Name: adaptation of microelectrode array technology for the study of anesthesia-induced neurotoxicity in the intact piglet brain
Uploaded: 2018-05-12T14:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain at JoVE.com

Författarna vill erkänna bidrag från University of Kentucky Center for mikroelektrod teknik (CenMeT), och den Ohio State University laboratorium djur Resource Center (ULAR).

Smågrisar (Sus scrofa) tas emot via en lokal gård lånelöfte av The Ohio State University (OSU) institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC). Efter godkännande av protokollet, djur experimenterande görs i enlighet med IACUC politik.
1. smågrisar och Nasse hantering
<ol><li>Utnyttja manliga och kvinnliga smågrisar på ett systematiskt och randomiserade sätt att eliminera eventuella potentiella könstillhörighet confounders enligt ankomst riktlinjer19. Obs: Eftersom maximal hjärnans tillväxt är inom 3-5 dagar efter Nasse födelse, görs experiment enbart med smågrisar 3-5 dagar gammal.</li>
	<li>För smågrisar ska anlända i ett vivarium minst 24 h innan experiment att låta acklimatisering till miljön. Obs: Utbildad veterinär personal ger rutin djurvård. Smågrisarna hålls i individuellt temperatur-underhålls, kontinuerligt övervakade burar och få en näringsmässigt komplett mjölk replacer ad libitum för att förhindra hypoglykemi. Smågrisarna hålls också utan mjölk ersättning (nil per os), för minst 3 h före anestesi och levereras med filtar och leksaker att säkerställa normala nivåer av stimulering. Om möjligt, hålla flera smågrisar i samma bur att tillåta socialisering.</li>
</ol>2. utveckling och anpassning av åtgärder för AIN studier i en Nasse modell
Obs: Denna teknik använder enzym-baserade MEAs som pre belagd med enzym och elektropläteras med m-Fenylendiamin sapropterindihydroklorid (mPD). Elektroderna var anpassade designad med 40 mm styva skaft och tillverkad för användning i smågrisar (figur 1).
<ol><li>För att undvika redundans, se den detaljerade beskrivningen av MEA förberedelse och kalibrering som tidigare beskrivits15 (figur 2).</li>
</ol>3. anestesi och användning av anpassade Stereotaxic apparater för Griseknoen
<ol><li>Söva djur med en anestesi-arbetsstation med en lämplig ventilatorn och övervakningsenheter och övervaka fysiologiska parametrar såsom pulsoximetri, icke-invasivt blodtryck, EKG och temperatur under hela den helhet av experimentet beskrivs som tidigare19. Intubation och ventilera smågrisarna och administrera sevofluran anestesi på 1 minsta alveolära koncentrationen (MAC) (cirka 2,5-3%) för 3,5 h. Kontrollera att utbildad laboratoriepersonal medlemmar är närvarande för dessa experiment. Päls som överliggande det kirurgiska området tas bort med elektriska hårklippningsmaskiner före beredning av huden. Obs: Koncentration och varaktigheten av bedövningsmedel som används tillåter experimentet att simulera tid-längden på faktiska anestesi exponering under ett kirurgiskt ingrepp. Sevofluran är dessutom mest ofta används narkos i den pediatriska populationen att göra undersökningen kring dess säkerhet av yttersta vikt.</li>
	<li>Innan placering i stereotaxic ramen, starta en rokuronium lastning dos på 2,5 mg/kg och en infusion av 1,5 mg/kg/h att förhindra djurförflyttningar medan säkrade i ramen.<ol>
<li>Placera Griseknoen i ramen Nasse-specifika stereotaxic när en tillräcklig djup anestesi bekräftas av tå-nypa.</li>
		<li>Ge tillräcklig vaddering inom ramen stereotaxic genom att placera Griseknoen på en Tvingad-air värmande pad med extra stoppning (t.ex., fluidiserad lägesställaren) att förebygga trycksår.</li>
		<li>Placera tänderna av övernäbben över tanden bar (figur 3). Obs: Baren tand bör vara på en tillräcklig nivå att hålla skallen mycket stadigt på plats.</li>
		<li>Fixa och dra åt de genomträngande öra barerna inom öron, noga med för att säkerställa att Griseknoen i mittlinjen position. Ställning de spetsiga tips av lateralen har inom den öra kanalen och infoga örat barer stadigt nog för att höra ”pop” ljudet är associerad med genomträngningen av trumhinnan. Stadigt bifoga öra barerna i skallen och infoga till lika djup på varje sida för att förhindra förflyttning av skallen under experimentet (figur 4Panel A). Obs: Det är livsviktigt att värma Griseknoen (~ 37,8-38,6 ° C) och kontinuerligt övervaka temperaturen under hela förfarandet för underhåll av normothermia. Detta kan vara fulländad via en filt eller en värmelampa. Var noga med att placera lampan värme på ett lämpligt avstånd för att undvika att bränna av djurets hud.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Skapa en 4-6 cm mittlinjen snitt längs skallen med försiktighet för att undvika scoring skallen med en skalpell. När snittet görs, Använd mild indragning och trubbig dissektion för att höja hårbotten från skallen. Försiktigt skrubba skallen med en kompress att ta bort eventuella bindväv och exponera de sutur linjerna (figur 4Panel B). Obs: Det är inte nödvändigt att upprätthålla sterilitet under icke-survival experiment. Sterilitet måste dock bibehållas under överlevnad experiment.</li>
	<li>Vidare återspegla hårbotten, om nödvändigt, att exponera området av intresse och ta reda på den tilltänkta platsen för kraniotomi (figur 5Panel A). Använd en kirurgiska borr för att skapa en kraniotomi fönster ca 0,25 cm2 (kan vara större eller mindre beroende på experimentella mål) överliggande struktur av intresse, med försiktighet för att inte skada dura eller underliggande hjärnan (figur 5 , Panel B). Använd fina kirurgisk sax för att punktskatt dura överliggande hjärnvävnad (figur 5Panel C).</li>
	<li>Placera elektroden så lodrätt som möjligt över bregma genom att säkra headstage till micromanipulator av den Nasse stereotax metall arm. Lägre elektroden så mycket som möjligt utan att vidröra ytan av skallen. Spela in koordinaterna för bregma (figur 6Panel A).<ol>
<li>Fastställa främre-bakre och mediala-laterala koordinater samt djupet av strukturera av intresse som de hänför sig till bregma. Fastställa de stereotaxic koordinaterna med hjälp av arter och åldersanpassad stereotaxic atlas. I det här fallet Använd en stereotaxic atlas som utvecklats speciellt för smågrisar20.</li>
		<li>Flytta elektroden så att den har rätt främre-bakre och mediala-laterala plats, se till att både mikroelektrod och apparaten är vinkelrätt mot ytan. Plats pseudo referenselektroden under hårbotten, att säkerställa kontakt med djuret (figur 6Panel B).</li>
		<li>Långsamt och försiktigt, sänka elektroden till lämpligt djup i hjärnan med hjälp av den stereotaxic arm. För den slutliga 2 mm, använda en hydraulisk microdrive att ytterligare driva elektroden till den exakta placeringen (figur 6Panel C). Obs: Elektroden ställning bör överträffar fönstret kraniotomi. Elektroden Djupet varierar beroende på hjärnans struktur av intresse. Det är inte nödvändigt att stänga snittet efter avslutad datainsamling i icke-survival experiment.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mätning av extracellulära glutamat Under sevofluran anestesi
<ol><li>Säkerställa att Nasse är under kontinuerlig fysiologiska övervakning under hela proceduren. Smågrisar bedövas inhalationally (via ansikte cone) i förberedelse för förfarandet.</li>
	<li>Efter implantation av MEA, vänta 30 min för att elektroden att nå baslinjen för att säkerställa att korrekt mätning kommer att erhållas för 3 h (figur 7).</li>
	<li>0,25% bupivakain (1 mL/kg) administreras subkutant på platsen för operation för postoperativ smärtlindring. Dessutom ges sustained release buprenorfin subkutant q72h som behövs.</li>
</ol>5. perfusion och offer
<ol><li>Utför du genomblödning och hjärnan vävnad samling procedurer som tidigare beskrivits21. För icke-survival operationer, är djur avlivas omedelbart efter experimenterande medan fortfarande under narkos.</li>
	<li>Ta brutto tvärsnitt av fast Nasse hjärnan och använda ljusmikroskopi för att visualisera spåret av elektroden som tidigare beskrivits22 att möjliggöra verifiering av MEA placering, att säkerställa korrekt placering i området av intresse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hall, M. J., DeFrances, C. J., Williams, S. N., Golosinskiy, A., Schwartzman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+hospital+discharge+Survey:+2007+summary.">National hospital discharge Survey: 2007 summary.</a> Natl Health Stat Report. (29), 1-24 (2010).</li><li>Ikonomidou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+NMDA+receptors+and+apoptotic+neurodegeneration+in+the+developing+brain.">Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain.</a> Science. 283 (5398), 70-74 (1999).</li><li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+neurotrophic+factors+in+neuronal+plasticity+and+disease.">Glutamate and neurotrophic factors in neuronal plasticity and disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1144 (1), 97-112 (2008).</li><li>Atlante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+neurotoxicity,+oxidative+stress+and+mitochondria.">Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria.</a> FEBS Lett. 497 (1), 1-5 (2001).</li><li>Kavitha, J., Durga, P., Ramachandran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhalational+agents+in+anesthesia+induced+developmental+neurotoxicity+-+Recent+advances.">Inhalational agents in anesthesia induced developmental neurotoxicity - Recent advances.</a> Trends in Anaesthesia and Critical Care. 11 (1), 14-18 (2016).</li><li>Zanghi, C. N., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+holistic+approach+to+anesthesia-induced+neurotoxicity+and+its+implications+for+future+mechanistic+studies.">A holistic approach to anesthesia-induced neurotoxicity and its implications for future mechanistic studies.</a> Neurotoxicol Teratol. 60 (2), 24-32 (2017).</li><li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+real-time+monitoring+of+glutamate+and+electrophysiology+from+cortex+to+hippocampus+in+mice+based+on+a+microelectrode+array.">In situ real-time monitoring of glutamate and electrophysiology from cortex to hippocampus in mice based on a microelectrode array.</a> Sensors (Basel). 17 (1), 1-8 (2016).</li><li>Hinzman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+brain+injury+elevates+tonic+glutamate+levels+and+potassium-evoked+glutamate+release+in+discrete+brain+regions+at+two+days+post-injury:+an+enzyme-based+microelectrode+array+study.">Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study.</a> J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).</li><li>Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Str&#246;mberg, I., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+second-by-second+measures+of+L-glutamate+in+the+central+nervous+system+of+freely+moving+rats.">Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats.</a> J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).</li><li>Benveniste, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microdialysis.">Brain microdialysis.</a> J Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).</li><li>Kohno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+detection+of+changes+in+brain+extracellular+glutamate+levels.">An improved method for the detection of changes in brain extracellular glutamate levels.</a> J Neurosci Methods. 81 (1-2), 199-205 (1998).</li><li>Hascup, K. N., Hascup, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+techniques+for+subsecond+neurotransmitter+detection+in+live+rodents.">Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents.</a> Comp Med. 64 (4), 249-255 (2014).</li><li>Rooij, N. F., Koudelka-Hep, M., Frey, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+microprobe+array+for+in+vivo+monitoring+of+neurotransmitters.">Biosensor microprobe array for in vivo monitoring of neurotransmitters.</a> EPFL. , (2010).</li><li>Fan, X. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+glutamate+levels+decrease+in+a+non-human+primate+model+of+dopamine+deficiency.">Cortical glutamate levels decrease in a non-human primate model of dopamine deficiency.</a> Brain Res. 1552, 34-40 (2014).</li><li>Hunsberger, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+enzyme-based+biosensors+to+measure+tonic+and+phasic+glutamate+in+Alzheimer's+mouse+models.">Using enzyme-based biosensors to measure tonic and phasic glutamate in Alzheimer's mouse models.</a> J Vis Exp. (123), (2017).</li><li>Hill, A. J., Jones, N. A., Williams, C. M., Stephens, G. J., Whalley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+multi-electrode+array+screening+for+anticonvulsants+in+acute+rat+brain+slices.">Development of multi-electrode array screening for anticonvulsants in acute rat brain slices.</a> J Neurosci Methods. 185 (2), 246-256 (2010).</li><li>Defranchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+assessment+of+micro-electrode+chip+assay+as+a+method+of+detecting+neurotoxicity+in+vitro.">Feasibility assessment of micro-electrode chip assay as a method of detecting neurotoxicity in vitro.</a> Front Neuroeng. 4 (6), (2011).</li><li>Whitaker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+piglet+model+for+the+study+of+anesthetic-induced+developmental+neurotoxicity+(AIDN):+A+translational+neuroscience+approach.">Use of a piglet model for the study of anesthetic-induced developmental neurotoxicity (AIDN): A translational neuroscience approach.</a> J Vis Exp. (124), (2017).</li><li>Kilkenny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).</li><li>Salinas-Zeballos, M., Ceballos, G., Gootman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the developing swine (Sus scrofa) forebrain. , 887-906 (1986).</li><li>Whitaker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+clinically+relevant+use+of+a+piglet+model+to+study+the+effects+of+anesthetics+on+the+developing+brain.">A novel, clinically relevant use of a piglet model to study the effects of anesthetics on the developing brain.</a> Clin Transl Med. 5 (1), (2016).</li><li>Hascup, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+of+the+effects+of+chronic+implantation+of+ceramic-based+microelectrode+arrays+and+microdialysis+probes+in+rat+prefrontal+cortex.">Histological studies of the effects of chronic implantation of ceramic-based microelectrode arrays and microdialysis probes in rat prefrontal cortex.</a> Brain Res. , 12-20 (2009).</li><li>Hascup, K. N., Hascup, E. R., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-by-second+measures+of+L-Glutamate+and+other+neurotransmitters+using+enzyme-based+microelectrode+arrays.">Second-by-second measures of L-Glutamate and other neurotransmitters using enzyme-based microelectrode arrays.</a> The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 324 (2), 725-731 (2008).</li><li>Rice, M. E., Cragg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+spillover+after+quantal+release:+rethinking+dopamine+transmission+in+the+nigrostriatal+pathway.">Dopamine spillover after quantal release: rethinking dopamine transmission in the nigrostriatal pathway.</a> Brain Res Rev. 58 (2), 303-313 (2008).</li><li>Hascup, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microelectrode+measurements+and+the+origin+and+regulation+of+extracellular+glutamate+in+rat+prefrontal+cortex.">Rapid microelectrode measurements and the origin and regulation of extracellular glutamate in rat prefrontal cortex.</a> Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1608-1620 (2010).</li><li>Miele, M., Boutelle, M. G., Fillenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+source+of+physiologically+stimulated+glutamate+efflux+from+the+striatum+of+conscious+rats.">The source of physiologically stimulated glutamate efflux from the striatum of conscious rats.</a> J Physiol. 497 (Pt 3), 745-751 (1996).</li><li>Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+array+studies+of+basal+and+potassium-evoked+release+of+L-glutamate+in+the+anesthetized+rat+brain.">Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain.</a> J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).</li><li>Quintero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amperometric+measures+of+age-related+changes+in+glutamate+regulation+in+the+cortex+of+rhesus+monkeys.">Amperometric measures of age-related changes in glutamate regulation in the cortex of rhesus monkeys.</a> Exp Neurol. 208 (2), 238-246 (2007).</li><li>Stephens, M. L., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+glutamate+measurements+in+the+putamen+of+awake+rhesus+monkeys+using+an+enzyme-based+human+microelectrode+array+prototype.">Real-time glutamate measurements in the putamen of awake rhesus monkeys using an enzyme-based human microelectrode array prototype.</a> J Neurosci Methods. 185 (2), 264-272 (2010).</li><li>Kodama, T., Hikosaka, K., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+changes+in+glutamate+concentration+in+the+primate+prefrontal+cortex+during+spatial+delayed+alternation+and+sensory-guided+tasks.">Differential changes in glutamate concentration in the primate prefrontal cortex during spatial delayed alternation and sensory-guided tasks.</a> Exp Brain Res. 145 (2), 133-141 (2002).</li><li>Galvan, A., Smith, Y., Wichmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+intracerebral+glutamate+levels+in+awake+monkeys+using+microdialysis+and+enzyme+fluorometric+detection.">Continuous monitoring of intracerebral glutamate levels in awake monkeys using microdialysis and enzyme fluorometric detection.</a> J Neurosci Methods. 126 (2), 175-185 (2003).</li><li>During, M. J., Spencer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+hippocampal+glutamate+and+spontaneous+seizure+in+the+conscious+human+brain.">Extracellular hippocampal glutamate and spontaneous seizure in the conscious human brain.</a> Lancet. 341 (8861), 1607-1610 (1993).</li><li>Reinstrup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+microdialysis+in+clinical+practice:+baseline+values+for+chemical+markers+during+wakefulness,+anesthesia,+and+neurosurgery.">Intracerebral microdialysis in clinical practice: baseline values for chemical markers during wakefulness, anesthesia, and neurosurgery.</a> Neurosurgery. 47 (3), 701-710 (2000).</li><li>Cavus, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+metabolites+in+the+cortex+and+hippocampus+of+epileptic+patients.">Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients.</a> Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).</li></ol>

Greg Gerhardt är huvudägare i Quanteon LLC. Jorge Quintero och Jason Burmeister har tjänat som konsulter till Quanteon LLC.

Från början av experimentet upprätthållas de Nasses fysiologiska homeostas som beskrivs i denna lab's offentliggörande21. Minimal övervakning bör omfatta pulsoximetri, EKG, capnography, icke-invasivt blodtryck och temperatur. Utbildad utredare krävs så att fysiologiska störningar (t.ex., hypo/hypertermi, hypoxi, hypotoni, arytmi) kan korrigeras på rätt sätt.
Före induktion utförs in vitro- MEA kalibreringar för att fastställa funktionalitet och selektivitet av MEA kända villkor. Den kalibrering och plätering av åtgärder är avgörande för effektiv användning av tekniken. Det finns många potentiella fel som kan uppstå under kalibreringen. Kalibrering kan identifiera dessa frågor samt felaktig plätering, vilket leder till felaktiga interferens svar. En mer detaljerad tabell hänsyn till fel som kan uppstå i MEA svar har sammanställts, längs med anmärkningsvärda orsaker och föreslagna lösningar, som bör bevisa ett användbart instrument för sannolikt felsökning (tabell 1). Det är viktigt att notera att glas referenselektroden före kalibrering och plätering, bör kontrolleras för förekomst av luftbubblor eller vit missfärgning, som antingen kommer att negativt påverka MEA funktion och inspelning noggrannhet.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Symptom</td>
			<td>Orsak</td>
			<td>Korrigerande åtgärder</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Ingen Signal</td>
			<td>Elektroden inte ansluten</td>
			<td>Korrekt ansluta elektroden till headstage och headstage till snabb amperometry system.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ingen ström till snabb amperometry systemet</td>
			<td>Slå på strömbrytaren på baksidan av FAST system</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Signal brus</td>
			<td rowspan="2">Elektrod som förorenats av blod</td>
			<td>Kontinuerligt vattna hjärnan ytan under elektroden införande</td>
		</tr>
<tr>
<td>Skölj elektroden omedelbart i dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzymet beläggning är lös</td>
			<td>Rengör och övermålningsbar elektroden</td>
		</tr>
<tr>
<td>Referenselektroden var inte införas eller belagda</td>
			<td>Päls och placera referenselektroden längre under hårbotten</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elektroden är att upptäcka rörelse av hjärnans yta</td>
			<td>Uppstår oftast i ytliga strukturer. Infoga elektroden djupare (1 mm åt gången) om möjligt</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Djurförflyttningar</td>
			<td>Djur är otillräckligt säkrade</td>
			<td>Flytta djuret i posterior riktning till bättre säkert earbars på skallen. Om nödvändigt, höja bålen för bättre kropp anpassning.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Djur är otillräckligt sövd</td>
			<td>Kontrollera integriteten för utrustningen som bedövningsmedel. Titrera bedövningsmedlet till en effektiv dos och administrera en intramuskulär rokuronium dosen (5 mg/kg)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Felaktig elektrodplacering</td>
			<td>Elektroden är inte korrekt justerad</td>
			<td>Justera elektroden bibehållen korrekt anslutning till headstage.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Stereotaxic koordinater är felaktiga</td>
			<td>Säkerställa att Nasse atlas refererade inte använder en annan referenspunkt eller ett annat plan för anpassningen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Var noga med att inte dölja markeringarna sutur genom poängsättning skallen.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: instruktioner för felsökning av MEA Använd i smågrisar. Möjliga orsaker och korrigerande åtgärder för att hjälpa till med optimering och felsökning.
En stereotaxic atlas för Griseknoen används för att bestämma de stereotaxic koordinaterna för området av intresse med avseende på en känd punkt såsom bregma18. Öra barer bör säkras ordentligt för att säkerställa att skallen är nivå och helt orörlig. Försiktighet iakttas under mittlinjen snitt i hårbotten att undvika scoring skallen eftersom detta kan påverka visualisering av suturen raderna. Kraniotomi fönstret bör vara tillräckligt stor för att rymma MEA.
Detta protokoll presenterar ett antal tekniska utmaningar som kräver en välfylld operativa svit och en utredare/team skickliga kirurgiska och bedövningsmedel aspekter av protokollet. Modellen presenterar dessutom ekonomiska begränsningar i att Nasse modellen är dyrare än gnagare modellen; Det är dock betydligt mindre kostsamt än användning av icke-mänskliga primater, som kan kosta tusentals dollar. Användning av MEA teknik presenterar sina egna utmaningar, som förfarandet för beläggning och plätering elektroderna manuellt kräver en skicklig prövaren eller assistent att säkerställa tillräcklig selektivitet och pålitlig funktion. Mikroelektroder själva är ömtåliga, eftersom de är gjorda av keramik, och således lätt skadas om lämplig försiktighet inte beaktas. Mikroelektroder är föremål för störningar från andra elektriska apparater, som kan skapa brus i inspelningar, och blod vid operationsstället, som kan absorbera inspelning webbplatser. Behovet av specialutrustning presenterar en ytterligare börda som en stereotaxic kirurgiska ram måste vara anpassade byggd för att immobilisera Nasse skallen under implantation. Den stereotaxic ramen, glutamat oxidas och elektroderna själva är alla kostsamma. Dessutom utgör bristen på en Nasse stereotaxic atlas från inom det senaste decenniet tekniska begränsningar som kräver särskild sakkunskap att avgöra specifika platsen för djupa strukturer i hjärnan Nasse. Utveckling av en ny stereotaxic atlas, kanske med magnetkamera, skulle kraftigt öka möjligheten att använda denna teknik på smågrisar.
Griseknoen är en kliniskt relevant modell för studier av AIN till stor del på grund av de paralleller som finns mellan denna art och mänskliga nyfödda, som båda besitter liknande hjärnans struktur och utveckling. Till skillnad från vanliga modeller såsom möss eller råttor har Griseknoen en större CNS likheten till människor, som lånar till översättbarhet av modellens resultat. Nasse modellen är dessutom billigare och innebär mindre komplicerad hantering än en icke-mänskliga primater modell. Nasse modell är avsedd att granska processen av som anestesi kan inducera utvecklingsmässiga neurotoxicitet, mäta dess bidrag till neurologiska skador och bekämpa frågan om skador orsakade av confounding variabler. Hypoxi kan exempelvis misstolkas för skador orsakade av anestetika har globala effekter på hjärnan. Griseknoen utnyttjas med samma kirurgiska och bedövningsmedel villkor som de som används inom humanmedicinen för att säkerställa trohet av resultat.
Användningen av keramik-baserad MEA teknik eliminerar flera av de nackdelar som är associerad med den moderna tekniken med mikrodialys. Mikrodialys har begränsad tidsmässig och rumslig upplösning jämfört med amperometrisk metoder såsom MEA, som glutamat händelser kan kontinuerligt registreras i flera, mikroskopiska områden på upp till 10 Hz23. Denna snabba samplingsfrekvens eliminerar störande faktorn för lokaliserade signalsubstansen diffusion som är inneboende till långsam-provtagningsmetoder som mikrodialys24. MEA är dessutom en mindre invasiv metod än en mikrodialys probe som kan orsaka betydande gliosis under införande och kan förändra neurotransmittor aktivitet på insättningspunktens plats22.
Tidigare studier utnyttjar en rad däggdjur modeller, mätteknik och regioner av hjärnan, har visat basala glutamat nivåer jämförbara med de som finns med denna teknik. Detta tyder på att MEA-tekniken, när anpassas till Nasse modellen, ger giltig inspelningar i vivo glutamat koncentration (tabell 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Författare (år)</td>
			<td>Inspelningsteknik</td>
			<td>Djurmodell</td>
			<td>Ålder</td>
			<td>Hjärnan-regioner</td>
			<td>Menar basala glutamat koncentration (µM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hascup et al. (2008)23
</td>
			<td>MEA (enzym-baserade)</td>
			<td>Gnagare</td>
			<td>20 - 24 veckor</td>
			<td>Prefrontala Cortex, Striatum</td>
			<td>3.3 ± 1,0; 5,0 ± 1,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hascup et al. (2010)25
</td>
			<td>MEA (enzym-baserade)</td>
			<td>Gnagare</td>
			<td>3 - 6 månader</td>
			<td>Hippocampus</td>
			<td>4.7-10,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rutherford et al. (2007)9
</td>
			<td>MEA (enzym-baserade)</td>
			<td>Gnagare</td>
			<td>3 - 6 månader</td>
			<td>Prefrontala Cortex, Striatum</td>
			<td>44,9 ± 4,7; 7,3 ± 0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Miele et al. (1996)26
</td>
			<td>Mikrodialys (enzym-baserade)</td>
			<td>Gnagare</td>
			<td>-</td>
			<td>Striatum</td>
			<td>3.6 ± 0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dag et al. (2006)27
</td>
			<td>MEA (enzym-baserade)</td>
			<td>Gnagare</td>
			<td>3 - 6 månader</td>
			<td>Frontala Cortex, Striatum</td>
			<td>1,6 ± 0,3; 1,4 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Quintero et al. (2007)28
</td>
			<td>MEA (enzym-baserade)</td>
			<td>Icke - mänskliga primater</td>
			<td>5,3-5,5 år</td>
			<td>Premotor Cortex, motoriska Cortex</td>
			<td>3,8 ± 1,7; 3,7 ± 0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stephens et al.  (2010) 29
</td>
			<td>MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)]</td>
			<td>Icke - mänskliga primater</td>
			<td>11 - 21 år</td>
			<td>Putamen</td>
			<td>8,53</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kodama et al. (2002)30
</td>
			<td>Mikrodialys (enzym-baserade)</td>
			<td>Icke - mänskliga primater</td>
			<td>-</td>
			<td>Prefrontala Cortex</td>
			<td>1.29-2,21</td>
		</tr>
<tr>
<td>Galvan et al. (2003)31
</td>
			<td>Mikrodialys (enzym-baserade)</td>
			<td>Icke - mänskliga primater</td>
			<td>Juvenil</td>
			<td>Striatum</td>
			<td>28.74 ± 2,73</td>
		</tr>
<tr>
<td>Under och Spencer (1993)32
</td>
			<td>Mikrodialys (enzym-baserade)</td>
			<td>Mänskliga</td>
			<td>18 - 35 år</td>
			<td>Hippocampus</td>
			<td>20,3 ± 6,6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reinstrup et al. (2000)33
</td>
			<td>Mikrodialys (enzym-baserade)</td>
			<td>Mänskliga</td>
			<td>-</td>
			<td>Frontala Cortex</td>
			<td>16 ± 16</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cavus et al. (2005)34
</td>
			<td>Mikrodialys (enzym-baserade)</td>
			<td>Mänskliga</td>
			<td>15 - 52 år</td>
			<td>Neocortex</td>
			<td>2,6 ± 0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2. Jämförelse av basala extracellulära glutamat levelsacross olika djurmodeller. En valda genomgång av studier om normal extracellulär glutamat nivåer i friska vaken och sövda djur med mikrodialys eller mikroelektroder.
Användning av MEA-teknik för att övervaka i vivo glutamat koncentrationer i Nasse modellen kan tillåta för framtida utvärdering av Nasse neurologiska utfall efter anestesi. Överlevnad experiment har planerats, vilket kommer att ytterligare förståelse för den långsiktiga inverkan av anestesi på neurokognitiva välbefinnande mänskliga nyfödda. Överlevnad experiment kommer att möjliggöra beteendemässiga testning och övervakning av glutamat förändringar långt efter anestesi exponering. Det är också vanligt att barn genomgå anestesi under förhållanden där de kan uppleva fysiologisk stress i form av kirurgiska ingrepp. Framtida studier att hantera påverkan av kirurgi i form av neurologiska skador och ökning i neurotoxicitet skulle möjliggöra mer korrekt modellering av en gemensam klinisk miljö för barn. Användning av alternativa djurmodeller är också möjligt, som är studiet av dessa olika modeller genom kronisk implantation, tillåter oss att spåra beteendeförändringar som är associerad med neurotoxicitet. MEA tekniken själv är mångsidig, så framtida studie inte behöver begränsas till analys av glutamat nivåer (t.ex., GABA, kolin, lysin, etc. kan analyseras).

Varje år genomgå miljontals barn anestesi för både invasiva och icke-invasiva procedurer i USA1. I åratal har anestesi leverantörer lugnade föräldrar av anestetika, även hos små barn och nyfödda. Dock i 1999 konstaterades att övergående blockering av N-metyl-D-aspartat (NMDA) subtyp av glutamatreceptorer under uppväxt kunde orsaka utbredda neuronala apoptos i råttor2. FDA släppte nyligen, en drog säkerhet kommunikation som kommer att kräva etiketterna anestetiska läkemedel att inkludera en varning om allmänna bedövningsmedel och deras potentiella negativa inverkan på barn yngre än 3 år gammal utveckla hjärnor (US Food och Drug Administration, 2017). Dock finns det fortfarande ett behov av att klarlägga möjliga mekanismer och potentiella nervskyddande åtgärder.
Normal aktivitet av neurotransmittorer som glutamat och gamma-amino smörsyra (GABA) är kritiska för normalt neuroutvecklingssjukdomar inträffa. Även om de flesta av vägarna som är inblandade i AIN är fortfarande gäckande, är neurotransmittorsystemet mycket sannolikt att vara inblandade eftersom bedövningsmedel är kända för att modulera dessa vägar för att producera medvetslöshet. I synnerhet orsakar excitatoriska signalsubstansen glutamat excitotoxicitet när dess aktivitet är dysreglerad. Denna neurotransmittor är normalt inbegripna i neurogenes, neural plasticitet, synaptic och neurala tillväxt och ett antal andra kritiskt viktiga hjärnfunktioner. Långvarig aktivering av glutamatreceptorer kan dock orsaka excitotoxicitet och neuronala apoptos, särskilt under stress förhållanden såsom kirurgi, syrebrist och minskad energi tillgänglighet3. Bindning av glutamat till NMDA har receptorn visat sig orsaka Na+ och Cl− tillströmning. Den efterföljande depolarisation tros leda till Ca2 + kanal öppning och frisläppandet av intracellulära Ca2 + lagrar4. Denna dysfunktion som sannolikt leder till en kaskad av metabola derangemang introducerades som så småningom minskar neuronal spridning, öka inflammation och leda till neuronala dödsfall. Trots dessa hypoteser förblir de sanna mekanismerna Ain oklart5. På grund av dess roll i apoptos representerar glutamat dysreglering en ny väg som kan bidra till mekanismen av tidigare dokumenterat neuronala apoptos, en funktion i AIN.
Ett av hindren på studiet av neuronala processer är deras hög komplexitet, särskilt i fastställandet av neuronal utveckling. De första månaderna av livet är perioden av maximal sårbarhet för skada, under vilket de flesta av de viktiga stegen i neuronal utveckling såsom fysiologiska apoptos (neuronala beskärning), synaptogenes och gliogenesis myelinisering ta plats6 . Med tanke på den komplicerade karaktären av neuronal kommunikation och svårigheten att studera dessa processer utan att störa normala CNS-funktion, har ny teknik utvecklats som syftar till i vivo detektering och kvantifiering av viktiga element neuronal kommunikation.
Enzymkopplad MEA teknik användes i denna studie som ett nytt sätt att studera mekanismerna i AIN i en kliniskt relevant Nasse modell. Denna teknik kan användas för att studera komplexa i vivo elektrokemiska processer i hjärnan, inklusive glutamat dysreglering. Inbyggda 4-kanals platina inspelning webbplatser av de multilaterala miljöavtal (2 glutamat-känsliga platser och 2 sentinel platser) kan självrefererande, vilket bidrar till identifiering noggrannhet. Dessutom ett utanförskap skikt appliceras på varje elektrod, ger selektivitet genom att förhindra andra störande molekyler ifrån upptäckt7. Den låg profil designen av MEA tillåter dessutom minimal vävnad trauma jämfört med tidigare teknik. Denna samma funktion ger till MEAs högre spatial upplösning, vilket underlättar studier av mikroskopiska regioner i hjärnan. Diskreta regioner i hippocampus (dentate gyrus, CA1, CA2) kan till exempel vara specifikt studerade8. Specifika detaljer om funktionerna i MEAs har varit tidigare beskrivna9.
I jämförelse med MEA elektrokemi, mikrodialys innehåller ett membran som placeras mellan lösningen av intresse och en lösning med liknande sammansättning, möjliggör detektering av extracellulär vätska ändrar10. Mikrodialys är en stöttepelare i neurokemi och har länge använts för detektion av neurotransmittorer, har men nackdelen med låg tidsupplösning, försenad upptäckt av glutamat förändring, och betydande vävnad trauma11.
MEAs kan indirekt identifiera neurotransmittorer som glutamat, acetylkolin och kolin, med hjälp av lämpliga oxidas enzymer som producerar elektroaktiva reporter molekyler såsom H2O2 eller O212,13 .
MEA-tekniken har använts i råttor och icke-mänskliga primater för studien av neurotoxicitet i samband med patofysiologiska processer än AIN7,14. Bland några av dessa patofysiologiska processer, har MEA teknologi använts för studier av Alzheimers sjukdom, epilepsi, traumatisk hjärnskada och effekten av farmakologisk föreningar på synaptisk kommunikation8,15 , 16 , 17. även om MEAs har använts för att studera dessa patologier i råttor och icke-mänskliga primater, hög utvecklingsmässiga likheten mellan människor och Nasse hjärnor gör anpassning av MEA tekniken hos smågrisar en mycket lämplig teknik för att studera AIN mekanismerna18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="711">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer</td>
			<td style="width:155px;">PBS Animal Health</td>
			<td style="width:119px;">292-13</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Piglet Anesthesia Face-Cone Mask</td>
			<td style="width:155px;">VetEquip</td>
			<td style="width:119px;">921428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Integra SL Anesthesia Workstation</td>
			<td style="width:155px;">DRE Veterinary</td>
			<td style="width:119px;">2350</td>
			<td style="width:223px;">This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sevoflurane</td>
			<td style="width:155px;">Ultane</td>
			<td style="width:119px;">0074-4456-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rocuronium Bromide Injection</td>
			<td style="width:155px;">Hospira</td>
			<td style="width:119px;">0409-9558-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Medfusion 4000 IV Infusion&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Smiths Medical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax</td>
			<td style="width:155px;">Kopf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Model 1541 Piglet Adaptor</td>
			<td style="width:155px;">Kopf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Infrared Spot Lamp</td>
			<td style="width:155px;">Amazon</td>
			<td style="width:119px;">B000HHQ94C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bair Hugger Torso Blanket</td>
			<td style="width:155px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bair Hugger</td>
			<td style="width:155px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Alcohol Prep Pad</td>
			<td style="width:155px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade</td>
			<td style="width:155px;">Bard-Parker</td>
			<td style="width:119px;">#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel Handel</td>
			<td style="width:155px;">Havel&#39;s</td>
			<td style="width:119px;">HAN-G4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">504615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mosquito Forceps</td>
			<td style="width:155px;">Sklar Surgical Instruments</td>
			<td style="width:119px;">17-1225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze Pads</td>
			<td style="width:155px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">22-246-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adson Tissue Forceps</td>
			<td style="width:155px;">Teleflex</td>
			<td style="width:119px;">181223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dremel 111 Engraving Cutter</td>
			<td style="width:155px;">Amazon</td>
			<td style="width:119px;">Dremel 111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microelectrode Array</td>
			<td style="width:155px;">Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>S2 4Ch MEA; custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Headstage</td>
			<td style="width:155px;">Quanteon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2pA/mV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wire, silver, PFA, .008&#34; Bare, .0110&#34; coated</td>
			<td style="width:155px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:119px;">786500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fine Micromanipulator</td>
			<td style="width:155px;">Narishige Scientific Instrument Lab</td>
			<td style="width:119px;">MO-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of microelectrode array technology for the study of anesthesia-induced neurotoxicity in the intact piglet brain

Varje år genomgå miljontals barn anestesi för en mångfald av förfaranden. Dock har studier på både djur och människor ifrågasatt säkerheten av anestesi hos barn, ifrågasätta bedövningsmedel som potentiellt giftiga för hjärnans utveckling. Hittills har inga studier framgångsrikt klarlagd mekanismerna som anestesi kan vara neurotoxiska. Djurstudier möjliggöra undersökning av sådana mekanismer och neonatal smågrisar representerar en utmärkt modell för att studera dessa effekter på grund av sin slående utvecklingsmässiga likheter med den mänskliga hjärnan.
Detta protokoll anpassar användningen av enzym-baserade mikroelektrod array (MEA) teknik som ett nytt sätt att studera mekanismerna för anestesi-inducerad neurotoxicitet (AIN). MEAs aktivera övervakning i realtid av i vivo signalsubstans aktivitet och erbjuder enastående temporal och spatial upplösning. Det är en hypotes om att narkos neurotoxicitet orsakas delvis av glutamat dysreglering och MEAs erbjuder en metod att mäta glutamat. Romanen genomförandet av MEA teknik i en Nasse modell presenterar en unik möjlighet för studier av AIN.

Proof-of-concept studien med enzym-baserade keramiska MEA teknik i en Nasse modell kan ge enastående inblick i glutamat dynamiken bakom AIN. Denna studie ytterligare visar att enzym-baserade MEA teknik framgångsrikt kan anpassas i Nasse modellen att mäta fysiologiska och anestesi-associerade förändringar i signalsubstans aktivitet med hög känslighet, och hög rumsliga och tidsmässiga upplösning. Fysiologiska homeostas bibehölls under hela våra experiment med kliniskt relevanta metoder och standarder och ingen Nasse uppvisade tecken på fysiologiska störningar.
Uppgifterna anger MEAs förmåga att just och rumsligt lösa signalsubstansen mätningar i kortikala och subkortikala hjärnstrukturer. Användningen av en stereotaxic apparat ger tydlig identifiering av en referens ytstruktur (bregma) för att konsekvent lokalisera regionen av intresse, oavsett individuella skillnader i Nasse storlek och anatomi. Tydlig visualisering av suturerna underlättar konsekvent regionala placering av MEA med noggrannhet i intervallet mikrometer (figur 4). Att få tillgång till den kortikala ytan av hjärnan är minimalt traumatiska försumbar blödning, se till att någon i vivo glutamat dynamics inte på grund av oavsiktlig systemiska eller lokala förolämpning (figur 5). Anpassade, styv MEA justeras sedan vinkelrätt mot frontala planet av Griseknoen (figur 6). Underlåtenhet att korrekt anpassa MEA före isättning kan hindra korrekt rumsliga inspelning av den berörda regionen, särskilt för subkortikala regioner.
Realtid i vivo glutamat mätningar togs i hippocampi av 3-4-dagars gamla smågrisar (n = 4) under 2,5-3% sevofluran anestesi (cirka 1 MAC). Amperometry mätningar registreras vid 4 Hz och omvandlas till koncentration med hjälp av en linjär regression utifrån kalibreringsparametrar (figur 8Panel A). För varje tidpunkt, var signalerna från de två glutamat-känsliga platserna i genomsnitt innan subtrahera i genomsnitt sentinel signalen att ge en signal om korrigerade glutamat. Dessa kontinuerliga mätningar var slätade genom att tillämpa ett glidande medelvärde för att bättre visualisera den övergripande trenden över tid (figur 8Panel B). Den genomsnittliga basala glutamat koncentrationen beräknades vara 4,61 ± 0,02 µM och förblev relativt stabil under loppet av bedövningsmedel exponering. Övergående glutamatergic aktivitet identifierades hos ett djur genom att analysera toppar i signalen som inte var korrelerade med sentinel-signalen (R2 < 0.5) och överskred en signal-brus-förhållandet 3 (figur 9Panel A). Sammanlagt 116 övergående toppar upptäcktes under en period av 3,5 h (figur 10Panel A). Amplituden av de resulterande övergående topparna observerades generellt vara inom intervallet 1 µM (figur 10Panel B). För att kvantifiera varaktigheten av varje övergående, erhölls den tid (t80) som krävs för varje maximalt toppvärde att förfalla 80% (figur 9Panel B). Den genomsnittliga t80 av alla glutamat transienter under perioden 3,5 h inspelning var 4.68 ± 0,82 s (figur 10Panel C). Dessa data visar att det är möjligt att exakt mäta både långvarig och övergående signalsubstans aktivitet i en subkortikala region av hjärnan som sövda Nasse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig1.jpg"> Figur 1: visuell jämförelse av SG-2 mikroelektrod matristyper. SG-2 arrayer innehåller två glutamat-känslig och två glutamat-okänsliga sentinel platser (150 µm x 20 µm per plats). (A) en flexibel-axel mikroelektrod matris visas till vänster. Styv-axel mikroelektrod matrisen var specialdesignade för användning i smågrisar och tillstånd djupare implantation i stora djur. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig2.jpg"> Figur 2: översikt över mikroelektrod array förberedelse och kalibrering. Totala MEA förberedelse och kalibrering pågå ungefär en vecka. Beläggning enzym, utslagning lagret och kalibrering analyter är specifika för signalsubstansen sevärdheter. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig3.jpg"> Figur 3: placering av Nasse i den stereotaxic apparaten. Nasse munnen placeras på munnen bar direkt posteriort hörntänderna. De genomträngande öra barerna infogas i örat kanalerna att fäst bakre änden av skallen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig4.jpg"> Figur 4: placering av Nasse i den stereotaxic apparaten för kraniotomi. (A) Nasses huvud skyddas ordentligt inom ramen för det anpassade stereotaxic, att säkerställa konsekvent placering av MEA. Ekvidistanta placering av genomträngande öra barer är synlig. (B) mittlinjen främre-bakre snitt längs hårbotten. Poängsättning av skallen undveks för att visualisera koronalt och sagittal suturer och optimera visualisering av bregma. Skalstapeln visas för att indikera den relativa storleken på snittet och placeringen av kraniotomi fönster. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig5.jpg"> Figur 5: kraniotomi för tillgång till hippocampus. (A), hårbotten ytterligare reflekterat för att exponera den ungefärliga platsen om MEA insättningspunkten enligt stereotaxic koordinater. Inringade området markeras (svart prick) för att vägleda kraniotomi. (B), fönstret kraniotomi (0,25 cm2) med skalle viftar bort för att avslöja underliggande dura mater. (C) hjärnhinnorna försiktigt bort för att exponera ytliga hjärnbarken utan vävnad trauma. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig6.jpg"> Figur 6: MEA positionering och införande i hippocampus. (A) placering av MEA på bregma att bestämma ett relativ stereotaxic läge av hippocampus. (B) Stereotaxic placering av MEA på hjärnans yta att bestämma hippocampus införande djupet. Silver pseudo referenselektrod hänförts säkert hårbotten (indikeras av pilen). (C), MEA infogas på lämpligt djup att få realtid, in-vivo extracellulära glutamat mätningar i hippocampus. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig7.jpg"> Figur 7: MEA beteende under perioden 30-min baselining. Den första snabba ökningen motsvarar nedstigningen av MEA i hippocampus med hjälp av micromanipulator. Den baseline-perioden börjar när MEA har nått lämpligt djup (streckad linje). Extracellulära glutamat mätningar minskar under en period på 30 min och bör inte tolkas som fysiologiska mätvärden. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig8.jpg"> Figur 8: realtid extracellulära glutamat mätningar i hippocampus en neonatal gris under sevofluran anestesi. (A) de rörliga genomsnittliga glutamat koncentration i hippocampus en neonatal gris under sevofluran anestesi (med 10 datapunkter). Måtten togs på 4Hz för 3 h efter en kort 30 min baselining. (B) utjämning av glutamat mätningar med ett glidande medelvärde för 100 poäng varje 15 min att bättre visualisera trenden. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig9.jpg"> Figur 9: identifiering av övergående glutamat aktivitet i hippocampus av en neonatal gris under sevofluran anestesi. (A) övergående glutamat toppar (i rött) indikeras på realtid glutamat spårning. Toppar ansågs betydande när signal-brusförhållandet överskred 3 och deras signal var inte korrelerad med sentinel-signalen (R2 < 0.5). (B) en representativ övergående toppen identifieras i figur 9Panel A. Streckade linjer visar den totala längden som krävs för topp mot röta 80%. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig9large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig10.jpg"> Figur 10: karakterisering av glutamat transienter i hippocampus av en neonatal gris under sevofluran anestesi. (A) A antal övergående glutamat toppar i 15 min lagerplatser. Toppar ansågs betydande när signal-brusförhållandet överskred 3 och deras signal var inte korrelerad med sentinel-signalen (R2 < 0.5). (B), amplituden av övergående glutamat toppar. Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet. (C) menar T80 av övergående glutamat toppar. Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig10large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain at JoVE.com

Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain

Anpassning av mikroelektrod Array teknik för studier av anestesi-inducerad neurotoxicitet i intakt Nasse hjärnan

Denna studie undersöker roman användningen av enzym-baserade mikroelektrod array (MEA) teknik för att övervaka i vivo signalsubstans aktivitet hos smågrisar. Hypotesen var att glutamat dysreglering bidrar till mekanismen av bedövningsmedel neurotoxicitet. Här presenterar vi ett protokoll för att anpassa MEA teknik för att studera mekanismen för anestesi-inducerad neurotoxicitet.

Every year, millions of children undergo anesthesia for a multitude of procedures. However, studies in both animals and humans have called into question ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Skalbar fluidic Injektor arrayer för Viral Inriktning av intakt 3-D Brain Kretsar

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Hög densitet EEG inspelningar av fritt rörliga Möss med Polyimid-baserade mikroelektrod

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver och puppor

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Inspelning elektrisk aktivitet från Identifierade nervceller i den intakta hjärnan av transgen fisk

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologiska inspelning i hjärnan i Intact vuxna zebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation av Cerebellar granulneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Att studera neuronal morfologi och migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Luktsystemet som en modell för att studera axonal tillväxt Mönster och morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Mikro Guidad Implantation av elektroder i nucleus subthalamicus av råttor för långsiktigt Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Kronisk Implantation av hela-kortikala Electrocorticographic matris i Marmosettapa

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...