Name: adaptation of microelectrode array technology for the study of anesthesia-induced neurotoxicity in the intact piglet brain
Uploaded: 2018-05-12T14:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain at JoVE.com

De auteurs wil erkennen van de bijdragen van het centrum van de Universiteit van Kentucky voor micro-elektrode technologie (CenMeT), en de Ohio State University Laboratory dier Resource Center (ULAR).

Biggen (Sus scrofa) worden ontvangen via een lokale boerderij vooraf goedgekeurd door de Ohio State University (OSU) institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC). Na goedkeuring van het protocol, dier experimenten zijn uitgevoerd in overeenstemming met IACUC beleid.
1. biggen en Knorretje behandeling
<ol><li>Gebruik maken van mannelijke en vrouwelijke biggen op een systematische en gerandomiseerde manier om te elimineren elke potentiële geslacht gebaseerde verstrengeling overeenkomstig ARRIVE richtsnoeren19. Opmerking: Aangezien de periode van maximale hersenen groei binnen 3-5 dagen na de geboorte van biggen is, experimenten gebeurt uitsluitend met biggen 3-5 dagen oud.</li>
	<li>Zorgen voor biggen aankomen in het vivarium ten minste 24 uur vóór experimenten toe acclimatisatie aan het milieu. Opmerking: Opgeleid veterinair personeel biedt routine dierenverzorgers. De biggen worden gehouden in kooien van individueel temperatuur onderhouden, continu gecontroleerde en ontvang een qua voedingswaarde volledige melk vervanger ad libitum Voorkom hypoglykemie. De biggen worden ook gehouden zonder melk vervanger (nihil per os), gedurende ten minste 3 uur voorafgaand aan de narcose en zijn voorzien van dekens en speelgoed om normale niveaus van stimulatie. Indien mogelijk, houden meerdere biggen in de dezelfde kooi om socialisatie.</li>
</ol>2. ontwikkeling en aanpassing van multilaterale milieu-akkoorden voor AIN Studies in een Model van biggen
Opmerking: Deze technologie gebruikt enzym gebaseerde multilaterale milieu-akkoorden die vooraf bedekt met enzym en galvanische met m-fenyleendiamine dihydrochloride (mPD). De elektroden zijn aangepaste ontworpen met een 40-mm stijve schacht en vervaardigd voor gebruik bij biggen (Figuur 1).
<ol><li>Om te voorkomen dat de redundantie, raadpleegt u dat de gedetailleerde beschrijving van MEA voorbereiding en kalibratie zoals eerder beschreven15 (Figuur 2).</li>
</ol>3. narcose en gebruik van aangepaste Stereotaxic apparatuur voor de biggen
<ol><li>Anesthetize van dieren met behulp van een verdoving werkstation met een passende ventilator en controle van apparaten, en controleren van de fysiologische parameters zoals pulse oxymetrie, niet-invasieve bloeddruk, electrocardiografie en temperatuur die overal in de zoals eerder beschreven geheel van het experiment19. Intubate en ventileren van de biggen en Sevofluraan anesthesie bij 1 Minimale Alveolaire concentratie (MAC) (ongeveer 2,5-3%) voor 3,5 h. Verzeker u ervan dat opgeleid laboratoriumpersoneel leden zijn aanwezig voor deze experimenten te beheren. Bont overliggende het chirurgische gebied wordt verwijderd met behulp van elektrische tondeuse voorafgaand aan de voorbereiding van de huid. Opmerking: De concentratie en de blootstellingsduur verdovingsmiddel gebruikt maakt het mogelijk het experiment te simuleren van de tijd-lengte van de werkelijke verdoving blootstelling tijdens een chirurgische ingreep. Daarnaast is Sevofluraan de meeste vaak gebruikt algemene verdoving bij de pediatrische populatie maken van het onderzoek rond de veiligheid van het allergrootste belang.</li>
	<li>Vóór plaatsing in het stereotaxic frame, start een rocuronium laden dosis van 2,5 mg/kg en een infusie van 1,5 mg/kg/h om dierlijke beweging terwijl beveiligd in het frame te voorkomen.<ol>
<li>Plaats de biggen in het stereotaxic frame van Knorretje-specifieke zodra een voldoende diepte van de verdoving wordt bevestigd door teen-snuifje.</li>
		<li>Bieden voldoende padding binnen het kader van de stereotaxic door het plaatsen van de biggen op een opwarming pad van gedwongen-lucht met extra opvulling (bv, fluïde positioner) ter voorkoming van decubitus.</li>
		<li>De tanden van de onderkaak in de bovenste plaats over de tand bar (Figuur 3). Opmerking: De tand bar moet op een voldoende niveau aan de schedel zeer stevig op zijn plaats te houden.</li>
		<li>Los en draai de doordringende oor bars op de oren, zorg om ervoor te zorgen dat de biggen in de schouderstreek positie. Standpunt de spitse uiteinden van de laterale houdt in de gehoorgang en het oor bars stevig genoeg om het "pop" geluid die is gekoppeld aan de penetratie van het tympanic-membraan invoegen. Stevig de oor-bars hechten aan de schedel en invoegen op gelijke diepte aan elke kant om te voorkomen dat de beweging van de schedel tijdens het experiment (Figuur 4paneel A). Opmerking: Het is van vitaal belang de biggen om warm te houden (~ 37,8-38,6 ° C) en continu toezicht op de temperatuur tijdens de gehele procedure voor handhaving van de normothermia. Dit kan worden bereikt via een deken en/of een warmte lamp. Zorg ervoor dat de warmte lamp plaatsen op de juiste afstand om te voorkomen dat de verbranding van de huid van het dier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maak een incisie van de middellijn van 4-6 cm langs de schedel met behulp van voorzichtig om te voorkomen dat het scoren van de schedel met de scalpel. Zodra de incisie wordt gemaakt, gebruik zachte retractie en botte dissectie te verheffen van de hoofdhuid van de schedel. Scrub zachtjes de schedel met een gaas-pad te verwijderen elke bindweefsel en bloot de lijnen van de hechtdraad (Figuur 4deelvenster B). Opmerking: Het is niet nodig om de steriliteit tijdens niet-survival experimenten. Steriliteit moet echter worden gehandhaafd tijdens overleving experimenten.</li>
	<li>Verder weerspiegelt de hoofdhuid, indien nodig, bloot het interessegebied en de beoogde locatie voor de craniotomy (Figuur 5paneel A) bepalen. Een chirurgische boor kunt met het maken van een venster van de craniotomy van ongeveer 0,25 cm2 (mogelijk groter of kleiner afhankelijk van experimentele doelen) over de structuur van belang, met behulp van voorzichtig niet te verwonden de dura of de onderliggende hersenen (Figuur 5 , Paneel B). Gebruik fijn chirurgische schaar accijnzen van de dura overliggende het hersenweefsel (Figuur 5deelvenster C).</li>
	<li>Plaats de elektrode zo verticaal mogelijk op de bregma door het veiligstellen van de metalen arm van de headstage aan de micromanipulator van de stereotax van de biggen. De elektrode zoveel mogelijk verlagen zonder aan te raken het oppervlak van de schedel. Neem de coördinaten van de bregma (Figuur 6paneel A).<ol>
<li>Bepalen van het anterior-posterior en mediale-laterale coördineert en de diepte van de structuur van belang zoals zij betrekking op de bregma hebben. Bepaal de stereotaxic coördinaten met behulp van een soort en aangepast aan de leeftijd stereotaxic atlas. In dit geval, gebruik een stereotaxic atlas speciaal ontwikkeld voor biggen20.</li>
		<li>De elektrode verplaatsen zodat er de juiste anterior-posterior en mediale-laterale locatie, ervoor te zorgen dat zowel het apparaat als de micro-elektrode loodrecht op het oppervlak. Plaats de pseudo-referentie-elektrode onder de hoofdhuid, zorgen voor contact met het dier (Figuur 6deelvenster B).</li>
		<li>Langzaam en voorzichtig, lager de elektrode naar de juiste diepte in de hersenen met behulp van de stereotaxic arm. Gebruik voor de laatste 2 mm, een hydraulische microdrive naar verdere station de elektrode naar de exacte locatie (Figuur 6deelvenster C). Opmerking: De positie van de elektrode moet bedekken het craniotomy-venster. De diepte van de elektrode zal variëren afhankelijk van de hersenstructuur van belang. Het is niet nodig om te sluiten van de incisie na voltooiing van het verzamelen van gegevens in niet-survival experimenten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. meting van de extracellulaire glutamaat onder Sevofluraan verdoving
<ol><li>Zorg ervoor de biggen onder continue fysiologische monitoring in het geheel van deze procedure. Biggen zijn verdoofd inhalationally (via gezicht kegel) ter voorbereiding van de procedure.</li>
	<li>Na implantatie van de MEA, wachten 30 min om de elektrode te bereiken van de basislijn om ervoor te zorgen dat de correcte meting zal worden verkregen voor 3 h (Figuur 7).</li>
	<li>0,25% bupivacaine (1 mL/kg) wordt subcutaan toegediend op de site van de operatie voor het beheer van de postoperatieve pijn. Bovendien is aanhoudende-release buprenorfine subcutaan q72h desgewenst gegeven.</li>
</ol>5. perfusie en offer
<ol><li>Het uitvoeren van de perfusie en procedures voor het verzamelen van weefsel van hersenen21zoals hiervoor is beschreven. Voor niet-survival operaties, zijn dieren euthanized onmiddellijk na experimenten terwijl nog onder narcose.</li>
	<li>Neem bruto dwarsdoorsneden van de vaste Knorretje hersenen en gebruik van de lichte microscopie van te visualiseren het spoor van de elektrode als eerder beschreven22 om verificatie van MEA plaatsing, zorgen voor de juiste plaatsing in het gebied van belang.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hall, M. J., DeFrances, C. J., Williams, S. N., Golosinskiy, A., Schwartzman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+hospital+discharge+Survey:+2007+summary.">National hospital discharge Survey: 2007 summary.</a> Natl Health Stat Report. (29), 1-24 (2010).</li><li>Ikonomidou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+NMDA+receptors+and+apoptotic+neurodegeneration+in+the+developing+brain.">Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain.</a> Science. 283 (5398), 70-74 (1999).</li><li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+neurotrophic+factors+in+neuronal+plasticity+and+disease.">Glutamate and neurotrophic factors in neuronal plasticity and disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1144 (1), 97-112 (2008).</li><li>Atlante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+neurotoxicity,+oxidative+stress+and+mitochondria.">Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria.</a> FEBS Lett. 497 (1), 1-5 (2001).</li><li>Kavitha, J., Durga, P., Ramachandran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhalational+agents+in+anesthesia+induced+developmental+neurotoxicity+-+Recent+advances.">Inhalational agents in anesthesia induced developmental neurotoxicity - Recent advances.</a> Trends in Anaesthesia and Critical Care. 11 (1), 14-18 (2016).</li><li>Zanghi, C. N., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+holistic+approach+to+anesthesia-induced+neurotoxicity+and+its+implications+for+future+mechanistic+studies.">A holistic approach to anesthesia-induced neurotoxicity and its implications for future mechanistic studies.</a> Neurotoxicol Teratol. 60 (2), 24-32 (2017).</li><li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+real-time+monitoring+of+glutamate+and+electrophysiology+from+cortex+to+hippocampus+in+mice+based+on+a+microelectrode+array.">In situ real-time monitoring of glutamate and electrophysiology from cortex to hippocampus in mice based on a microelectrode array.</a> Sensors (Basel). 17 (1), 1-8 (2016).</li><li>Hinzman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+brain+injury+elevates+tonic+glutamate+levels+and+potassium-evoked+glutamate+release+in+discrete+brain+regions+at+two+days+post-injury:+an+enzyme-based+microelectrode+array+study.">Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study.</a> J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).</li><li>Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Str&#246;mberg, I., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+second-by-second+measures+of+L-glutamate+in+the+central+nervous+system+of+freely+moving+rats.">Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats.</a> J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).</li><li>Benveniste, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microdialysis.">Brain microdialysis.</a> J Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).</li><li>Kohno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+detection+of+changes+in+brain+extracellular+glutamate+levels.">An improved method for the detection of changes in brain extracellular glutamate levels.</a> J Neurosci Methods. 81 (1-2), 199-205 (1998).</li><li>Hascup, K. N., Hascup, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+techniques+for+subsecond+neurotransmitter+detection+in+live+rodents.">Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents.</a> Comp Med. 64 (4), 249-255 (2014).</li><li>Rooij, N. F., Koudelka-Hep, M., Frey, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+microprobe+array+for+in+vivo+monitoring+of+neurotransmitters.">Biosensor microprobe array for in vivo monitoring of neurotransmitters.</a> EPFL. , (2010).</li><li>Fan, X. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+glutamate+levels+decrease+in+a+non-human+primate+model+of+dopamine+deficiency.">Cortical glutamate levels decrease in a non-human primate model of dopamine deficiency.</a> Brain Res. 1552, 34-40 (2014).</li><li>Hunsberger, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+enzyme-based+biosensors+to+measure+tonic+and+phasic+glutamate+in+Alzheimer's+mouse+models.">Using enzyme-based biosensors to measure tonic and phasic glutamate in Alzheimer's mouse models.</a> J Vis Exp. (123), (2017).</li><li>Hill, A. J., Jones, N. A., Williams, C. M., Stephens, G. J., Whalley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+multi-electrode+array+screening+for+anticonvulsants+in+acute+rat+brain+slices.">Development of multi-electrode array screening for anticonvulsants in acute rat brain slices.</a> J Neurosci Methods. 185 (2), 246-256 (2010).</li><li>Defranchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+assessment+of+micro-electrode+chip+assay+as+a+method+of+detecting+neurotoxicity+in+vitro.">Feasibility assessment of micro-electrode chip assay as a method of detecting neurotoxicity in vitro.</a> Front Neuroeng. 4 (6), (2011).</li><li>Whitaker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+piglet+model+for+the+study+of+anesthetic-induced+developmental+neurotoxicity+(AIDN):+A+translational+neuroscience+approach.">Use of a piglet model for the study of anesthetic-induced developmental neurotoxicity (AIDN): A translational neuroscience approach.</a> J Vis Exp. (124), (2017).</li><li>Kilkenny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).</li><li>Salinas-Zeballos, M., Ceballos, G., Gootman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the developing swine (Sus scrofa) forebrain. , 887-906 (1986).</li><li>Whitaker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+clinically+relevant+use+of+a+piglet+model+to+study+the+effects+of+anesthetics+on+the+developing+brain.">A novel, clinically relevant use of a piglet model to study the effects of anesthetics on the developing brain.</a> Clin Transl Med. 5 (1), (2016).</li><li>Hascup, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+of+the+effects+of+chronic+implantation+of+ceramic-based+microelectrode+arrays+and+microdialysis+probes+in+rat+prefrontal+cortex.">Histological studies of the effects of chronic implantation of ceramic-based microelectrode arrays and microdialysis probes in rat prefrontal cortex.</a> Brain Res. , 12-20 (2009).</li><li>Hascup, K. N., Hascup, E. R., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-by-second+measures+of+L-Glutamate+and+other+neurotransmitters+using+enzyme-based+microelectrode+arrays.">Second-by-second measures of L-Glutamate and other neurotransmitters using enzyme-based microelectrode arrays.</a> The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 324 (2), 725-731 (2008).</li><li>Rice, M. E., Cragg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+spillover+after+quantal+release:+rethinking+dopamine+transmission+in+the+nigrostriatal+pathway.">Dopamine spillover after quantal release: rethinking dopamine transmission in the nigrostriatal pathway.</a> Brain Res Rev. 58 (2), 303-313 (2008).</li><li>Hascup, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microelectrode+measurements+and+the+origin+and+regulation+of+extracellular+glutamate+in+rat+prefrontal+cortex.">Rapid microelectrode measurements and the origin and regulation of extracellular glutamate in rat prefrontal cortex.</a> Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1608-1620 (2010).</li><li>Miele, M., Boutelle, M. G., Fillenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+source+of+physiologically+stimulated+glutamate+efflux+from+the+striatum+of+conscious+rats.">The source of physiologically stimulated glutamate efflux from the striatum of conscious rats.</a> J Physiol. 497 (Pt 3), 745-751 (1996).</li><li>Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+array+studies+of+basal+and+potassium-evoked+release+of+L-glutamate+in+the+anesthetized+rat+brain.">Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain.</a> J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).</li><li>Quintero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amperometric+measures+of+age-related+changes+in+glutamate+regulation+in+the+cortex+of+rhesus+monkeys.">Amperometric measures of age-related changes in glutamate regulation in the cortex of rhesus monkeys.</a> Exp Neurol. 208 (2), 238-246 (2007).</li><li>Stephens, M. L., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+glutamate+measurements+in+the+putamen+of+awake+rhesus+monkeys+using+an+enzyme-based+human+microelectrode+array+prototype.">Real-time glutamate measurements in the putamen of awake rhesus monkeys using an enzyme-based human microelectrode array prototype.</a> J Neurosci Methods. 185 (2), 264-272 (2010).</li><li>Kodama, T., Hikosaka, K., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+changes+in+glutamate+concentration+in+the+primate+prefrontal+cortex+during+spatial+delayed+alternation+and+sensory-guided+tasks.">Differential changes in glutamate concentration in the primate prefrontal cortex during spatial delayed alternation and sensory-guided tasks.</a> Exp Brain Res. 145 (2), 133-141 (2002).</li><li>Galvan, A., Smith, Y., Wichmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+intracerebral+glutamate+levels+in+awake+monkeys+using+microdialysis+and+enzyme+fluorometric+detection.">Continuous monitoring of intracerebral glutamate levels in awake monkeys using microdialysis and enzyme fluorometric detection.</a> J Neurosci Methods. 126 (2), 175-185 (2003).</li><li>During, M. J., Spencer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+hippocampal+glutamate+and+spontaneous+seizure+in+the+conscious+human+brain.">Extracellular hippocampal glutamate and spontaneous seizure in the conscious human brain.</a> Lancet. 341 (8861), 1607-1610 (1993).</li><li>Reinstrup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+microdialysis+in+clinical+practice:+baseline+values+for+chemical+markers+during+wakefulness,+anesthesia,+and+neurosurgery.">Intracerebral microdialysis in clinical practice: baseline values for chemical markers during wakefulness, anesthesia, and neurosurgery.</a> Neurosurgery. 47 (3), 701-710 (2000).</li><li>Cavus, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+metabolites+in+the+cortex+and+hippocampus+of+epileptic+patients.">Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients.</a> Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).</li></ol>

Greg Gerhardt is de voornaamste eigenaar van Quanteon LLC. Jorge Quintero en Jason Burmeister hebben gediend als consultants tot Quanteon LLC.

Vanaf het begin van het experiment, moet de fysiologische homeostase van de biggen worden gehouden zoals beschreven in dit lab voorafgaande bekendmaking21. Minimale controle moet met name pulse oxymetrie, electrocardiografie, capnography, niet-invasieve bloeddruk en temperatuur. Opgeleide onderzoekers zijn vereist zodat fysiologische verstoringen (b.v.hypo/hyperthermie, hypoxie, hypotensie, aritmie) op de juiste wijze kunnen worden gecorrigeerd.
Voorafgaand aan de inductie, worden in vitro MEA kalibraties uitgevoerd om de functionaliteit en de selectiviteit van de MEA bekende omstandigheden. De kalibratie en de beplating van multilaterale milieu-akkoorden is van cruciaal belang voor het doeltreffend gebruik van de technologie. Er zijn vele mogelijke fouten die zich tijdens de kalibratie voordoen kunnen. Kalibratie herkent deze kwesties evenals onjuiste beplating, die tot onjuiste interferent reactie leidt. Een meer gedetailleerde tabelvorm account van fouten die in MEA reactie optreden kunnen is samengesteld, langs met bekende oorzaken en de voorgestelde oplossingen, die moet blijken te zijn een nuttig instrument voor het waarschijnlijk oplossen (tabel 1). Het is belangrijk op te merken dat het glas referentie-elektrode voorafgaand aan zowel kalibratie en beplating, moet worden gecontroleerd op de aanwezigheid van luchtbellen of witte verkleuring, zoals een negatieve invloed hebben op MEA functie en nauwkeurigheid opnemen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Symptoom</td>
			<td>Oorzaak</td>
			<td>Corrigerende maatregelen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Geen signaal</td>
			<td>Elektrode niet verbonden</td>
			<td>Goed verbinden elektrode headstage en de headstage snel amperometry systeem.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geen macht aan de snelle amperometry-systeem</td>
			<td>Schakelaar op achterzijde snel systeem inschakelen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Signal Noise</td>
			<td rowspan="2">Elektrode besmet door bloed</td>
			<td>Voortdurend de bevloeiing van de hersenen oppervlak tijdens het inbrengen van de elektrode</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spoel de elektrode direct in dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzym coating is los</td>
			<td>Schoon en terrasgedeelte van de elektrode</td>
		</tr>
<tr>
<td>Referentie-elektrode was niet ingevoegd noch bekleed</td>
			<td>Jas en plaats van de referentie-elektrode verder onder de hoofdhuid</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elektrode is het opsporen van verkeer van hersenen oppervlak</td>
			<td>Treedt meestal op in de oppervlakkige structuren. Invoegen van de elektrode dieper (1 mm tegelijk) indien mogelijk</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Dierlijke verkeer</td>
			<td>Dier is onvoldoende beveiligd</td>
			<td>Het dier in de achterste richting verplaatsen naar beter beveiligde earbars op de schedel. Indien nodig, verheffen de romp te voorzien in betere uitlijning van het lichaam.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dier is onvoldoende verdoofd</td>
			<td>Controleer de integriteit van de verdoving apparatuur. Titreer de verdoving om een effectieve dosis en beheren van een intramusculaire rocuronium dosis (5 mg/kg)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Onjuiste elektrode plaatsing</td>
			<td>Elektrode is niet correct uitgelijnd</td>
			<td>Passen de elektrode met behoud van de goede verbinding met de headstage.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Stereotaxic coördinaten zijn onjuist</td>
			<td>Verzekeren dat de biggen atlas wordt verwezen maakt geen gebruik van een andere referentiepunt of een ander vliegtuig van uitlijning.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wees voorzichtig niet te verdoezelen van de hechtdraad merken door te scoren op de schedel.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: instructies voor het oplossen van MEA gebruiken bij biggen. Mogelijke oorzaken en corrigerende maatregelen om te helpen met optimalisatie en probleemoplossing.
Een stereotaxic atlas voor de biggen is gebruikt om te bepalen van de stereotaxic coördinaten van het gebied van belang met betrekking tot een bekend punt zoals bregma18. Oor balken moeten goed worden beveiligd om ervoor te zorgen dat de schedel vlak en volledig geïmmobiliseerdet is. Zorg moet worden genomen tijdens de insnijding van de middellijn van de hoofdhuid om te voorkomen dat het scoren van de schedel, zoals dit van invloed zou kan zijn op de visualisatie van de lijnen van de hechtdraad. Het craniotomy-venster moet groot genoeg zijn om de MEA tegemoet te komen.
Dit protocol bevat een aantal technische uitdagingen waarvoor een goedgevulde operationele suite en een onderzoeker/team ervaren in de chirurgische en verdoving aspecten van het protocol. Het model presenteert bovendien financiële beperkingen in dat de biggen model duurder dan het knaagdier model is; het is echter beduidend minder kostbaar dan het gebruik van niet-menselijke primaten, die duizenden dollars kosten kan. Het gebruik van MEA technologie presenteert zijn eigen uitdagingen, als de procedure van coating en de elektroden handmatig plating vereisen een ervaren onderzoeker of assistent om voldoende selectiviteit en betrouwbare functie. De microelectrodes zelf zijn kwetsbaar, omdat ze zijn gemaakt van keramiek, en dus gemakkelijk beschadigd als juiste waarschuwing niet wordt nageleefd. Microelectrodes zijn onderworpen aan de inmenging van andere elektrische apparaten, die ruis in de opnames kunnen maken, en uit bloed op de operatieve site, die de opname-sites kunt occlude. De behoefte aan gespecialiseerde apparatuur presenteert een extra last, zoals een stereotaxic chirurgische frame moet aangepaste gebouwd om te immobiliseren van de biggen schedel tijdens implantatie. Het stereotaxic frame, glutamaat oxidase, en de elektroden zelf zijn allemaal duur. Bovendien vormt het ontbreken van een stereotaxic atlas van de biggen uit in het laatste decennium technische beperkingen waarvoor specifieke expertise om te bepalen van de specifieke locatie van diepe structuren in de hersenen van de biggen. Ontwikkeling van een nieuwe stereotaxic atlas, misschien met behulp van magnetische resonantie beeldvorming, zou de mogelijkheid tot gebruik van deze technologie in biggen sterk verbeteren.
De biggen is een klinisch relevante model voor de studie van AIN grotendeels te wijten aan de parallellen tussen deze soorten en de menselijke neonate, zoals beide soortgelijke hersenstructuur en ontwikkeling bezitten. In tegenstelling tot de meer gebruikte modellen zoals muizen of ratten heeft de biggen een grotere CNS gelijkenis met mensen, die aan de vertaalbaarheid van de resultaten van het model leent. De biggen model is bovendien goedkoper en minder ingewikkeld behandeling dan een niet-menselijke primaten model omvat. Het model van de biggen is bedoeld om te onderzoeken het proces door die verdoving kan induceren developmental neurotoxiciteit, meten van haar bijdrage aan neurologische schade en bestrijding van de kwestie van schade veroorzaakt door de verstorende variabelen. Hypoxie kan bijvoorbeeld verkeerd worden geïnterpreteerd voor schade veroorzaakt door de verdoving zoals het globale effecten op de hersenen heeft. De biggen wordt gebruikt met dezelfde chirurgische en verdoving voorwaarden als die welke worden gebruikt in de menselijke geneeskunde om ervoor te zorgen betrouwbaarheid van resultaten.
Het gebruik van keramische gebaseerde MEA technologie elimineert verscheidene van de nadelen die de hedendaagse techniek van microdialysis is gekoppeld. Microdialysis heeft een beperkte temporele en ruimtelijke resolutie in vergelijking met amperometrische methoden zoals de MEA, die continu van glutamaat gebeurtenissen in veelvoud registreren kan, microscopische regio's op maximaal 10 Hz-23. Deze snelle samplefrequentie elimineert de storende factor voor de verspreiding van de gelokaliseerde neurotransmitter die inherent is aan langzaam-bemonsteringsmethoden als microdialysis24. Bovendien, is de MEA een minder invasieve methode dan een microdialysis-sonde, die kan leiden tot aanzienlijke gliosis tijdens het inbrengen en neurotransmitter activiteit op de invoeging site22kan wijzigen.
Eerdere studies met behulp van een aantal zoogdieren modellen, meettechnieken en regio's van de hersenen, hebben aangetoond dat basale glutamaat niveaus vergelijkbaar zijn met die gevonden met behulp van deze techniek. Dit suggereert dat MEA technologie, wanneer aangepast aan het model van biggen, geldig opnames van in vivo glutamaat concentratie (tabel 2 biedt).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Auteur (jaar)</td>
			<td>Opname-techniek</td>
			<td>Diermodel</td>
			<td>Leeftijd</td>
			<td>Hersenen regio('s)</td>
			<td>: Basale glutamaat concentratie (µM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hascup et al. (2008)23
</td>
			<td>MEA (enzym-gebaseerd)</td>
			<td>Knaagdier</td>
			<td>20 - 24 weken</td>
			<td>Prefrontale Cortex, Striatum</td>
			<td>3.3 ± 1,0; 5.0 ± 1,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hascup et al. (2010)25
</td>
			<td>MEA (enzym-gebaseerd)</td>
			<td>Knaagdier</td>
			<td>3 - 6 maanden</td>
			<td>Hippocampus</td>
			<td>4.7-10.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rutherford et al. (2007)9
</td>
			<td>MEA (enzym-gebaseerd)</td>
			<td>Knaagdier</td>
			<td>3 - 6 maanden</td>
			<td>Prefrontale Cortex, Striatum</td>
			<td>44.9 ± 4,7; 7.3 ± 0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Miele et al. (1996)26
</td>
			<td>Microdialysis (enzym-gebaseerd)</td>
			<td>Knaagdier</td>
			<td>-</td>
			<td>Striatum</td>
			<td>3.6 ± 0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dag et al. (2006)27
</td>
			<td>MEA (enzym-gebaseerd)</td>
			<td>Knaagdier</td>
			<td>3 - 6 maanden</td>
			<td>Frontale Cortex, Striatum</td>
			<td>1.6 ± 0,3; 1.4 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Quintero et al. (2007)28
</td>
			<td>MEA (enzym-gebaseerd)</td>
			<td>Niet - menselijke primaten</td>
			<td>5.3-5.5 jaar</td>
			<td>Premotor Cortex, motorische Cortex</td>
			<td>3.8 ± 1,7; 3.7 ± 0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stephens et al..  (2010) 29
</td>
			<td>MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)]</td>
			<td>Niet - menselijke primaten</td>
			<td>11 - 21 jaar</td>
			<td>Putamen</td>
			<td>8.53</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kodama et al. (2002)30
</td>
			<td>Microdialysis (enzym-gebaseerd)</td>
			<td>Niet - menselijke primaten</td>
			<td>-</td>
			<td>Prefrontale Cortex</td>
			<td>1.29-2.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>Galvan et al. (2003)31
</td>
			<td>Microdialysis (enzym-gebaseerd)</td>
			<td>Niet - menselijke primaten</td>
			<td>Jonge</td>
			<td>Striatum</td>
			<td>28.74 ± 2.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tijdens en Spencer (1993)32
</td>
			<td>Microdialysis (enzym-gebaseerd)</td>
			<td>Menselijke</td>
			<td>18 - 35 jaar</td>
			<td>Hippocampus</td>
			<td>20.3 ± 6.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reinstrup et al. (2000)33
</td>
			<td>Microdialysis (enzym-gebaseerd)</td>
			<td>Menselijke</td>
			<td>-</td>
			<td>Frontale Cortex</td>
			<td>16 ± 16</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cavus et al. (2005)34
</td>
			<td>Microdialysis (enzym-gebaseerd)</td>
			<td>Menselijke</td>
			<td>15 - 52 jaar</td>
			<td>Neocortex</td>
			<td>2.6 ± 0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Vergelijking van basale extracellulaire glutamaat levelsacross verschillende diermodellen. Een geselecteerd overzicht van studies tot vaststelling van de normale extracellulaire glutamaat niveaus in gezonde wakker en narcose dieren met microdialysis of microelectrodes.
Het gebruik van MEA technologie om te controleren in vivo glutamaat concentraties in het model van de biggen kan zorgen voor de toekomstige evaluatie van Knorretje neurologische resultaten na narcose. Overleving experimenten zijn gepland, die verder inzicht in het langetermijneffect van de verdoving op de neurocognitieve welzijn van menselijke pasgeborenen. Overleving experimenten toestaat voor gedrags testen en monitoring van glutamaat verandert lang na blootstelling van de verdoving. Het is ook gebruikelijk voor kinderen tot en met het ondergaan van narcose in omstandigheden waar ze misschien ervaren fysiologische stress in de vorm van chirurgische interventie. Toekomstige studies adressering van de invloed van chirurgie in termen van neurologische schade en toename in neurotoxiciteit zou mogelijk maken meer nauwkeurige modellering van een gemeenschappelijk klinische setting voor kinderen. Het gebruik van alternatieve diermodellen is ook haalbaar is, zoals de studie van deze verschillende modellen door chronische implantatie, waardoor wij voor het bijhouden van gedragsveranderingen neurotoxiciteit is gekoppeld. MEA technologie zelf is veelzijdig, zodat toekomstige studie niet te beperkt tot de analyse van glutamaat niveaus worden hoeft (bijvoorbeeldGABA, choline, lysine, enz. kon worden geanalyseerd).

Elk jaar, ondergaan miljoenen kinderen anesthesie voor zowel invasief en niet-invasieve procedures in de Verenigde Staten1. Jarenlang, hebben de aanbieders van de verdoving ouders van de veiligheid van de verdoving, zelfs bij kleine kinderen en pasgeborenen gerustgesteld. Echter in 1999 werd geconstateerd dat voorbijgaande verstopping van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA)-subtype van glutamaat receptoren tijdens de vroege leven kan veroorzaken wijdverspreide neuronale apoptosis in ratten2. De FDA onlangs een drug veiligheid mededeling waarvoor de etiketten van verdoving drugs op te nemen van een waarschuwing over algemene verdoving en hun mogelijke negatieve effecten de ontwikkelende hersenen van kinderen jonger dan 3 jaar oud (Amerikaanse Food en Drug Administration, 2017). Er is echter nog steeds een noodzaak om te verhelderen mogelijke mechanismen en potentiële neuroprotectieve maatregelen.
Normale activiteit van neurotransmitters zoals glutamaat en gamma-amino boterzuur (GABA) zijn essentieel voor de normale neurologische optreden. Hoewel de meeste van de routes betrokken in AIN nog steeds ongrijpbaar zijn, zijn neurotransmitter systemen zeer waarschijnlijk te worden betrokken aangezien anesthetica zijn gekend om te moduleren van deze trajecten voor de productie van bewusteloosheid. In het bijzonder veroorzaakt de excitatory neurotransmitter glutamaat excitotoxicity wanneer zijn activiteit dysregulated is. Deze neurotransmitter is normaal betrokken bij neurogenese, Neurale plasticiteit, synaptic en neurale groei en een aantal andere kritisch belangrijke hersenfuncties. Langdurige activering van glutamaat receptoren kan echter leiden tot excitotoxicity en neuronale apoptosis, met name onder stress omstandigheden zoals chirurgie, zuurstof ontbering en verminderde energie beschikbaarheid3. Binden van glutamaat naar de NMDA heeft receptor aangetoond dat nb+ en Cl− toestroom veroorzaken. De daaropvolgende depolarisatie wordt verondersteld te leiden tot Ca2 + kanaal openen en vrijlating van intracellulaire Ca2 + slaat4. Deze dysfunctie waarschijnlijk leidt tot een cascade van metabole verstoringen die uiteindelijk afnemen van neuronale proliferatie, ontsteking verhogen en leiden tot de neuronale dood. Ondanks deze hypothesen blijven de echte mechanism(s) van AIN onduidelijk5. Door haar rol in apoptosis vertegenwoordigt glutamaat disregulatie een nieuwe weg die aan het mechanisme van eerder gedocumenteerd neuronale apoptosis, een functie van AIN bijdragen kan.
Eén van de belemmeringen op de studie van neuronale processen is hun hoge complexiteit, vooral in de omgeving van neuronale ontwikkeling. De eerste paar maanden van het leven zijn de periode van maximale kwetsbaarheid voor letsel, tijdens welke de meeste van de belangrijke stappen van neuronale ontwikkeling zoals fysiologische apoptosis (neuronale snoeien), synaptogenese, gliogenesis en myelinisering nemen plaats6 . Gezien het complexe karakter van de neuronale communicatie en de moeilijkheid om deze processen te bestuderen zonder te onderbreken van de normale functie van de CNS, nieuwe technologieën ontwikkeld die gericht zijn op de in vivo detectie en kwantificering van belangrijke elementen voor neuronale communicatie.
Enzyme-linked MEA technologie werd gebruikt in deze studie als een nieuwe manier om te bestuderen van de mechanismen van AIN in een klinisch relevante Knorretje-model. Deze technologie kan worden gebruikt om complexe in-vivo elektrochemische hersenen processen, met inbegrip van glutamaat disregulatie te bestuderen. De ingebouwde 4-kanaals platina opname sites van de multilaterale milieu-akkoorden (2 glutamaat-gevoelige sites en 2 studiesites) toestaan zichzelf verwijzende, die bijdraagt tot de detectie nauwkeurigheid. Bovendien, een laag van de uitsluiting wordt toegepast op elke elektrode, houdende toekenning selectiviteit door te verhinderen dat andere storende moleculen wordt gedetecteerd7. Bovendien, het ontwerp van de laag-profiel van de MEA zorgt voor minimale weefseltrauma ten opzichte van eerdere technologieën. Deze dezelfde functie verleent aan MEAs een hogere ruimtelijke resolutie, dat de studie van microscopische regio's in de hersenen vergemakkelijkt. Bijvoorbeeld, kunnen afzonderlijke regio's van de hippocampus (getand gyrus, CA1, CA2) specifiek bestudeerde8. Specifieke details over de functionaliteit van multilaterale milieuovereenkomsten geweest eerder beschreven9.
In vergelijking met de MEA elektrochemie, microdialysis omvat een membraan geplaatst tussen de oplossing van belang en een oplossing van soortgelijke samenstelling, waardoor detectie van extracellulaire vloeistof verandert10. Hoewel microdialysis een steunpilaar van neurochemie is en al lange tijd voor de detectie van neurotransmitters gebruikt heeft, heeft het als nadeel van lage tijd resolutie, vertraagde detectie van glutamaat veranderingen en belangrijke weefsel trauma11.
MEA's kunnen niet indirect het detecteren van neurotransmitters zoals glutamaat, acetylcholine en choline, met behulp van passende oxidase enzymen die electroactive verslaggever moleculen zoals H2O2 of O212,13 produceren .
MEA technologie wijd gebruikt in ratten en niet-menselijke primaten voor de studie van neurotoxiciteit in het kader van de pathofysiologische processen dan AIN7,14. Onder sommige van deze pathofysiologische processen, is MEA technologie gebruikt voor de studie van de ziekte van Alzheimer, epilepsie, traumatisch hersenletsel en het effect van farmacologische stoffen op de mededeling van de synaptische8,15 , 16 , 17. Hoewel MEA's zijn gebruikt voor het bestuderen van deze pathologieën in ratten en niet-menselijke primaten, de hoge ontwikkelings gelijkenis tussen mensen en Knorretje hersenen maakt de aanpassing van de MEA technologie bij biggen van een zeer geschikte techniek voor de studie AIN mechanism(s)18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="711">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer</td>
			<td style="width:155px;">PBS Animal Health</td>
			<td style="width:119px;">292-13</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Piglet Anesthesia Face-Cone Mask</td>
			<td style="width:155px;">VetEquip</td>
			<td style="width:119px;">921428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Integra SL Anesthesia Workstation</td>
			<td style="width:155px;">DRE Veterinary</td>
			<td style="width:119px;">2350</td>
			<td style="width:223px;">This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sevoflurane</td>
			<td style="width:155px;">Ultane</td>
			<td style="width:119px;">0074-4456-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rocuronium Bromide Injection</td>
			<td style="width:155px;">Hospira</td>
			<td style="width:119px;">0409-9558-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Medfusion 4000 IV Infusion&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Smiths Medical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax</td>
			<td style="width:155px;">Kopf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Model 1541 Piglet Adaptor</td>
			<td style="width:155px;">Kopf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Infrared Spot Lamp</td>
			<td style="width:155px;">Amazon</td>
			<td style="width:119px;">B000HHQ94C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bair Hugger Torso Blanket</td>
			<td style="width:155px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bair Hugger</td>
			<td style="width:155px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Alcohol Prep Pad</td>
			<td style="width:155px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade</td>
			<td style="width:155px;">Bard-Parker</td>
			<td style="width:119px;">#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel Handel</td>
			<td style="width:155px;">Havel&#39;s</td>
			<td style="width:119px;">HAN-G4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">504615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mosquito Forceps</td>
			<td style="width:155px;">Sklar Surgical Instruments</td>
			<td style="width:119px;">17-1225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze Pads</td>
			<td style="width:155px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">22-246-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adson Tissue Forceps</td>
			<td style="width:155px;">Teleflex</td>
			<td style="width:119px;">181223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dremel 111 Engraving Cutter</td>
			<td style="width:155px;">Amazon</td>
			<td style="width:119px;">Dremel 111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microelectrode Array</td>
			<td style="width:155px;">Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>S2 4Ch MEA; custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Headstage</td>
			<td style="width:155px;">Quanteon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2pA/mV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wire, silver, PFA, .008&#34; Bare, .0110&#34; coated</td>
			<td style="width:155px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:119px;">786500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fine Micromanipulator</td>
			<td style="width:155px;">Narishige Scientific Instrument Lab</td>
			<td style="width:119px;">MO-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of microelectrode array technology for the study of anesthesia-induced neurotoxicity in the intact piglet brain

Elk jaar, ondergaan miljoenen kinderen anesthesie voor een veelheid van procedures. Echter, studies in zowel dieren als mensen hebben op losse schroeven de veiligheid van de narcose bij kinderen, we verdoving als potentieel toxische naar de hersenen in ontwikkeling. Tot op heden geen studies hebben met succes de mechanism(s) toegelicht door die verdoving mogelijk neurotoxische. Dierproeven toestaan onderzoek van dergelijke mechanismen en neonatale biggen vertegenwoordigen een uitstekend model deze effecten als gevolg van hun opvallende developmental gelijkenissen met het menselijk brein te bestuderen.
Dit protocol past het gebruik van micro-elektrode enzym gebaseerde matrix (MEA) technologie als een nieuwe manier om te studeren het mechanism(s) van anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit (AIN). MEA's in staat stellen real-time bewaking van in vivo neurotransmitter activiteit en bieden uitzonderlijke temporele en ruimtelijke resolutie. Het is veronderstelde dat verdoving neurotoxiciteit gedeeltelijk door de glutamaat disregulatie veroorzaakt wordt en MEA's een methode bieden voor het meten van glutamaat. De nieuwe implementatie van MEA technologie in een Knorretje model presenteert een unieke kans voor de studie van AIN.

Deze studie van de proof-of-concept met enzym gebaseerde keramische MEA-technologie in een Knorretje model bieden uitzonderlijke inzicht in de dynamiek van de glutamaat onderliggende AIN. Deze studie verder toont aan dat enzym gebaseerde MEA technologie met succes kan worden aangepast in de biggen model voor het meten van fysiologische en anesthesie-geassocieerde veranderingen in neurotransmitter activiteit met hoge gevoeligheid, en hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Fysiologische homeostase werd gehandhaafd gedurende onze experimenten met behulp van klinisch relevante methoden en normen, en geen Knorretje tentoongesteld tekenen van fysiologische verstoringen.
De verkregen gegevens geeft aan het vermogen van MEA's precies en ruimtelijk oplossen metingen van de neurotransmitter in de hersenen van de corticale en sub-corticale structuren. Het gebruik van een stereotaxic apparaat kunt duidelijke identificatie van een referentie oppervlaktestructuur (bregma) om consequent Zoek de regio van belang, ongeacht de individuele verschillen in de grootte van de biggen en anatomie. Duidelijke visualisatie van de hechtingen vergemakkelijkt een consistente regionale plaatsing van de MEA met nauwkeurigheid in het bereik van de micrometer (Figuur 4). Het verkrijgen van toegang tot de corticale oppervlak van de hersenen is minimaal traumatische met te verwaarlozen bloeden, ervoor te zorgen dat alle glutamaat in vivo dynamiek niet als gevolg van onopzettelijk systemische of lokale belediging (Figuur 5). De aangepaste, stijve MEA wordt vervolgens uitgelijnd loodrecht op het frontale vlak van de biggen (Figuur 6). Niet goed uitgelijnd de MEA voorafgaand aan de invoegpositie kan voorkomen dat nauwkeurige ruimtelijke opname van de gerichte regio, met name voor subcorticale regio's.
Real-time in vivo glutamaat metingen werden genomen in de hippocampi van 3-4-daagse oud biggen (n = 4) onder 2,5-3% Sevofluraan anesthesie (ongeveer 1 MAC). Amperometry metingen werden opgenomen bij 4 Hz en geconverteerd naar concentratie met behulp van een lineaire regressie op basis van Calibratieparameters (Figuur 8paneel A). Voor elk punt van de tijd, waren de signalen van de twee sites van glutamaat-gevoelige gemiddeld voordat het gemiddelde sentinel signaal naar een gecorrigeerde glutamaat signaal opbrengst afgetrokken. Deze continue metingen werden gladgestreken door toepassing van een voortschrijdend gemiddelde om de algehele trend na verloop van tijd (Figuur 8deelvenster B) beter te visualiseren. De gemiddelde basale glutamaat concentratie was berekend op 4.61 ± 0,02 µM en relatief stabiel gebleven in de loop van de blootstelling van de verdoving. Voorbijgaande glutamaterge activiteit in één dier werd geïdentificeerd door het analyseren van de pieken in het signaal dat waren niet gecorreleerd met het sentinel-signaal (R2 < 0,5) en een signaal-ruisverhouding van 3 (Figuur 9paneel A) overschreden. Een totaal van 116 tijdelijke pieken geconstateerd over een periode van 3,5 h (Figuur 10paneel A). De amplitude van de resulterende voorbijgaande pieken werd over het algemeen waargenomen als gasgroep 1 µM (Figuur 10deelvenster B). Om het kwantificeren van de duur van elke voorbijgaande aard, is de tijd (t-80) die nodig is voor elke piekwaarde van de maximale aan het verval van 80% (Figuur 9deelvenster B) verkregen. De gemiddelde t-80 van alle glutamaat transiënten 3,5 h opname periode was 4.68 ± 0.82 s (Figuur 10deelvenster C). Deze gegevens tonen aan dat het mogelijk is te nauwkeurig meten zowel langdurige en voorbijgaande neurotransmitter activiteit in een subcorticale regio van de hersenen van de narcose biggen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig1.jpg"> Figuur 1: visuele vergelijking van SG-2 micro-elektrode matrix typen. SG-2 matrices bevatten twee glutamaat-gevoelige sites en twee glutamaat-ongevoelig studiesites (150 µm x 20 µm per site). ()A) een flexibele-as micro-elektrode-matrix wordt weergegeven aan de linkerkant. De stijve-schacht micro-elektrode-matrix werd speciaal ontworpen voor gebruik in biggen en vergunningen dieper implantatie in grote dieren. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig2.jpg"> Figuur 2: overzicht van micro-elektrode matrix voorbereiding en kalibratie proces. De totale MEA voorbereiding en kalibratie duren ongeveer een week. De coating enzym, uitsluiting laag en kalibratie analyten zijn specifiek voor de neurotransmitter van belang. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig3.jpg"> Figuur 3: plaatsing van biggen in het stereotaxic apparaat. De monding van de biggen is geplaatst op mond bar direct posterieure aan de hoektanden. De doordringende oor balken worden ingevoegd in de oorkanalen teneinde het posterieure einde van de schedel. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig4.jpg"> Figuur 4: plaatsing van biggen in het stereotaxic apparaat voor craniotomy. (A) de biggen's hoofd is strak beveiligd binnen het aangepaste stereotaxic frame, zorgen voor consistente plaatsing van de MEA. Equidistante plaatsing van doordringende oor balken is zichtbaar. (B) Midline anterior-posterior incisie langs de hoofdhuid. Scoring van de schedel werd vermeden te visualiseren coronale en Sagittaal hechtingen en optimaliseren van de visualisatie van bregma. De bar van de schaal wordt weergegeven om aan te geven van de relatieve grootte van de incisie en de locatie van craniotomy venster. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig5.jpg"> Figuur 5: Craniotomy voor toegang tot de hippocampus. (A) de hoofdhuid verder doorgevoerd om de geschatte locatie van de invoegpositie MEA volgens stereotaxic coördinaten bloot te stellen. Het omcirkelde gebied is gemarkeerd (zwarte) voor het begeleiden van de craniotomy. (B) het craniotomy-venster (0,25 cm2) met schedel klep verwijderd om de onderliggende dura mater bloot te stellen. (C) de hersenvliezen zorgvuldig verwijderd om oppervlakkige hersenschors zonder weefseltrauma bloot te stellen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig6.jpg"> Figuur 6: MEA positionerings- en inbrengen in de hippocampus. (A) plaatsing van MEA op de bregma om te bepalen van een relatieve stereotaxic locatie van de hippocampus. (B) Stereotaxic plaatsing van de MEA op de hersenen oppervlak om te bepalen van de diepte van de hippocampus inbrengen. Zilveren pseudo-referentie-elektrode wordt veilig onder de hoofdhuid (aangegeven door de pijl) geplaatst. (C) de MEA ingevoegd op de juiste diepte te krijgen real-time, in vivo extracellulaire glutamaat metingen in de hippocampus. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig7.jpg"> Figuur 7: MEA gedrag tijdens de periode van de 30-min baselining. De snelle stijging van de eerste komt overeen met de afdaling van de MEA in de hippocampus met behulp van de micromanipulator. De basislijn periode begint zodra de MEA de juiste diepte (gestippelde lijn bereikt). Extracellulaire glutamaat metingen zal afnemen over een periode van 30 min en moeten niet worden geïnterpreteerd als fysiologische lezingen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig8.jpg"> Figuur 8: Real-time extracellulaire glutamaat metingen in de hippocampus van een neonatale varken onder verdoving Sevofluraan. (A) de bewegende gemiddelde van de concentratie van de glutamaat in de hippocampus van een neonatale varken onder Sevofluraan verdoving (met 10 gegevenspunten). Metingen werden genomen op 4Hz gedurende 3 uur na een korte 30 min baselining periode. (B) Smoothing van glutamaat metingen met behulp van een voortschrijdend gemiddelde van 100 punten elke 15 min naar de trend beter te visualiseren. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig9.jpg"> Figuur 9: identificatie van voorbijgaande glutamaat activiteit in de hippocampus van een neonatale varken onder verdoving Sevofluraan. (A) voorbijgaande glutamaat toppen (in rood) zijn aangegeven op de real-time glutamaat-tracering. Pieken werden beschouwd als belangrijke wanneer de signaal / ruisverhouding 3 overschreden en hun signaal was niet gecorreleerd met het sentinel-signaal (R2 < 0,5). (B) een representatieve voorbijgaande piek in Figuur 9paneel Avastgesteld. Onderbroken lijnen geven de totale duur die nodig is voor de piek verval van 80%. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig10.jpg"> Figuur 10: karakterisering van glutamaat transiënten in de hippocampus van een neonatale varken onder verdoving Sevofluraan. (A) A aantal voorbijgaande glutamaat pieken in 15 minuten bakken. Pieken werden beschouwd als belangrijke wanneer de signaal / ruisverhouding 3 overschreden en hun signaal was niet gecorreleerd met het sentinel-signaal (R2 < 0,5). (B) de amplitude van voorbijgaande glutamaat pieken. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde. (C) betekent T80 van voorbijgaande glutamaat pieken. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain at JoVE.com

Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain

Aanpassing van micro-elektrode Array technologie voor de studie van anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit in de hersenen Intact Knorretje

Deze studie verkent het nieuwe gebruik van enzym gebaseerde micro-elektrode matrix (MEA) technologie om te controleren in vivo neurotransmitter activiteit bij biggen. De hypothese was dat glutamaat disregulatie draagt bij aan het mechanisme van verdoving neurotoxiciteit. Hier presenteren we een protocol aan te passen van MEA technologie om te bestuderen van het mechanisme van anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit.

Every year, millions of children undergo anesthesia for a multitude of procedures. However, studies in both animals and humans have called into question ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Schaalbare fluïde Injector-arrays voor Virale Targeting van Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

High-density EEG-registraties van de vrij bewegende muizen met behulp van Polyimide op basis van micro-elektrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisatie van proprioceptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en poppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Opnemen van elektrische activiteit van geïdentificeerde neuronen in de intacte hersenen van transgene Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulatie van Cerebellaire Korrel Neuronen<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Om te studeren Neuronale morfologie en Migratie

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Het olfactorisch systeem als model om axonale groeipatronen en morfologie Bestudeer<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Micro-elektrode Begeleide Implantatie van elektroden in de nucleus subthalamicus van Rats naar Lange termijn Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Chronische implantatie van geheel-corticale Electrocorticographic Array in de gemeenschappelijke Hapalomys

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...