Name: derivation of human embryonic stem cells by immunosurgery
Uploaded: 2007-12-13T00:28:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery at JoVE.com

AEC Tıbbi Araştırma ve Merck Araştırma Laboratuvarları Jane Tabut Childs Memorial Fonu bir adam. Biz deneysel danışma ve tartışma, D. Egli ve C. Cowan teşekkür ederim.

<html> Insan embriyonik kök (HES) hücre derivasyon için kullanılan Dondurulmuş insan embriyolarını uygun bilgilendirilmiş onam, Harvard Üniversitesi&#39;nde komitesi ve insan denekler üzerinde embriyonik kök hücre araştırmaları gözetim komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır araştırma protokol çerçevesinde aşağıdaki araştırma için bağışlandı . Aşağıda yazılı bir protokol Cowan ve arkadaşları tarafından yayınlanan parametreler üzerine dayanır. 2004, hafif değişiklikler. Embriyo Kültürü Quinn Advantage çözülme Kit ve kültürünün geliştirilmesine kadar genişletilmiş blastosist aşamasına kadar,% 15 Plasmanate ile desteklenmiş Küresel orta damla kullanarak insan embriyolarının çözülme. Iç hücre kütlesinden Immunosurgery tabanlı izolasyon Hazırlanması: <ol><li> 10cm plakaları her çözüm damla kurarak, zona pellusida ve immunosurgery kaldırılması plakaları (aşağıya bakın) hazırlayın. Buharlaşmasını önlemek için mineral yağ ile Yerleşimi. Derivasyon için tasarlanmıştır embriyo başına tek bir satır hazırlayın. <ul><li> EmbryoMax Asidik Tyrodes olduğu gibi kullanın. </li><li> embriyonik kök hücre türetme medya: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum Yedek,% 10 Plasmanate,% 2.5 ES hücre test fetal sığır serumu (FBS), 2mm Glutamax-I,% 1 non-esansiyel amino asitler, 50 adet / ml penisilin, 50μg/ml streptomisin, 0.055mM b-merkaptoetanol 5ng/ml bFGF. </li><li> Tavşan anti-insan kırmızı kan hücre birincil antikor, üretici firmanın önerisi, embriyonik kök hücre türetme medya ile 01:10 seyreltilmiş doğrultusunda sulandırılmış. </li><li> Gine domuzu tamamlayıcı serum, üretici firmanın önerisi, embriyonik kök hücre türetme medya ile 01:10 seyreltilmiş doğrultusunda sulandırılmış. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_9_18_6/574_Figure-01.png" alt="574_Figure-01" width="600" height="166" /> </li></ul></li><li> 37 ° C doku kültürü inkübatör kullanmadan önce bütün plakaları dengelenmesi. </li><li> Embriyolar transfer olarak kullanmak için 50μl 100μl kapiller pipetler (VWR) çekin. Elmas kalem ve 0.2μm filtresi ile donatılmış ağız pipet tüp kullanımı ile biter kesin. </li></ol> Immunosurgery Prosedürü: Notlar: <ul><li> Bu prosedürde, trophectoderm hücreleri, kompleman aktivitesi ile tandem insan hücrelerine karşı antikorlar yönettiği kısa maruz kalma yok. Bu nedenle blastosist sadece yapısal bütünlüğünü de immünolojik reaksiyon duyarlı olmaktan ICM engeller olarak, protokol, sağlam bir trophectoderm yüksek kaliteli embriyolar ile en iyi şekilde çalışır. </li><li> Tüm işlemler, ısıtılmış tabla ile donatılmış bir diseksiyon kapsamı kullanılarak yapılan. </li></ul> Adımlar: <ol><li> Embriyoların yapışmasını önlemek için FBS ile embriyo transferi için kullanılan ağız pipet durulayın. </li><li> Kültür çanak çanak AT embriyonik kök tutarak açılan blastokist transferi. </li><li> Embriyonik kök damla damla AT serisi ile blastokist transferi prosedürü başlayın. Üçüncü açılan zona pellusida (genellikle 5-30 saniye) kapatılması için izleyebilirsiniz. Aşırı tedavi veya embriyonun bütünlüğünü değil dikkatli olun bozulabilir. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_2/574_Figure-02.png" alt="574_Figure-02" width="551" height="273" /> </li><li> Embriyonik kök hücre türetme medya dizi transfer blastosist AT durulayın düşer. Medya ile pipet Preloading hemen tepki AT nötralize etmek için tavsiye edilir. Tüm işlenmiş AT kadar blastosist burada tutulabilir. </li><li> 37 30 dakika inkübasyon için üçüncü damla ° C doku kültürü inkübatörde bırakarak, primer antikor damla dizi blastokist transferi. </li><li> Embriyonik kök hücre türetme medya dizi transfer blastosist birincil durulayın düşer. </li><li> Trophectoderm hücrelerinin parçalanması izlemek için üçüncü bir damla bırakarak, tamamlayıcı damla dizi blastokist transferi. Lyse olarak trophectoderm hücrelerinin &quot;köpüren&quot; için sahnede ilk 30 saniye boyunca blastosist uyun. Lizis bu zaman dilimi içinde görülürse, tamamlanıncaya kadar tepki izlemek için mikroskop sahnede çanak tutmak. Ilk 30 saniye boyunca hiçbir köpüren görülürse trophectoderm çoğu parçalanmış kadar her 5 dakikada bir kontrol, inkübatör dönmek. Bu 5-15 dakika alabilir. Reaksiyon zamanı ve iç hücre kütlesi potansiyel zararı en aza indirmek için yakın reaksiyon izleyin. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_3/574_Figure-03.png" alt="574_Figure-03" width="571" height="273" /> </li><li> Transferi blastosist embriyonik kök hücre türetme medya dizi tamamlayıcı faaliyet yıkayın düşer. </li><li> Blastosist (10μl VWR kılcal tüpler çekilmiş) biraz daha küçük bir çapa sahip cam pipet kullanarak, parçalanmış trophectoderm en uzak şerit aşağı blastosist çizmek ve. g &quot;alt =&quot; 574_Figure-0 &quot;width =&quot; 577 &quot;height =&quot; 270 &quot;/&gt; </li><li> Levha ICM mitotik olarak inaktive edilmiş fare embriyo fibroblastlar (MEFS) besleyici hücreler üzerine izole. MEFS türetme bir gün önce hazırlanan ve embriyonik kök hücre türetme medya gün açık olmalıdır. 4-Nunc yemekleri türetme ilk adımlar için iyi çalışır. </li><li> İlk 1-2 gün için tabak Rahatsız etmeyin. Bundan sonra, embriyonik kök hücre kolonileri (1-2 hafta içinde genellikle belirgin) akıbet için günlük olarak kontrol edin. Medya her gün 3 gün başında yarım cilt olarak değiştirilmesi gerekir. </li></ol> ES hücre akıbet ve Pasajlanması Embriyonik kök hücre akıbet yaklaşık 0,5 mm veya daha fazla ulaştığında, mekanik seçerek genişlemesi için hazırdır. <ol><li> Mekanik akıbet yarısı dağıtmak ve taze besleyiciler içeren yeni plakalar transfer. Embriyonik kök hücre kümeleri her biri yaklaşık 30-50 hücreleri olmalıdır. Back-up ilk geçiş (p1) olarak akıbet diğer yarısı bırakın. Genişletmeye devam ediyor akıbet (p0) birkaç kez alınabilir. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_5/574_Figure-05.png" alt="574_Figure" width="639" height="219" /> </li><li> İkincil koloniler benzer dağınık ve yeni hücre hatları enzimatik tripsin ile Pasajlanması adapte edilebilir pasajlar bu süre 3-5 kadar büyük kültür yemekleri arasında açılabilir. ES hücre farklılaşması en aza indirmek için, kültür medya serum içeriği de yavaş yavaş bu ilk geçişleri sırasında% 1 ve% 0 olmalıdır. </li><li> Tüm kurulan embriyonik kök hücre hatları erken pasajların bir kısmı aşağı gelecek genişlemeler için dondurularak banked olmalıdır. </li><li> Buna ek olarak, her bir hücre hattı karyotip analizi ile karakterize edilebilir ve in vitro ve in vivo pluripotency ve farklılaşma çalışmalar tarafından doğrulandığı. </li></ol>

<ol>
	<li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts.">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada sunulan protokol ile araştırmacılar sağlar, özlü, kolay iç hücre kütlesinden immunosurgical izolasyonu insan embriyonik kök hücre hatları elde etmek için nasıl ana hatları takip edin.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Quinn's Advantage Thaw Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sage</td>
<td>ART-8016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Global medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Global</td>
<td>GMGB-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmanate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Talecris</td>
<td>61325</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EmbryoMax Acidic Tyrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon/Millipore</td>
<td>MR-004-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KO-DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>10829-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KO-Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ES cell-tested fetal bovine serum, Defined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30070.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamax-I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>35050-079</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>11140-076</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15070-063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant human basic fibroblast growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13256-029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Beta-mercaptoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>21985-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit anti-human red blood cell primary antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rockland</td>
<td>109-4139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guinea-pig complement serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-1639</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouth pipettes with tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>supplied with capillary pipettes from VWR</td>
</tr>
<tr>
<td>0.2 microm Acrodisc syringe filter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pall Life Sciences</td>
<td>PN4192</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25300-120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NUNC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse embryonic fibroblasts (E12.5)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

derivation of human embryonic stem cells by immunosurgery

Insan embriyonik kök hücrelerin kendi kendini yenilemek ve vücudun tüm hücre tipleri içine ayırt yeteneği ve geliştirme ve hastalık temel sorulara yanıt için bir araştırma aracı olarak hem tıbbi uygulamalar için çok ümit vericidir. Burada, embriyoların iç hücre kütlesinden immunosurgical izolasyonu ile insan embriyonik kök hücrelerin derivasyon için bir özlü, adım adım protokolü sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery at JoVE.com

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Bakım

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...