Name: derivation of human embryonic stem cells by immunosurgery
Uploaded: 2007-12-13T00:28:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery at JoVE.com

AEC является членом Джейн Гроб Чайлдс Мемориального фонда медицинских исследований и Merck Research Laboratories. Мы благодарим Д. Эгли и К. Коуэн для экспериментальных советы и обсуждения.

<html> Замороженные эмбрионы человека для человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) ячейка вывода были переданы для исследования следующих надлежащего информированного согласия при исследованиях протоколов, которые были рассмотрены и одобрены обеими комитета по использованию человеческих предметов и эмбриональных стволовых клеток комитет по надзору в Гарвардском университете . Письменный протокол ниже, основывается на опубликованных параметров сообщает Коуэн и соавт. 2004 года, с небольшими изменениями. Эмбрион культуры Оттепель человеческих эмбрионов использованием преимуществ Куинна Kit оттепели и культуры в каплях глобальной среде с 15% до Plasmanate развития расширил стадии бластоцисты. Применение специфических иммунных сывороток в хирургии изоляции на основе из внутренней клеточной массы Способ приготовления: <ol><li> Подготовка пластин для снятия зона pellucida и применение специфических иммунных сывороток в хирургии (см. ниже) путем создания капель каждого раствора в 10 см плит. Наложение с минеральным маслом, чтобы предотвратить испарение. Подготовка одной строке для каждого эмбриона предназначен для вывода. <ul><li> EmbryoMax Кислотные Tyrodes, используйте как есть. </li><li> ЭСК ячейка вывода средств массовой информации: 75% КО-DMEM, 10% КО-сыворотка замены, 10% Plasmanate, 2,5% ЭСК проверенные эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ Glutamax-I, 1% без незаменимых аминокислот, 50 единиц / мл пенициллина, стрептомицина 50μg/ml, 0,055 мм б-меркаптоэтанол, 5ng/ml bFGF. </li><li> Кролик анти-человеческий красных кровяных клеток первичного антитела, восстановленная в соответствии с предложением производителя, разбавленных в 1:10 со средствами массовой информации ЭСК ячейки вывода. </li><li> Морских свинок дополнением сыворотки, восстановленного в соответствии с предложением производителя, разбавленных в 1:10 со средствами массовой информации ЭСК ячейки вывода. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_9_18_6/574_Figure-01.png" alt="574_Figure-01" width="600" height="166" /> </li></ul></li><li> Уравновешивать все пластины до 37 ° С в культуре ткани инкубатор перед использованием. </li><li> Вытяните 50 мкл-100 мкл капиллярной пипетки (VWR) для использования в передаче эмбрионов. Отрежьте концы с алмазным пером и использования в рот трубку пипетки оснащен 0,2 мкм фильтр. </li></ol> Применение специфических иммунных сывороток в хирургии процедуры: Примечания: <ul><li> В этой процедуре клетки трофэктодермы разрушаются кратковременное воздействие антител, направленных против человеческих клеток в сочетании с дополнением деятельности. Таким образом, протокол работает лучше всего с высоким качеством эмбрионов с интактной трофэктодермы, так как только структурную целостность бластоцисты предотвращает от ICM также восприимчивы к иммунологической реакции. </li><li> Все процедуры осуществляется с помощью вскрытия рамки оснащены подогревом стадии. </li></ul> Шаги: <ol><li> Прополоскать рот пипеткой, которые будут использоваться для переноса эмбриона с ФБС, чтобы предотвратить эмбрионов придерживаться. </li><li> Передача бластоцисты из культуры блюдо ЭСК холдинга капли AT блюдо. </li><li> Начните процедуру передачи бластоцисты из ЭСК перепад серии AT капель. В третьем раскрывающемся, следите за роспуск зона pellucida (обычно 5-30 секунд). Будьте осторожны, чтобы не чрезмерно лечения или эмбриона целостность может быть нарушена. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_2/574_Figure-02.png" alt="574_Figure-02" width="551" height="273" /> </li><li> Трансфер бластоциста через ряд средств массовой информации ЭСК ячейка вывода капель чтобы смыть AT. Предварительная загрузка пипетки со средствами массовой информации рекомендуется сразу же нейтрализовать AT реакции. Бластоцисты могут быть проведены здесь, пока все было AT-обработке. </li><li> Трансфер бластоциста через ряд первичных капель антитела, оставляя в третьем раскрывающемся в течение 30 минут инкубации при температуре 37 ° С в культуре ткани инкубатора. </li><li> Трансфер бластоциста через ряд средств массовой информации ЭСК ячейка вывода капель чтобы смыть первичной. </li><li> Трансфер бластоциста через серию дополнять каплями, оставляя в третьем раскрывающемся следить за лизис трофэктодермы клеток. Соблюдайте бластоцисты в течение первых 30 секунд на сцене &quot;восходящей&quot; из трофэктодермы клетки, как они лизировать. Если лизис наблюдается в течение этого времени, держать блюдо на столике микроскопа для контроля реакции до его завершения. Если нет восходящей наблюдается в течение первых 30 секунд, вернитесь в инкубаторе, проверяя каждые 5 минут, пока большая часть трофэктодермы имеет разрушается. Это может занять 5-15 минут. Монитор реакции тесно свести к минимуму время реакции и возможность повреждения внутренней клеточной массы. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_3/574_Figure-03.png" alt="574_Figure-03" width="571" height="273" /> </li><li> Трансфер бластоциста через ряд средств массовой информации ЭСК ячейка вывода капли, чтобы смыть дополнять деятельность. </li><li> Использование стеклянной пипетки с диаметром, немного меньше, чем бластоцисты (вытащил из 10 мкл VWR капилляров), рисовать бластоцисты вверх и вниз по полосе от большинства лизировали трофэктодермы. г &quot;ALT =&quot; 574_Figure-0 &quot;ширина =&quot; 577 &quot;высота =&quot; 270 &quot;/&gt; </li><li> Пластина ICM изолировать на фидерных клеток митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs). MEFs должна быть подготовлена ​​за день до этого вывода и переключился на ЭСК ячейка вывода средств массовой информации день. 4-а Nunc блюда хорошо работать для начальных этапов вывода. </li><li> Не беспокоить пластина для первых 1-2 дней. После этого ежедневно проверять на вырост эмбриональных стволовых клеток колоний (как правило, очевидны в течение 1-2 недель). СМИ должны быть изменены в два раза объемы любой другой день, в начале 3-й день. </li></ol> ES вырост клетки и пассажи Когда результат ЭСК клетка достигла приблизительно 0,5 мм или более, он готов к расширению механические сбора. <ol><li> Механически разгона половине нарост и перехода на новые чашки, содержащие свежие фидеров. Эмбриональные стволовые клетки сгустки должна быть примерно 30-50 клетки каждый. Оставьте другой половине нарост как резервный для первого прохода (P1). Нарост (р0) можно выбрать из несколько раз, поскольку она продолжает расширяться. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_5/574_Figure-05.png" alt="574_Figure" width="639" height="219" /> </li><li> Вторичные колонии Аналогично могут быть рассеяны и расширен по большей блюда культуры до места 3-5 года, когда новые клеточные линии могут быть адаптированы к ферментативной пассажей с трипсином. Сыворотке содержание питательных сред также должны быть постепенно уменьшена до 1% и 0% в течение этих первых мест, чтобы минимизировать дифференциации ЭС клетки. </li><li> Все установленные линий эмбриональных стволовых клеток должны быть накренился путем замораживания вниз часть ранних проходы для будущего расширения. </li><li> Кроме того, каждой клеточной линии должны характеризоваться кариотип анализа и подтверждены плюрипотентности и дифференциации исследования в пробирке и в естественных условиях. </li></ol>

<ol>
	<li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts.">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Протокол, представленные здесь предоставляет исследователям краткой, простой в последующей схема того, как вывести человека линий эмбриональных стволовых клеток путем immunosurgical изоляции внутренней клеточной массы.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Quinn's Advantage Thaw Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sage</td>
<td>ART-8016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Global medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Global</td>
<td>GMGB-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmanate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Talecris</td>
<td>61325</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EmbryoMax Acidic Tyrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon/Millipore</td>
<td>MR-004-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KO-DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>10829-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KO-Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ES cell-tested fetal bovine serum, Defined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30070.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamax-I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>35050-079</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>11140-076</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15070-063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant human basic fibroblast growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13256-029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Beta-mercaptoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>21985-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit anti-human red blood cell primary antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rockland</td>
<td>109-4139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guinea-pig complement serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-1639</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouth pipettes with tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>supplied with capillary pipettes from VWR</td>
</tr>
<tr>
<td>0.2 microm Acrodisc syringe filter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pall Life Sciences</td>
<td>PN4192</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25300-120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NUNC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse embryonic fibroblasts (E12.5)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

derivation of human embryonic stem cells by immunosurgery

Способность эмбриональных стволовых клеток человека самостоятельно обновлять и дифференцироваться во все типы клеток тела показывает, что они открывают огромные перспективы для обоих медицинских приложений и в качестве инструмента исследования для решения фундаментальных вопросов в развитии и болезней. Здесь мы предлагаем краткий, шаг за шагом протокол для вывода человеческих эмбриональных стволовых клеток из эмбрионов на immunosurgical изоляции внутренней клеточной массы.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery at JoVE.com

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Вывод человеческих эмбриональных стволовых клеток на применение специфических иммунных сывороток в хирургии

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Распространение человеческих эмбриональных стволовых (ЭС) клеток

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Вывод гемопоэтических стволовых клеток мышей эмбриональных стволовых клеток

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Зондирование для митохондриального комплекса активность в эмбриональных стволовых клеток человека

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Хроматин Иммунопреципитация из человеческих эмбриональных стволовых клеток

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Культура и поддержание человеческих эмбриональных стволовых клеток

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Хромосомные Подготовка распространения человеческих эмбриональных стволовых клеток для Кариотипирование

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Замораживание и размораживание человеческих эмбриональных стволовых клеток

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Выделение и Вывод мышиных эмбриональных зародышевых клеток

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в олигодендроцитов прекурсоров

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Вывод Мышь трофобласта стволовых клеток из бластоцист

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...