Name: derivation of human embryonic stem cells by immunosurgery
Uploaded: 2007-12-13T00:28:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery at JoVE.com

AEC is een fellow van de Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research en Merck Research Laboratories. Wij danken D. Egli en C. Cowan voor experimentele advies en discussie.

<html> Ingevroren menselijke embryo&#39;s worden gebruikt voor menselijke embryonale stamcellen (hES) cel afleiding werden geschonken voor onderzoek na goed geïnformeerde toestemming onder onderzoeksprotocollen die werden beoordeeld en goedgekeurd door zowel de commissie voor het gebruik van menselijke proefpersonen en het embryonale stamcelonderzoek toezichtscommissie aan de Harvard Universiteit . Schriftelijk protocol hieronder is gebaseerd op gepubliceerde parameters gerapporteerd door Cowan et al.. 2004, met lichte wijzigingen. Embryo Cultuur Dooi menselijke embryo&#39;s met behulp van Quinn&#39;s Advantage Kit Ontdooi en cultuur in druppels van Global medium aangevuld met 15% Plasmanate tot ontwikkeling aan de uitgebreide blastocyst stadium. Immunosurgery op basis van isolatie van de binnenste celmassa Bereiding: <ol><li> Bereid je platen voor het verwijderen van de zona pellucida en immunosurgery (zie hieronder) door het opzetten van druppels van elke oplossing in 10cm platen. Overlay met minerale olie om verdamping te voorkomen. Bereid een enkele rij per embryo bedoeld voor afleiding. <ul><li> EmbryoMax Zure Tyrodes, te gebruiken zoals het is. </li><li> hES cell afleiding media: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum vervanging, 10% Plasmanate, 2,5% ES-cel-getest foetaal bovine serum (FBS), 2mm Glutamax-I, 1% niet-essentiële aminozuren, 50 eenheden / ml penicilline, streptomycine 50μg/ml, 0.055mM b-mercapto-ethanol, 5ng/ml bFGF. </li><li> Konijn anti-humaan rode bloedcellen primaire antilichaam, gereconstitueerd volgens de fabrikant de suggestie, verdund tot 1:10 met HES cel afleiding media. </li><li> Cavia complement serum, gereconstitueerd volgens de fabrikant de suggestie, verdund tot 1:10 met HES cel afleiding media. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_9_18_6/574_Figure-01.png" alt="574_Figure-01" width="600" height="166" /> </li></ul></li><li> Evenwicht alle platen tot 37 ° C in weefselkweek incubator voor gebruik. </li><li> Pull 50μl-100μl capillaire pipetten (VWR) voor gebruik in de overdracht van embryo&#39;s. Gesneden eindigt met diamant pen en te gebruiken met de mond pipet buis voorzien van een 0.2μm filter. </li></ol> Immunosurgery Procedure: Opmerkingen: <ul><li> In deze procedure worden cellen van de trophectoderm vernietigd door korte blootstelling aan antilichamen gericht tegen menselijke cellen in combinatie met complement activiteit. Daarom is het protocol werkt het beste met een hoge kwaliteit embryo&#39;s met een intact trophectoderm, omdat alleen de structurele integriteit van de blastocyst voorkomt dat de ICM uit ook gevoelig zijn voor de immunologische reactie. </li><li> Alle procedures uitgevoerd met behulp van een dissectie bereik uitgerust met verwarmde podium. </li></ul> Stappen: <ol><li> De mond spoelen pipet om gebruikt te worden voor de embryo transfer met FBS om embryo&#39;s te voorkomen plakken. </li><li> Transfer blastocyst van cultuur schotel naar hES houden druppel van AT schotel. </li><li> Begin de procedure door de overdracht van blastocyt van Hes druppel door reeks van AT druppels. In de derde drop, pas op voor ontbinding van de zona pellucida (meestal 5 tot 30 seconden). Wees niet te over-te behandelen of embryo integriteit kan worden aangetast. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_2/574_Figure-02.png" alt="574_Figure-02" width="551" height="273" /> </li><li> Overdracht door de blastocyst serie van hES cel afleiding media daalt tot af te spoelen AT. Vooraf laden pipet met media is aan te raden om meteen te neutraliseren AT reactie. Blastocysten kan hier worden gehouden totdat alle zijn AT-verwerkt. </li><li> Overdracht blastocyst door reeks primaire antistof druppels, waardoor in de derde dalen gedurende 30 minuten incubatie bij 37 ° C in een weefselkweek incubator. </li><li> Overdracht door de blastocyst serie van hES cel afleiding media valt af te spoelen primair. </li><li> Overdracht blastocyst door reeks van complement druppels, waardoor er in de derde dalen om naar te kijken voor de lysis van trophectoderm cellen. Let op blastocyst voor de eerste 30 seconden op het podium voor &quot;borrelen&quot; van trophectoderm cellen als ze lyseren. Als lysis wordt waargenomen binnen deze termijn, blijven schotel op microscoop podium om de reactie tot aan de voltooiing te controleren. Als er geen borrelende wordt waargenomen tijdens de eerste 30 seconden terug te keren naar incubator, controleren elke 5 minuten tot de meeste van de trophectoderm heeft gelyseerd. Dit kan 5-15 minuten. Monitor reactie nauw samen om de reactietijd en de potentiële schade aan de binnenste celmassa te minimaliseren. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_3/574_Figure-03.png" alt="574_Figure-03" width="571" height="273" /> </li><li> Overdracht door de blastocyst serie van hES cel afleiding media valt te wassen te vullen activiteit. </li><li> Met behulp van glazen pipet met een diameter die iets kleiner dan de blastocyst (getrokken van 10μl VWR capillaire buizen), trek de blastocyst omhoog en omlaag om ontdoen grootste deel van de gelyseerde trophectoderm. g &quot;alt =&quot; 574_Figure-0 &quot;width =&quot; 577 &quot;height =&quot; 270 &quot;/&gt; </li><li> Plaat ICM isoleren op feeder cellen van mitotisch geïnactiveerd muis embryo fibroblasten (MEFs). MEF moeten worden voorbereid op de dag voor afleiding en is overgeschakeld naar hES cell afleiding media dag van. 4-goed NUNC gerechten werken goed voor de eerste stappen van afleiding. </li><li> Niet storen plaatje voor de eerste 1-2 dagen. Daarna, dagelijks controleren op uitgroei van embryonale stamcellen kolonies (meestal na 1-2 weken zichtbaar). Media moet worden veranderd in half volumes om de andere dag begint op dag 3. </li></ol> ES-cel uitgroei en passage Wanneer de hES cel uitgroei heeft ongeveer 0,5 mm of meer bereikt, is het klaar voor de uitbreiding door mechanische plukken. <ol><li> Mechanisch verspreiden de helft van de uitgroei en transfer naar nieuwe platen met verse feeders. Embryonale stamcellen groepjes moet worden ongeveer 30-50 cellen per stuk. Laat andere helft van de uitgroei als een back-up voor de eerste passage (p1). De uitgroei (p0) kan worden gekozen uit verschillende periodes, omdat het blijft groeien. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_5/574_Figure-05.png" alt="574_Figure" width="639" height="219" /> </li><li> Secundaire kolonies kunnen op dezelfde manier worden verspreid en uitgebreid over grotere cultuur gerechten tot passages 3-5, op welk moment de nieuwe cellijnen kunnen worden aangepast aan enzymatische passage met trypsine. Het serum gehalte van de cultuur media moeten ook geleidelijk worden verlaagd tot 1% en 0% tijdens deze eerste passages te ES celdifferentiatie te minimaliseren. </li><li> Alle gevestigde embryonale stamcellijnen moet worden dwarshelling van bevriezing van een deel van de vroege passages voor toekomstige uitbreidingen. </li><li> Daarnaast moet elke cellijn worden gekenmerkt door karyotype analyse en gevalideerd door pluripotentie en differentiatie studies in vitro en in vivo. </li></ol>

<ol>
	<li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts.">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Het protocol hier gepresenteerde biedt onderzoekers met een beknopte, gemakkelijk te volgen schets van hoe je afleiden menselijke embryonale stamcellijnen door immunosurgical isolatie van de binnenste celmassa.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Quinn's Advantage Thaw Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sage</td>
<td>ART-8016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Global medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Global</td>
<td>GMGB-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmanate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Talecris</td>
<td>61325</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EmbryoMax Acidic Tyrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon/Millipore</td>
<td>MR-004-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KO-DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>10829-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KO-Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ES cell-tested fetal bovine serum, Defined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30070.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamax-I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>35050-079</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>11140-076</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15070-063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant human basic fibroblast growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13256-029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Beta-mercaptoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>21985-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit anti-human red blood cell primary antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rockland</td>
<td>109-4139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guinea-pig complement serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-1639</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouth pipettes with tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>supplied with capillary pipettes from VWR</td>
</tr>
<tr>
<td>0.2 microm Acrodisc syringe filter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pall Life Sciences</td>
<td>PN4192</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25300-120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NUNC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse embryonic fibroblasts (E12.5)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

derivation of human embryonic stem cells by immunosurgery

Het vermogen van menselijke embryonale stamcellen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in alle celtypen van het lichaam, suggereert dat zij een grote belofte voor zowel de medische toepassingen en als een research tool voor het aanpakken van fundamentele vragen bij ontwikkeling en ziekte vast te houden. Hier bieden wij een beknopte, stap-voor-stap protocol voor de winning van menselijke embryonale stamcellen uit embryo&#39;s door immunosurgical isolatie van de binnenste celmassa.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery at JoVE.com

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Afleiding van menselijke embryonale stamcellen door Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Verspreiding van menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Peilen naar Mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Chromatine immunoprecipitatie van menselijke embryonale stamcellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Cultuur en onderhoud van menselijke embryonale stamcellen

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Chromosomale Spread Voorbereiding van menselijke embryonale stamcellen voor Karyotypering

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Invriezen en ontdooien van menselijke embryonale stamcellen

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Afleiding van Mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...