Name: investigation of protein recruitment to dna lesions using 405 nm laser micro-irradiation
Uploaded: 2018-03-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation at JoVE.com

وأيد هذا العمل بالعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الكندي الهندسية [اكتشاف منحة 5026 صباحا] وقبل جيل المقبل من "العلماء منحة دراسية" من "جمعية أبحاث السرطان" [21531 إلى صباحا]. ونحن نشكر لوسير جان-فرانسوا لتوفير مراقبة الجودة الممتازة للبرامج النصية "بيثون فيجي" والمشورة بشأن التحليل الإحصائي. ونشكر الدكتورة ستيفاني يازينسكي أ على الوصفة الحل إذا كان التثبيت. ونحن نشكر بول-لودوفيك اتييري للمساعدة في قياس قوة الليزر.

1-توعية قبل الخلايا
<ol><li>24 ساعة قبل التجربة الصغرى-التشعيع، البذور 40,000 الخلايا U2OS كل بئر في 1 x DMEM التي تحتوي على 10% FBS في الثقافة 8-بئر الشرائح مع قيعان ميكرومتر سميكة 170 ساترة تشبه الزجاج/البوليمر لضمان نفاذية القصوى 405 نانومتر أشعة الليزر وتصوير ممتاز مع المسح الضوئي ليزر مقلوب مجهر [كنفوكل]...

<ol>
	<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li><li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks.">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).</li><li>Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Method+for+Introducing+Double-Strand+Breaks+into+Cellular+DNA.">A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA.</a> Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).</li><li>Polo, S. E., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+damage+response+proteins+at+DNA+breaks:+a+focus+on+protein+modifications.">Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications.</a> Genes &amp; development. 25 (5), 409-433 (2011).</li><li>Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+spatiotemporal+dynamics+of+mammalian+checkpoint+regulators+induced+by+DNA+damage.">Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage.</a> Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice.">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).</li><li>Microirradiation Analysis Fiji Plugin. Available from: <a target="_blank" href="https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/">https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/</a> (2017)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Izhar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Analysis+of+Factors+Localized+to+Damaged+Chromatin+Reveals+PARP-Dependent+Recruitment+of+Transcription+Factors.">A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors.</a> Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).</li><li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).</li><li>Mar&#233;chal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRP19+Transforms+into+a+Sensor+of+RPA-ssDNA+after+DNA+Damage+and+Drives+ATR+Activation+via+a+Ubiquitin-Mediated+Circuitry.">PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry.</a> Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).</li><li>Dubois, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphorylation-and-ubiquitylation+circuitry+driving+ATR+activation+and+homologous+recombination.">A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).</li><li>Wan, L., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PSO4+Complex+Associates+with+RPA+and+Modulates+the+Activation+of+ATR.">The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).</li><li>Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+human+Psoralen+4+(hPso4)+complex+in+replication+stress+and+homologous+recombination.">The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).</li><li>Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+resection+at+DNA+double-strand+breaks+leads+to+de+novo+telomere+formation+and+enhances+gene+targeting.">Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting.</a> PLoS Genetics. 6 (5), (2010).</li><li>Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+double-strand+DNA+break+repair+by+homologous+recombination.">Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).</li><li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging.">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nature Communications. 6, 10237 (2015).</li><li>Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+endogenous+protein+tagging+for+RESOLFT+super-resolution+microscopy+of+living+human+cells.">CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells.</a> Scientific Reports. 5 (9592), (2015).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+Access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: Access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Dinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+multiple+DNA+repair+pathways+by+sub-nuclear+damage+induction+methods.">Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods.</a> Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).</li><li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells.">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).</li><li>Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Laser+Micro-irradiation+for+Examination+of+Single+and+Double+Strand+Break+Repair+in+Mammalian+Cells.">Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li><li>Mortusewicz, O., Am&#233;, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-regulated+poly(ADP-ribosyl)ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells.">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li><li>Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+a+&#947;H2AX-53BP1+interaction+in+the+DNA+damage+response.">Chemical proteomics reveals a &#947;H2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).</li><li>Soultanakis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+detection+of+8-oxoguanine+in+nuclear+and+mitochondrial+DNA+of+cultured+cells+using+a+recombinant+Fab+and+confocal+scanning+laser+microscopy.">Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).</li></ol>

استخدام الأساليب المذكورة أعلاه، يسمح الليزر 405 نانومتر الصغرى تشعيع الخلايا قبل توعية مع بيت أو بردو الجيل مترجمة من آفات الحمض النووي، بما في ذلك دسبس داخل نواة الخلايا البشرية ملتصقة. الحركية للتسريح وإعادة الإدماج في هذه دسبس مماثلة لتلك التي تم إنشاؤها مع أساليب أخرى في الخلايا حقيق?...

الخلايا تتعرض باستمرار للمصادر الداخلية والخارجية لتلف الحمض النووي التي تهدد سلامتهم الجينوم. التسريح وإعادة الإدماج هو فرقة من إشارات المسارات التي كشف، وإشارة، وإصلاح آفات الحمض النووي للحفاظ على استقرار المجين. في الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل فواصل (دسبس)، يحدث التسريح وإعادة الإدماج أساسا على اثنين من منصات التكميلية: γ-H2A.X-المسمى الكروماتين ومنطقة الحمض النووي (سدنى) واحد-الذين تقطعت بهم السبل ريسيكتيد عادة مغلفة بالملزمة ssDNA مجمع الجيش الوطني الرواندي1،2.
الأشعة فوق البنفسجية-الليزر الجزئي-تشعيع الخلايا قبل توعية مع thymidine التماثلية 5-برومو-2 ' ديوكسيوريديني (بردو) أو صبغ الحمض النووي تريهيدروتشلوريدي (بيت، هويشت 33342) إيثوكسيد بيسبينزيميدي يخلق مزيجاً آفات الحمض النووي بما في ذلك (فواصل واحد-الذين تقطعت بهم السبل SSBs) ودسبس التي تحظى التسريح وإعادة الإدماج مترجمة في كل من الكروماتين و ssDNA منصات3،4. الأعمال السابقة أظهرت أنه يمكن التمييز التوظيف عوامل الصيانة الجينوم لهذه المنصات مميزة اثنين في جهاز تسوية المنازعات استخدام الطاقة العالية من الأشعة فوق البنفسجية أشعة الليزر (335-365 نانومتر) جنبا إلى جنب مع لو2،5. مجاهر مجهزة بأجهزة الليزر هذه مكلفة كما أنها تتطلب ليزر ذات طاقة عالية ومكرسة أهداف نقل الأشعة فوق البنفسجية-أ يجعلها الآن أقل انتشارا في الأوساط الأكاديمية والمستحضرات الصيدلانية من المسح الضوئي الليزر مجاهر [كنفوكل] مع 405 نانومتر الليزر خطوط. دراسة البروتين التوظيف وتبادل في المواقع الدقيقة المشع تنتفي أيضا بتحليل الصورة اليدوية الشاقة المطلوبة لوصف السلوك الديناميكي لعوامل الصيانة الجينوم.
وهنا نعرض أن توعية قبل الخلايا مع وصمة عار الحمض النووي بردو أو بيت متبوعاً باستخدام التشعيع الصغير 405 نانومتر ليزر في مجهر [كنفوكل] مشتركة تتيح رصد ديناميات عامل صيانة الجينوم في الآفات الحمض النووي. يسمح استخدام γ-H2A.X أو مفارز الجيش الوطني الرواندي معقدة كعلامات منصة جنبا إلى جنب مع التراص z لزيادة عمق الحقل و deconvolution لتحسين القرار المجرب تميز العوامل التي يعينون محلياً إلى دسبس من تلك التي امتدت إلى المجالات الكروماتين الكبيرة المحيطة بالآفة الأولية. ويساعد هذا التصنيف الفرعي وفقا للمكونات النووية داخل متميزة صقل الأدوار المحتملة للبروتينات أونتشاراكتيريزيد المعينين للمواقع الدقيقة المشع. وعلاوة على ذلك، نحن نقدم البروتوكولات مريحة والأمثل خطوط الأنابيب لسرعة تحليل ديناميات عوامل الصيانة الجينوم باستخدام برمجيات المصدر المفتوح فيجي (توزيع إيماجيج)6،،من78. هذه التحسينات على أساليب الصغرى-التشعيع الحالية تقديم الدراسة للتسريح وإعادة الإدماج الممكنة في تقريبا أي إعداد مختبر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">FluoView FV3000 software (version 2.1)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">405 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Radiation source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>OKO-UNO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">60X /1.4 Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">8-well culture slides on coverglass (X-well)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">U2OS osteosarcoma human cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td>Stable cell lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Caution toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">5-bromo-2&#8242;-deoxyuridine&#160;(BrdU)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59-14-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Caution toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Trypsin EDTA 0.1%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX777.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">JetPRIME transfection reagent&#160;</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">DMEM 1X, + phenol red</td>
			<td>Wisent&#160;</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">DMEM 1X, - phenol red</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-051-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent&#160;</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Mouse anti-RPA32 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2175</td>
			<td>1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Rabbit anti-&#947;-H2A.X antibody</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>9718S</td>
			<td>1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Rabbit Anti-53BP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>4937S</td>
			<td>1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Rabbit Anti-PRP19 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27692</td>
			<td>1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>4414S</td>
			<td>1:250 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Goat anti-mouse&#160; IgG Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>4408S</td>
			<td>1:250 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Fiji image analysis open-source software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">1918-K Power meter&#160; with a 918D-SL-0D3 sensor</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of protein recruitment to dna lesions using 405 nm laser micro-irradiation

استجابة تلف الحمض النووي (DDR) يستخدم عدد كبير بروتينات لكشف والإشارات، وإصلاح الحمض النووي آفات. تحديد هذه الاستجابة أمر بالغ الأهمية لفهم آليات صيانة الجينوم. دراستهم منذ التعيين والصرف من البروتينات في الآفات ديناميكية للغاية، يتطلب القدرة على توليد ضرر الحمض النووي على نحو سريع ومحدد مكانياً. هنا، نحن تصف إجراءات لحمل محلياً تلف الحمض النووي في الخلايا البشرية باستخدام متاحة عموما المسح الضوئي ليزر [كنفوكل] مجهر مجهزة بخط ليزر 405 نانومتر. تراكم الصيانة الجينوم يمكن تقييم العوامل في المشارب الليزر الفلورة (إذا كان) أو في الوقت الحقيقي باستخدام البروتينات معلم مع الصحفيين الفلورسنت. استخدام هيستون فوسفوريلاتيد H2A. X (γ-H2A.X) والنسخ المتماثل البروتين A (الجيش الوطني الرواندي) كعلامات، الأسلوب يوفر القرار كافية تميز العوامل المعينين محلياً من تلك التي انتشرت في الكروماتين المجاورة. كذلك نقدم البرامج النصية المستندة إلى إيماجيج لرصد كفاءة الحركية من البروتين ريلوكاليزيشن في الحمض النووي تلف المواقع. تبسط هذه التحسينات إلى حد كبير دراسة ديناميات التسريح وإعادة الإدماج.

عقب الصغرى-التشعيع، والخلايا يسمح لاسترداد لفترة محددة من الزمن تبعاً لطبيعة الجينوم صيانة البروتينات1،12. ستتم معالجة دسبس نوكليسيس، الأكثر على نطاق واسع خلال مراحل دورة الخلية، لإنشاء منطقة محدودة من سدنى التي هي مغلفة بسرعة بالجيش الو?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation at JoVE.com

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

دراسة حركية إصلاح تلف الحمض النووي يتطلب نظاما للحث على الآفات في المناطق شبه نووية محددة. يصف لنا طريقة لإنشاء فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل المترجمة استخدام مجهر [كنفوكل] المسح الضوئي الليزر مزودة بليزر 405 نانومتر وتوفير إجراءات التشغيل الآلي التحديد الكمي للقوى المحركة لعوامل الإصلاح في هذه الآفات.

التحقيق في تجنيد البروتين للحمض النووي آفات استخدام الليزر 405 نانومتر الصغرى-التشعيع

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Research

JoVE Journal

Genetics

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

التحقيق استنادا التدخل-RNA من وظيفة من حرارة صدمة بروتين 27 خلال شفاء القرنية طلائي الجرح

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

أدوات لدراسة دور HMGB1 البروتين المعماري في تجهيز اللولب تشويه، والحمض النووي الخاصة بالموقع Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

بروتوكولات ل C-بريك دنا الجمعية القياسية باستخدام Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي مع تشيك-سيق في<em&gt; ساكاروميسز سيريفيسياي</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

ميكرويرادييشن الليزر لدراسة في فيفو الاستجابات الخلوية لأضرار بسيطة ومعقدة الحمض النووي

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

التحقيق في توليف الحمض النووي الريبي استخدام الوسم 5-بروموريديني وإيمونوبريسيبيتيشن

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

مقايسة بسيطة وسريعة، والكمية لقياس إصلاح الحمض النووي-البروتين كروسلينكس على البلازميدات Transfected في خلايا الثدييات

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

تحليلات البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي باستخدام قاعدة البيانات أوبينبروت لكشف النقاب عن البروتينات رواية مترجمة من إطارات القراءة المفتوحة غير متعارف عليه

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

في المختبر الاختبارات البيوكيميائية باستخدام تسميات البيوتين لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...