen kan identificere disse spørgsmål samt forkert plating, hvilket fører til forkert interferent svar. En mere detaljeret tabelformat højde for fejl, der kan opstå i forbindelse med MEA er blevet kompileret, langs med bemærkelsesværdige årsager og forslag til løsninger, som skal bevise et nyttigt instrument for sandsynligt fejlfinding (tabel 1). Det er vigtigt at bemærke, skal checkes for tilstedeværelsen af luftbobler eller hvid misfarvning, før både kalibrering og plating, glas-referenceelektrode som enten vil negativt påvirke MEA funktion og optagelse nøjagtighed.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Symptom</td>
			<td>Årsag</td>
			<td>Afhjælpende foranstaltninger</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Intet Signal</td>
			<td>Elektrode ikke tilsluttet</td>
			<td>Korrekt forbinde elektrode til headstage og headstage til hurtig amperometry system.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ingen strøm til hurtig amperometry system</td>
			<td>Slå afbryderen på bagsiden af hurtige system</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Signal støj</td>
			<td rowspan="2">Elektrode forurenet med blod</td>
			<td>Løbende overrisle hjernen overfladen under elektrode indsættelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>Skyl elektrode straks i dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzym belægning er løs</td>
			<td>Ren og recoat elektrode</td>
		</tr>
<tr>
<td>Referenceelektrode blev ikke indsat eller belagt</td>
			<td>Pels og placere referenceelektrode længere under hovedbunden</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elektrode er opdage bevægelse af hjernen overflade</td>
			<td>Forekommer normalt i overfladiske strukturer. Indsæt elektrode dybere (1 mm ad gangen) hvis det er muligt</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Dyrs bevægelse</td>
			<td>Dyret er utilstrækkeligt sikrede</td>
			<td>Flytte dyret i den posteriore retning til bedre sikre earbars på kraniet. Hvis det er nødvendigt, ophøje torso at give mulighed for bedre krop justering.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dyret er utilstrækkeligt bedøvede</td>
			<td>Kontrollere integriteten af det bedøvende udstyr. Titreres anæstesi til en effektiv dosis og administrere en intramuskulær rocuronium dosis (5 mg/kg)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Unøjagtige elektrode placering</td>
			<td>Elektrode ikke er justeret korrekt</td>
			<td>Justere elektroden samtidig opretholde ordentlig tilslutning til headstage.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Stereotaxisk koordinater er urigtige</td>
			<td>Sikre, at Grisling atlas der refereres til ikke anvender et andet referencepunkt eller fly af justering.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pas på ikke at sløre sutur mærker ved at score kraniet.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: instruktioner til fejlfinding MEA brug i smågrise. Mulige årsager og korrigerende foranstaltninger til at bistå med optimering og fejlfinding.
Et stereotaxisk atlas for Grisling bruges til at bestemme området af interesse med hensyn til et kendt punkt som bregma18stereotaxisk koordinater. Øre barer skal være sikret ordentligt for at sikre, at kraniet er niveau og fuldt immobiliseret. Pleje skal tages under midterlinjen indsnit i hovedbunden at undgå scoring kraniet, da dette kan påvirke visualisering af suturen linjer. Vinduet kraniotomi bør være stor nok til at rumme MEA.
Denne protokol præsenterer en række tekniske udfordringer, der kræver en velassorteret drift suite og en investigator/team dygtige i de kirurgiske og bedøvende aspekter af protokollen. Modellen præsenterer desuden finansielle begrænsninger i at Grisling model er dyrere end den gnavere model; men det er betydeligt billigere end brugen af ikke-menneskelige primater, der kan koste tusindvis af dollars. Brugen af MEA teknologi præsenterer sine egne udfordringer, som proceduren med belægning og plating elektroderne manuelt kræver en dygtig investigator eller assistent at sikre tilstrækkelig selektivitet og pålidelig funktion. Microelectrodes sig selv er skrøbelige, som de er lavet af keramik, og dermed let beskadiget, hvis ordentlig forsigtighed ikke er observeret. Microelectrodes er underlagt indblanding fra andre elektriske enheder, som kan skabe støj i optagelserne, og blod på webstedet udløsende, som kan occlude optagelse websteder. Behovet for specialiseret udstyr præsenterer en ekstra byrde, som et stereotaxisk kirurgisk ramme skal være brugerdefineret bygget til at immobilisere Grisling kraniet under implantation. Stereotaxisk rammen, glutamat oxidase og elektroderne for sig er alt dyrt. Derudover udgør manglen på en Grisling stereotaxisk atlas fra inden for det sidste årti tekniske begrænsninger, der kræver særlig ekspertise til at bestemme den specifikke placering af dybe strukturer i hjernen, Grisling. Udvikling af en ny stereotaxisk atlas, måske ved hjælp af magnetisk resonans, ville i høj grad forbedre evnen til at bruge denne teknologi i smågrise.
Grisling er en klinisk relevante model for studiet af AIN i vid udstrækning de paralleller, der eksisterer mellem denne art og den menneskelige nyfødte, som begge har lignende hjernens struktur og udvikling. I modsætning til mere almindeligt anvendte modeller såsom mus eller rotter har Grisling en større CNS lighed for mennesker, der låner til translatability af modellens resultater. Grisling model er desuden billigere og indebærer mindre kompliceret behandling end en primat model. Grisling model er beregnet til at undersøge processen ved hvilke anæstesi kan fremkalde udviklingsmæssige neurotoksicitet, måle sit bidrag til Neurologiske skader og bekæmpe spørgsmålet om skader forårsaget af confounding variabler. For eksempel, kan blive misforstået hypoxi for skader forårsaget af anæstetika, som det har globale effekter på hjernen. Grisling er udnyttet med samme kirurgiske og bedøvende betingelser som dem, der anvendes i human medicin for at sikre troskab af resultater.
Brugen af keramik-baserede MEA teknologi fjerner flere af de ulemper forbundet med den moderne teknik for mikrodalyse. Mikrodalyse har begrænset tidsmæssige og rumlige opløsning i forhold til amperometric metoder såsom MEA, som kan løbende Optag glutamat begivenheder i flere, mikroskopiske regioner på op til 10 Hz23. Denne hurtige samplingfrekvens eliminerer den konfunderende faktor af lokaliserede neurotransmitter diffusion, der er forbundet til slow--prøveudtagningsmetoder ligesom mikrodalyse24. Desuden er MEA en mindre invasiv metode end en mikrodalyse sonde, der kan forårsage betydelige gliosis i løbet indsættelse og kan ændre neurotransmitter aktivitet på indsættelsen site22.
Tidligere undersøgelser bruger en vifte af pattedyr modeller, måleteknikker og regioner af hjernen, har demonstreret basal glutamat niveauer svarende til dem fundet ved hjælp af denne teknik. Dette tyder på, at MEA teknologi, når modellens Grisling er tilpasset giver gyldig optagelser i vivo glutamat koncentration (tabel 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Forfatter (år)</td>
			<td>Optagelse teknik</td>
			<td>Dyremodel</td>
			<td>Alder</td>
			<td>Hjernen region(er)</td>
			<td>Betyde Basal glutamat koncentration (µM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hascup et al. (2008)23
</td>
			<td>MEA (enzym-baseret)</td>
			<td>Gnaver</td>
			<td>20 - 24 uger</td>
			<td>Præfrontal Cortex, Striatum</td>
			<td>3,3 ± 1,0; 5.0 ± 1,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hascup et al. (2010)25
</td>
			<td>MEA (enzym-baseret)</td>
			<td>Gnaver</td>
			<td>3 - 6 måneder</td>
			<td>Hippocampus</td>
			<td>4.7-10.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rutherford et al. (2007)9
</td>
			<td>MEA (enzym-baseret)</td>
			<td>Gnaver</td>
			<td>3 - 6 måneder</td>
			<td>Præfrontal Cortex, Striatum</td>
			<td>44.9 ± 4.7; 7.3 ± 0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Miele et al. (1996)26
</td>
			<td>Mikrodalyse (enzym-baseret)</td>
			<td>Gnaver</td>
			<td>-</td>
			<td>Striatum</td>
			<td>3.6 ± 0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dag et al. (2006)27
</td>
			<td>MEA (enzym-baseret)</td>
			<td>Gnaver</td>
			<td>3 - 6 måneder</td>
			<td>Frontal Cortex, Striatum</td>
			<td>1.6 ± 0,3; 1,4 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Quintero et al. (2007)28
</td>
			<td>MEA (enzym-baseret)</td>
			<td>Ikke - menneskelige primater</td>
			<td>5.3-5.5 år</td>
			<td>Premotor Cortex, motoriske Cortex</td>
			<td>3.8 ± 1,7; 3.7 ± 0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stephens mfl.  (2010) 29
</td>
			<td>MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)]</td>
			<td>Ikke - menneskelige primater</td>
			<td>11 - 21 år</td>
			<td>Putamen</td>
			<td>8,53</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kodama et al. (2002)30
</td>
			<td>Mikrodalyse (enzym-baseret)</td>
			<td>Ikke - menneskelige primater</td>
			<td>-</td>
			<td>Præfrontal Cortex</td>
			<td>1.29-2.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>Galvan et al. (2003)31
</td>
			<td>Mikrodalyse (enzym-baseret)</td>
			<td>Ikke - menneskelige primater</td>
			<td>Juvenile</td>
			<td>Striatum</td>
			<td>28.74 ± 2,73</td>
		</tr>
<tr>
<td>Under og Spencer (1993)32
</td>
			<td>Mikrodalyse (enzym-baseret)</td>
			<td>Menneskelige</td>
			<td>18 - 35 år</td>
			<td>Hippocampus</td>
			<td>20.3 ± 6.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reinstrup et al. (2000)33
</td>
			<td>Mikrodalyse (enzym-baseret)</td>
			<td>Menneskelige</td>
			<td>-</td>
			<td>Frontal Cortex</td>
			<td>16 ± 16</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cavus et al. (2005)34
</td>
			<td>Mikrodalyse (enzym-baseret)</td>
			<td>Menneskelige</td>
			<td>15 - 52 år</td>
			<td>Neocortex</td>
			<td>2.6 ± 0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Sammenligning af basal ekstracellulære glutamat levelsacross forskellige dyremodeller. En valgte gennemgang af undersøgelser om normale ekstracellulære glutamat niveauer i sunde vågen og bedøvede dyr ved hjælp af mikrodalyse eller microelectrodes.
Brugen af MEA teknologi til at overvåge i vivo glutamat koncentrationer i modellen Grisling kan tillade den fremtidige evaluering af Grisling neurologiske udfald efter anæstesi. Overlevelse eksperimenter har været planlagt, hvilket vil yderligere en forståelse af den langsigtede virkning af anæstesi på neurokognitive trivsel menneskelige nyfødte. Overlevelse eksperimenter vil gøre det muligt for adfærdsmæssige test og overvågning af glutamat ændres længe efter anæstesi eksponering. Det er også almindeligt, at børn skal underkastes anæstesi i forhold, hvor de kan opleve fysiologiske stress i form af kirurgiske indgreb. Fremtidige undersøgelser adressering indflydelse af kirurgi neurologisk skade og stigning i neurotoksicitet ønsker mulighed for mere præcis modellering af en fælles kliniske omgivelser for børn. Brugen af alternative dyremodeller er også muligt, som er studiet af disse forskellige modeller gennem kronisk implantation, gør det muligt at spore adfærdsmæssige ændringer forbundet med neurotoksicitet. Selve MEA teknologien er alsidig, så fremtidige studie ikke behøver at være begrænset til analyse af glutamat niveauer (f.eks., GABA, cholin, lysin, osv. kunne analyseres).

Hvert år underkastes millioner af børn anæstesi invasive og non-invasiv procedure i USA1. For år, har anæstesi udbydere beroliget forældre sikkerheden af anæstetika, selv i små børn og nyfødte. I 1999 blev det imidlertid konstateret at forbigående blokering af N-methyl-D-aspartat (NMDA) undertype af glutamat-receptorerne under opvækst kunne forårsage udbredt neuronal apoptose i rotter2. For nylig, FDA udgivet en drug sikkerhed kommunikation, der kræver etiketter af bedøvende medicin til at omfatte en advarsel om generelle anæstetika og deres potentielle negative indvirkning på udviklingslandene hjernerne hos børn yngre end 3 år gammel (u. s. Food og Drug Administration, 2017). Der er dog stadig behov for at belyse mulige mekanismer og potentielle neuroprotektive foranstaltninger.
Normal aktivitet af neurotransmittere som glutamat og gamma-amino smørsyre (GABA) er kritiske for normale nervesystemets udvikling at forekomme. Selv om de fleste af de veje, der er involveret i AIN er stadig undvigende, er neurotransmitter-systemer meget sandsynligt, at være involveret, eftersom anæstetika er kendt for at modulere disse veje for at producere bevidstløshed. Især forårsager excitatoriske neurotransmitter glutamat excitotoxicity, når dens aktivitet er dysregulated. Denne neurotransmitter er normalt involveret i neurogenese, neural plasticitet, synaptic og neural vækst og en række andre kritisk vigtige hjernefunktioner. Men langvarig aktivering af glutamat-receptorerne kan forårsage excitotoxicity og neuronal apoptose, især under stress tilstande som kirurgi, ilt afsavn og reduceret energi tilgængelighed3. Binding af glutamat til NMDA har receptoren vist sig at forårsage Na+ og Cl− tilstrømning. Den efterfølgende depolarisering menes at føre til Ca2 + -kanal åbningen og frigivelse af intracellulære Ca2 + gemmer4. Denne dysfunktion sandsynligvis fører til en kaskade af metaboliske derangements, som i sidste ende mindske neuronal spredning, øge betændelse, og føre til neuronal død. Trods disse hypoteser forbliver de sande mekanismer af AIN uklart5. På grund af sin rolle i apoptose repræsenterer glutamat dysregulering en roman pathway, der kan bidrage til mekanismen af tidligere dokumenteret neuronal apoptose, en funktion i AIN.
En af hindringerne på studiet af neuronal processer er deres høj kompleksitet, især i fastsættelsen af neuronal udvikling. De første par måneder af livet er perioden af maksimal sårbarhed over for skade, under hvilke de fleste af de vigtige skridt af neuronal udvikling som fysiologisk apoptose (neuronal beskæring), synaptogenesis, gliogenesis og myelination finder sted6 . I betragtning af den komplekse karakter af neuronal kommunikation og vanskeligheden ved at studere disse processer uden at forstyrre normale CNS funktion, er nye teknologier blevet udviklet som sigter i vivo påvisningen og kvantificeringen af vigtige elementer af neuronal kommunikation.
Enzym-forbundet MEA teknologi blev brugt i denne undersøgelse som en ny måde at studere mekanismerne af AIN i en klinisk relevante Grisling model. Denne teknologi kan bruges til at studere kompleks i vivo elektrokemiske hjerne processer, herunder glutamat dysregulering. Indbygget 4-kanals platin optagelse lokaliteter af multilaterale miljøaftaler (2 glutamat-følsomme sites og 2 sentinel sites) tillade selvrefererende, som bidrager til registrering af nøjagtighed. Derudover en udelukkelse lag påføres hver elektrode, om selektivitet ved at forhindre andre interfererende molekyler fra at blive opdaget7. Desuden giver den lav-profil design af MEA minimal væv traumer i forhold til tidligere teknologier. Denne samme funktion giver til MEAs en højere rumlige opløsning, som letter studiet af mikroskopiske områder i hjernen. For eksempel kan diskret regioner af hippocampus (dentate gyrus, CA1, CA2) være specifikt undersøgte8. Specifikke oplysninger om funktionaliteten af multilaterale miljøaftaler har været tidligere beskrevet9.
I forhold til MEA elektrokemi, mikrodalyse inkorporerer en membran placeres mellem løsning af interesse og en løsning af lignende sammensætning, giver mulighed for påvisning af ekstracellulære væske ændrer10. Selv om mikrodalyse er en grundpille i neurochemistry og har længe været anvendt til påvisning af neurotransmittere, har det Ulempen at lave tidsopløsning, forsinket påvisning af glutamat ændring, og betydelige væv traumer11.
Multilaterale miljøaftaler kan indirekte registrere neurotransmittere som glutamat, acetylcholin og cholin, ved hjælp af passende oxidase enzymer, der producerer electroactive reporter molekyler såsom H2O2 eller O212,13 .
MEA teknologi har været meget anvendt i rotter og ikke-menneskelige primater til studiet af neurotoksicitet i forbindelse med patofysiologiske processer end AIN7,14. Blandt nogle af disse patofysiologiske processer, har MEA teknologi været brugt i studiet af Alzheimers sygdom, epilepsi, traumatisk hjerneskade og effekten af farmakologiske forbindelser på synaptic meddelelse8,15 , 16 , 17. selv om miljøaftaler har været brugt til at studere disse patologier i rotter og ikke-menneskelige primater, høj udviklingsmæssige ligheden mellem mennesker og Grisling hjerner gør tilpasning af MEA teknologi i smågrise en særdeles velegnet teknik til undersøgelsen AIN mekanismer18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="711">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer</td>
			<td style="width:155px;">PBS Animal Health</td>
			<td style="width:119px;">292-13</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Piglet Anesthesia Face-Cone Mask</td>
			<td style="width:155px;">VetEquip</td>
			<td style="width:119px;">921428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Integra SL Anesthesia Workstation</td>
			<td style="width:155px;">DRE Veterinary</td>
			<td style="width:119px;">2350</td>
			<td style="width:223px;">This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sevoflurane</td>
			<td style="width:155px;">Ultane</td>
			<td style="width:119px;">0074-4456-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rocuronium Bromide Injection</td>
			<td style="width:155px;">Hospira</td>
			<td style="width:119px;">0409-9558-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Medfusion 4000 IV Infusion&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Smiths Medical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax</td>
			<td style="width:155px;">Kopf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Model 1541 Piglet Adaptor</td>
			<td style="width:155px;">Kopf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Infrared Spot Lamp</td>
			<td style="width:155px;">Amazon</td>
			<td style="width:119px;">B000HHQ94C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bair Hugger Torso Blanket</td>
			<td style="width:155px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bair Hugger</td>
			<td style="width:155px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Alcohol Prep Pad</td>
			<td style="width:155px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade</td>
			<td style="width:155px;">Bard-Parker</td>
			<td style="width:119px;">#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel Handel</td>
			<td style="width:155px;">Havel&#39;s</td>
			<td style="width:119px;">HAN-G4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">504615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mosquito Forceps</td>
			<td style="width:155px;">Sklar Surgical Instruments</td>
			<td style="width:119px;">17-1225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze Pads</td>
			<td style="width:155px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">22-246-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adson Tissue Forceps</td>
			<td style="width:155px;">Teleflex</td>
			<td style="width:119px;">181223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dremel 111 Engraving Cutter</td>
			<td style="width:155px;">Amazon</td>
			<td style="width:119px;">Dremel 111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microelectrode Array</td>
			<td style="width:155px;">Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>S2 4Ch MEA; custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Headstage</td>
			<td style="width:155px;">Quanteon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2pA/mV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wire, silver, PFA, .008&#34; Bare, .0110&#34; coated</td>
			<td style="width:155px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:119px;">786500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fine Micromanipulator</td>
			<td style="width:155px;">Narishige Scientific Instrument Lab</td>
			<td style="width:119px;">MO-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of microelectrode array technology for the study of anesthesia-induced neurotoxicity in the intact piglet brain

Hvert år underkastes millioner af børn anæstesi til en lang række procedurer. Men undersøgelser i både dyr og mennesker har sat spørgsmålstegn sikkerhed af anæstesi hos børn, implicere anæstetika som potentielt giftige for hjernens udvikling. Hidtil har ingen undersøgelser har med held belyst mekanismer som anæstesi kan være neurotoksiske. Dyreforsøg tillade undersøgelse af sådanne mekanismer, og neonatal smågrise repræsenterer en fremragende model til at studere disse virkninger på grund af deres udviklingsmæssige slående ligheder til den menneskelige hjerne.
Denne protokol tilpasser brugen af enzym-baserede mikroelektrode array (MEA) teknologi som en ny måde at studere mekanismer af anæstesi-induceret neurotoksicitet (AIN). MEAs aktiverer real-time overvågning af i vivo neurotransmitter aktivitet og tilbyder ekstraordinære tidsmæssige og rumlige opløsning. Det er en hypotese at bedøvelsesmiddel neurotoksicitet skyldes delvis af glutamat dysregulering og MEAs tilbyder en metode til at måle glutamat. Roman gennemførelsen af MEA teknologi i en Grisling model præsenterer en unik mulighed for undersøgelse af AIN.

Denne proof-of-concept undersøgelse med enzym-baserede keramiske MEA teknologi i en Grisling model kan levere enestående indblik i den glutamat dynamik underliggende AIN. Denne undersøgelse yderligere viser at enzym-baserede MEA teknologi kan tilpasses med succes i Grisling model til at måle fysiologisk og anæstesi-associerede ændringer i neurotransmitter aktivitet med høj følsomhed og høj rumlige og tidsmæssige opløsning. Fysiologiske homeostase blev opretholdt i hele vores eksperimenter ved hjælp af klinisk relevante metoder og standarder, og ingen Grisling udstillet tegn på fysiologisk perturbationer.
Oplysninger indhentet angiver MEAs evne til præcist og rumligt løse neurotransmitter målinger cortical og sub kortikale hjernen strukturer. Brugen af et stereotaxisk apparatur kan klare identifikation af en reference overfladestruktur (bregma) for at konsekvent finde region af interesse, individuelle forskelle i Grisling størrelse og anatomi. Klart visualisering af suturer letter konsekvent regionale placering af MEA med nøjagtighed i rækken mikrometer (figur 4). At få adgang til den kortikale overflade af hjernen er minimalt traumatisk med ubetydelig blødning, sikrer, at enhver i vivo glutamat dynamics ikke på grund af utilsigtet systemiske eller lokale fornærmelse (figur 5). Den brugerdefinerede, stive MEA derefter justeres vinkelret til frontal Grisling (figur 6). Manglende korrekt justere MEA før indsættelse kan forhindre nøjagtig rumlige optagelse af den målrettede region, især for subkortikale områder.
Real-time i vivo glutamat målinger blev taget i hippocampi af 3-4-dages gamle smågrise (n = 4) under 2,5-3% Sevofluran anæstesi (ca 1 MAC). Amperometry målinger blev optaget på 4 Hz og konverteret til koncentration ved hjælp af en lineær regression baseret på kalibreringsparametre (figur 8bedømmelseskomite A). For hvert tidspunkt, var i gennemsnit signaler fra de to glutamat-følsomme steder før fradrag gennemsnit sentinel signal at give en korrigeret glutamat signal. Disse kontinuerlige målinger blev glattes ved at anvende et bevægeligt gennemsnit for at bedre visualisere den overordnede tendens over tid (figur 8bedømmelseskomite B). Den gennemsnitlige basal glutamat koncentration var beregnet til at være 4,61 ± 0,02 µM og forblev relativt stabile i løbet af bedøvelsesmiddel eksponering. Forbigående glutamatergic aktivitet var identificeret i ét dyr ved at analysere toppe i signalet, der ikke var korreleret med sentinel signal (R2 < 0.5) og overskredet en signal-støj-forholdet af 3 (figur 9bedømmelseskomite A). Ialt 116 forbigående toppe blev registreret over en periode på 3,5 t (figur 10bedømmelseskomite A). Amplituden af de resulterende forbigående toppe blev generelt observeret for at være inden for 1 µM rækkevidde (figur 10bedømmelseskomite B). For at kvantificere varigheden af hver transient, blev den tid (t80), der kræves for hver maksimale peak værdi til forfald 80% opnået (figur 9bedømmelseskomite B). Den gennemsnitlige t80 af alle glutamat transienter periode 3,5 h optagelse var 4,68 ± 0,82 s (figur 10bedømmelseskomite C). Disse data viser, at det er muligt at præcist at måle både langvarig og forbigående neurotransmitter aktivitet i en subkortikale region af hjernen, bedøvede Grisling.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig1.jpg"> Figur 1: visuel sammenligning af SG-2 mikroelektrode arraytyper. SG-2 matrixer indeholder to glutamat-følsomme og to glutamat-ufølsom sentinel websteder (150 µm x 20 µm pr. websted). ()A) en fleksibel aksel mikroelektrode array er vist til venstre. Matrixen stive skaft mikroelektrode var specialdesignet til brug i smågrise og tilladelser dybere implantation i store dyr. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig2.jpg"> Figur 2: oversigt over mikroelektrode array forberedelse og kalibrering proces. Den samlede MEA forberedelse og kalibrering sidste cirka en uge. Belægning enzym, udstødelse lag og kalibrering analysander er specifikke for neurotransmitter af interesse. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig3.jpg"> Figur 3: placering af smågrise i den stereotaxisk apparatur. Grisling munden er placeret på munden bar direkte posteriort for canine tænder. De gennemtrængende øre barer er indsat i de øre kanal til at sikre den bageste ende af kraniet. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig4.jpg"> Figur 4: placering af smågrise i den stereotaxisk apparatur til kraniotomi. (A) Grislings hoved er stramt sikret inden for den brugerdefinerede stereotaxisk ramme, at sikre ensartet placering af MEA. Ækvidistante placering af gennemtrængende øre barer er synlige. (B) midterlinjen anterior-posterior indsnit langs hovedbunden. Scoring af kraniet var undgået at visualisere koronal og sagittal suturer og optimere visualisering af bregma. Skalalinjen er vist for at angive den relative størrelse af snit og placeringen af kraniotomi vindue. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig5.jpg"> Figur 5: kraniotomi for adgang til hippocampus. (A) hovedbunden afspejles yderligere for at udsætte den omtrentlige placering af MEA indsættelse efter stereotaxisk koordinater. Kredsede området er markeret (sort prik) til at guide kraniotomi. (B) vinduet kraniotomi (0,25 cm2) med kraniet flap fjernes for at afsløre de underliggende dura mater. (C) meninges forsigtigt fjernes for at afsløre overfladisk hjernebarken uden væv traumer. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig6.jpg"> Figur 6: MEA positionering og indsættelse i hippocampus. (A) placering af MEA på bregma hen til afgøre en relativ stereotaxisk placering af hippocampus. (B) stereotaxisk placering af MEA på hjernens overflade til at bestemme hippocampus indsættelse dybde. Sølv pseudo referenceelektrode sikkert placeret under hovedbunden (angivet med pil). (C) MEA indsat på en passende dybde at få real-time, i vivo ekstracellulære glutamat målinger i hippocampus. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig7.jpg"> Figur 7: MEA opførsel i perioden, 30-min baselining. Den første hurtige stigning svarer til nedstigningen af MEA i hippocampus ved hjælp af micromanipulator. Den oprindelige periode begynder når MEA har nået den passende dybde (stiplet linje). Ekstracellulære glutamat målinger vil falde over en periode på 30 min og bør ikke fortolkes som fysiologisk aflæsninger. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig8.jpg"> Figur 8: Real-time ekstracellulære glutamat målinger i hippocampus neonatal grisens under Sevofluran anæstesi. (A) de bevægelige gennemsnit af glutamat koncentrationen i en neonatal gris under Sevofluran anæstesi (ved hjælp af 10 datapunkter) i hippocampus. Målinger blev taget på 4Hz til 3 h efter en kort 30 min baselining periode. (B) udjævning af glutamat målinger ved hjælp af et bevægeligt gennemsnit i 100 point hver 15 min til bedre visualisere tendensen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig8large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig9.jpg"> Figur 9: identifikation af forbigående glutamat aktivitet i hippocampus neonatal grisens under Sevofluran anæstesi. (A) forbigående glutamat toppe (i rødt) er angivet på real-time glutamat-sporing. Toppe blev betragtet som væsentlig, når signal til støjforhold overskredet 3 og deres signal var ikke korreleret med sentinel signal (R2 < 0.5). (B) en repræsentativ forbigående peak identificeret i figur 9bedømmelseskomite A. Stiplede linjer angiver den samlede varighed kræves for peak til forfald 80%. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig9large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig10.jpg"> Figur 10: karakterisering af glutamat transienter i hippocampus neonatal grisens under Sevofluran anæstesi. (A) A antallet af forbigående glutamat toppe på 15 min placeringer. Toppe blev betragtet som væsentlig, når signal til støjforhold overskredet 3 og deres signal var ikke korreleret med sentinel signal (R2 < 0.5). (B) amplitude af forbigående glutamat toppe. Fejllinjer angiver standardafvigelsen på middelværdien. (C) betyde T80 af forbigående glutamat toppe. Fejllinjer angiver standardafvigelsen på middelværdien. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig10large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain at JoVE.com

Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain

Tilpasning af mikroelektrode Array teknologi for studiet af anæstesi-induceret neurotoksicitet i hjernen, intakt Grisling

Denne undersøgelse udforsker den roman brug af enzym-baserede mikroelektrode array (MEA) teknologi til at overvåge i vivo neurotransmitter aktivitet i smågrise. Hypotesen var, at glutamat dysregulering bidrager til mekanismen af bedøvelsesmiddel neurotoksicitet. Vi præsenterer her, en protokol for at tilpasse MEA teknologi for at studere mekanismen af anæstesi-induceret neurotoksicitet.

Every year, millions of children undergo anesthesia for a multitude of procedures. However, studies in both animals and humans have called into question ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering af proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver og pupper

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Optagelse elektrisk aktivitet fra Identificerede Neuroner i ubeskadiget Brain af transgene fisk

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologiske optagelse i hjernen af ​​intakte Voksen Zebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetisk manipulation af Cerebellær granuleneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; In Vivo</em&gt; At studere Neuronal morfologi og Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Det olfaktoriske system som en model til at studere axonal vækstmønstre og morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Mikroelektrode Guidet Implantation af elektroder ind i nucleus subthalamicus af rotter for Langsigtet Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Optagelse synaptisk plasticitet i akut hippocampus skiver vedligeholdes i en lille-volumen genanvendelse - Perfusion- og neddykning-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Kronisk Implantation af hele-kortikale Electrocorticographic Array i den fælles silkeabe

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...